摘要

通过聚合酶链反应变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)分析和DNA测序，比较了不同污水处理系统处理城市污水时的细菌群落。本研究比较了台式、中试和全尺寸膜生物反应器(MBRs)、常规活性污泥(CAS)和滴滤固相接触(TF/SC)系统的微生物群落结构。采用GelCompar II聚类分析对DGGE指纹图谱进行群落相似性分析。处理同一废水的试验台和中试规模mbr在所有站点中相似性最高(73%)。全尺寸MBR处理类似废水的样品与试验台和中试规模MBR的相似度较低，但仍相当高(44%)。CAS系统中细菌种群间的相似性(64%)高于TF/SC系统(43%)。MBR组与CAS + TF/ SC组相似性显著低于5%，表明MBR的优势种与其他形式的活性污泥处理有很大的不同。73%切除的DGGE条带通过DNA测序成功识别，发现四种细菌存在于一个以上的生物废水处理系统中:细菌克隆SB3-6，未培养的Clostridium sp.，结果表明，由于操作条件和内部水动力机制的不同，在试验台和中试mbr中发现的微生物群落结构可能不是研究全尺寸mbr性能的良好模型。

关键词

废水处理;微生物群落;PCR-DGGE;DNA测序

介绍

近年来，膜生物反应器(mbr)越来越受欢迎，因为它能够保持高混合液悬浮固体(MLSS)浓度，更长的固体保留时间(SRT)，改善处理性能，并提供高度的操作灵活性[1,2]。mbr能够在一个小脚印[3]中产生类似于二级澄清和出水微过滤组合所获得的出水质量。然而，mbr面临着独特的挑战，限制了其广泛的应用，特别是由于膜生物污染导致的工厂维护和运行成本。控制生物污垢的一种方法可能涉及物理、化学或生物手段，用于控制已知引起污垢的特定细菌种类。为了做到这一点，需要识别细菌，然后广泛研究其栖息地特征，以确定控制策略。同样重要的是，确定在将试验台或中试规模的系统扩大到全尺寸系统期间，细菌群落是否受到影响，这样在较小规模开发/测试的控制策略也将适用于全尺寸系统。同样重要的是找出mbr中的生物是否不同于其他类型的生物处理过程，如传统的活性污泥(CAS)和滴流过滤系统。大多数关于mbr中生物过程的已知或假设主要来自对CAS系统的调查，而不考虑这两种处理过程在操作/环境条件方面存在显著差异的事实。Le-Clech et al. [4]， Li et al. [5]， Wu和Huang[6]等学者报道了MLSS特性对膜污染的影响。微生物群落结构与膜生物污染之间的联系也有报道[7-9]。 A shift in microbial community composition occurs with changed operating conditions and shift can lead to loss of ecosystem functions (nitrification, denitrification and biological phosphorus removal) [10].

Wan et al.[11]在一项研究中使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析了群落结构，并报道了中试规模的mbr与CAS处理过程中的细菌群落不同。Miura et al.[12]利用聚合酶链反应(PCR)-DGGE和荧光原位杂交(FISH)技术分析了细菌群落结构，并报道了进水废水组成对细菌群落结构有很大的影响。Stamper et al.[13]还揭示了细菌群落结构的变化对进水废物特性的响应。

直到最近，Wan et al.[11]还没有对城市污水处理MBR系统进行过分子微生物多样性调查。结果表明，mbr中的细菌群落与并行运行的CAS生物反应器中的细菌群落不断不同，反映了两种处理系统的环境和运行条件的对比。然而，在平行运行工作台、中试mbr和全规模滴滤/固体接触(TF/SC)工艺处理城市污水中比较细菌种类(存在和丰度)的研究并不多。许多研究者[14,15]报道了DGGE谱图中相同位置的条带可能来自不同的细菌来源，不同的条带也可能来自同一细菌来源[16,17]。此外，DGGE谱带显示了细菌群落结构随时间的变化。尽管有这些局限性，DGGE已被公认为一种快速的细菌群落分析方法。在此，利用PCR-DGGE技术枚举细菌群落，比较了mbr与CAS和TF/SC处理城市污水的微生物群落结构。

材料和方法

抽样

在6个月的时间内，每半年从4个不同的污水处理厂（WWTP）收集约1升混合液样品（曝气池污水污泥）。样品在高压灭菌塑料瓶中收集，收集后立即在冰中保存，并运至实验室，冷藏直至分析。所有样品在夏威夷大学水资源研究中心实验室进行了分析。这四个WWTPS（HououLuli，Wahiawa，东火奴鲁鲁和Schofield Barracks）接收不同质量的废液，因为盐度和群落大小/特征（包括住宅、工业和商业尺寸）变化。Honouliuli污水处理厂是夏威夷州设计流量第二大污水处理厂，位于瓦胡岛西部。该污水处理厂每天平均接收2600万加仑中等盐度（总溶解固体（TDS）795 mg/l）废水，主要为住宅性质，并使用TF/SC进行生物处理。试验台和中试规模的MBR位于Honouliuli污水处理厂，与TF/SC接收的相同废水平行运行。本研究中包括的其他污水处理厂包括使用CAS处理高盐度（TDS 4400 mg/l）生活污水的东檀香山污水处理厂，容量为4.5 MGD的瓦希瓦污水处理厂，使用CAS处理低盐度（TDS 218 mg/l）生活污水，以及处理低盐度（TDS~254 mg/l）的Schofield兵营污水处理厂，容量为4.2 MGD使用中空纤维型MBR的混合住宅/工业废水。

DNA提取与PCR扩增

使用快速DNA旋转试剂盒（MP Biomedical，美国俄亥俄州梭伦市）直接从混合液中纯化总基因组DNA，然后通过PCR扩增成片段。使用16S rRNA的v3区域作为模板，使用Lane[18]报道的正向引物338f（5'-ACT-CCT-ACG-GGA-GGC-AGCAG-3'）和反向引物518r（5'-ATT-ACCGCG-GCT-GG-3'））根据Muyzer等人[14]和Øvreås等人[19]的建议，将50µl PCR混合物用作PCR扩增的通用引物。50µl PCR混合物包含：每个引物2.5µl，10µl 10 mM PCR核苷酸混合物，10µl 5x无色Go Taq Flexi反应缓冲液，5µl 25 mM MgCl₂溶液、0.25µl 5 u/µl Go-Taq DNA聚合酶、2µl BSA、26µl无核酸酶水和0.75µl提取的DNA。PCR扩增在一个iCycler（美国加利福尼亚州大力士Bio-Rad实验室）中进行。16srrna基因扩增在94℃下5分钟发生初始变性；35个变性周期（94°C下45秒）、退火周期（55°C下45秒）和延伸周期（72°C下45秒）以及最终延伸周期（72°C下10分钟）。PCR扩增的DNA样本在1.5%琼脂糖中用2µl等份PCR产物进行水平电泳检测，如所述[14]。

DGGE和DNA测序分析

PCR扩增后，DNA样品在1 × TAE缓冲液(20 mM Tris, 10 mM醋酸盐，0.5 mM EDTA, pH = 7.4)中加载到8% wt/ vol聚丙烯酰胺凝胶(37.5:1，丙烯酰胺/双丙烯酰胺)中。在Bio-Rad D Code系统(BioRad, Hercules, CA)中，凝胶在60°C、130V下运行210分钟。然后用溴化乙啶(1.0 mg/l)染色10分钟，用1 × TAE缓冲液冲洗10分钟，用紫外反式照明器(Bio-Rad gel Doc 2000, Bio-Rad, Hercules, CA)观察。然后手工从凝胶中提取特定的DGGE条带进行DNA测序。测序方法见Huang等人[20]。几种方法被用于改善获得的低DNA测序结果(最初鉴定不到67%)。有报道称，甜菜碱通过减少富gc区[21]引起的二级结构的形成，提高了基因的扩增能力。测序前DNA样品中添加5m甜菜碱使结果提高了4%。退火温度从50°C提高到60°C，延伸温度从60°C提高到80°C，没有产生顺序结果。然而,序列结果增加了3%,增加温度从50°C到58°C和扩展温度从60°C到70°C期间根据引物测序P518r (GC含量64.7%)(Tm = 4°C x (G和C的底漆)+ 2°C x(数量和T的底漆))。在测序过程中，同时使用5m甜菜碱，并将退火温度提高到58°C，延伸温度提高到70°C，结果提高了6%。 Although sequencing conditions improved, 27% of DNA sequencing results remained unidentifiable.

聚类和序列分析

经过DGGE研究，从每个污水处理系统中选择4个具有代表性的样品进行对比分析。GelCompar II聚类分析用于比较来自不同WWTPs的细菌群落的结构和相似性(Applied Maths, Austin, TX, USA)。全局相似度是通过合并字符或使用皮尔逊相关非加权对分组(UPGMA)平均实验相关相似度来计算的。值得注意的是，DGGE被认为是最适合鉴定主要群体而不是次要群体，但可能非常重要，在一个不同的细菌群落。从DGGE凝胶中提取DGGE条带，然后进行DNA测序，并使用NCBI在线基因库进行评估，以鉴定细菌个体种类。

结果和讨论

在群落多样性分析中，假设每个带对应一个独特的物种，带密度对应物种丰度。在细菌群落多样性研究中，每个条带都被认为来自一个细菌来源。此外，每个DGGE图谱可以显示一个或多个不同样本的特定优势种。不同操作条件下所观察样品的特定优势种存在差异，认为是由于微生物群落所处的操作/环境环境不同导致生理生长条件的不同。

试验台规模、中试规模和全规模MBR

下图1（1a：左部分和1b：右部分）分别显示了台架规模、中试规模和全规模MBR样品以及东檀香山CAS、瓦希瓦CAS和檀香山TF/SC工艺之间的DGGE分析比较。

如图1所示，实验室规模MBR中细菌群落的DGGE指纹图包含10条重复出现的条带；其中5条为永久性细菌物种（亮条带代表一种主要微生物物种，并在6个月的研究期内持续出现）。在这五个物种中，B2带被鉴定为未培养的细菌克隆Pia-s-66，在带亮度方面显示出相对较大的优势（表1）。10个物种中有9个通过测序鉴定，包括未培养的副球菌克隆3-3（B7带）在Honouliuli的全规模Schofield MBR和TF/SC工艺的样品中也发现了未培养的副球菌克隆3-3。来自同一制造商并处理相同废物流的实验室规模MBR和中试规模MBR之间的结果存在显著差异，9种主要物种中有6种被鉴定。只有带P2被鉴定为未培养EubacteriumcloneF10.18 16S在整个跟踪期间表现出稳定性，仅代表中试系统中的一种永久性细菌。

图1:PCR扩增的16S rRNA片段的DGGE指纹图谱，该片段从台架、中试和全尺寸（Schofield）MBR的混合液样品中提取；来自东檀香山、瓦希瓦和檀香山TF/SC。

在反应堆的初始设置中，黄杆菌sp. AKB-2008-JO36 (P3波段)丰度最大(显示最亮波段质量)，但随着系统再适应的发生而逐渐减弱。在6个月的跟踪过程中，Schofield的全规模MBR(来自试验台和中试废水的不同)和Honouliuli的TF/SC(来自试验台和中试废水的相同)的细菌群落的PCR-DGGE条带模式都非常稳定。Schofield MBR的DGGE指纹图谱在所有样品中均有16条出现，其中13条经测序鉴定。在Honouliuli的TF/SC工厂的所有样品中也有16个波段，所有16个都被识别出来(图1a，底部部分)。随着时间的推移，CAS植物的稳定性有所下降，高盐度的东檀香山植物的细菌形成稳定性较差。在Honouliuli (TF/SC)污水处理厂的样品中也发现了四种细菌(表1)。

mbr的16S rRNA指纹图谱以有限的条带为主，而CAS指纹图谱显示复杂的条带，表明细菌群落多样性。在火奴鲁鲁东部CAS样本中，有15个可检测的条带，其中10个通过测序成功确定(图1b)。同样，在Wahiawa CAS样品中有14个可检测的条带，但其中只有7个被鉴定为与系统发育最接近。所有样本之间具有较高的相似性，说明生物系统胁迫源相对恒定。各生物反应器各条带的带型和亮度不同，显示出不同的细菌群落和不同的优势菌种。

斯科菲尔德军营的全尺寸MBR样品比基准和试点规模的样品有更多的波段。此外，台架和中试规模的MBR系统具有更大的连续性，出现的频带。聚类分析(图2)显示，小规模MBR和中试规模MBR具有72%的相似性，在所有测试的样本站点中相似性最高。然而，研究结果表明，小规模mbr与试点mbr的优势群体并不相同。这些系统使用相同的污泥播种，使用相同的膜(相同的制造商、孔径和结构)，并以相同的SRT并排处理相同的废水。然而，试验台尺度单元的物理尺寸不同，导致了不同的流体动力学(较大的水力停留时间、不同的回收率和不同的曝气/混合制度)，表明这些参数在选择微生物种群方面的作用。Schofield全尺寸MBR样品与标准和中试MBR样品相似度较低(44%)。这可以部分解释为Schofield全规模MBR(低盐度，混合住宅/工业)和试验台和中试规模MBR(中盐度，住宅)处理的不同废水流，以及与小型机组相比的不同反应器内部配置和操作。对East Honolulu CAS、Wahiawa CAS和Honouliuli TF/SC的pcr扩增16S rRNA片段的DGGE分析显示，样品之间存在显著差异(图2)。

表1：测序结果显示Genbank登录号、最接近的系统亲缘关系和%序列相似度

聚类分析表明，East Honolulu CAS和Wahiawa CAS具有64%的相似度，而Honouliuli TF/SC样品与CAS设施样品的相似度较低(43%)。图2还显示CAS和TF/SC组与MBR组的相似性处于显著的低水平(小于5%)。虽然Honouliuli的试验、中试和TF/SC都处理了相同的废水，但优势微生物群落存在着主要的不同。这两种环境可能是由于膜对生物质的完全排斥和mbr中使用的操作条件(如污泥龄、F/M比)的对比。显然，mbr选择的优势菌群不同于CAS和TF/SC系统。

一般来说，操作条件和环境条件都应影响细菌群落组成和哪些生物占优势。在夏威夷，无论是在时间上还是在特殊的基础上，废水温度基本上没有变化，所以它不被认为是一个选择压力。城市污水的组成复杂，随着时间的推移变化很大，因此微生物群落必须是多样化的，并能适应环境条件，以确保一致的处理结果。MBR系统的SRTs较长(CAS和TF/SC的SRTs约为30天，而CAS和TF/SC的则为10-15天)，MLSS较高(CAS和TF/SC的MLSS约为10,000 mg/L，而CAS和TF/SC的MLSS约为2000 mg/L，而TF/SC的MLSS为3,500)，这导致了较低的F/M，允许生物量的内源性衰变和更难以降解的DOM的形成。较大粒径的部分被膜保留在曝气池中。可溶性微生物产物(SMP)和细胞外多聚物(EPS)的形成和保留也可能有利于在MBR食物网中清除这些产物的不同生物的生长。更短的水力停留时间，更大的剪切力(使用粗气泡曝气时更大的曝气速率)，以及膜对所有生物量的保留导致了不同的选择压力，如Wan等人[11]所描述的。这说明mbr系统与CAS系统相比，生物量的生理状态是不同的。TF/SC混合液只暴露于TF生物塔脱落的残余有机物，因此它也在低F/M条件下运行(可能比mbr更低)，然而，环境条件与CAS比mbr更相似。

影响废水特点可以占微生物多样性变化,肯定起到了一些作用在CAS系统之间的差异观察Wahiawa 53英尺CAS(低盐度)和东部火奴鲁鲁CAS(盐碱地),因为这两个系统对居住区类型城市污水具有类似有机和营养成分。Honouliuli TF/SC的废水被认为是中等盐度，主要是居住城市废水。然而，它是一个更大的区域植物，有一个大的收集面积，这样的进水是老化的(化粪池)，这可能是群落多样性的一些差异的原因。然而，提出的主要因素是TF/SC和CAS之间的操作/环境条件的差异，TF/SC混合液只暴露于TF生物塔脱落的残余有机物。

DNA测序还显示，在多个污水处理系统中发现了四种细菌:(a)未培养的Paracoccus sp. 3-3克隆存在于实验室和Schofield全尺寸mbr中，以及Honouliuli TF/SC中。(b)未培养的细菌SB3-6在中试规模的MBR和Honouliuli TF/SC中发现，(c)未培养的Clostridium sp.在East Honolulu CAS和Honouliuli TF/SC中发现。(d)在Wahiawa CAS和Honouliuli TF/SC中发现了未培养的克雷伯氏菌。这些细菌是肠杆菌科的革兰氏阴性兼性成员，在自然界中随处可见。这四种生物不一定在这些系统中发挥主导作用，但它们在多个设施中被识别的事实可能表明它们在基质偏好/可用性以及可能的生理竞争优势方面的共同性质。

图2:比较从East Honolulu CAS, Wahiawa CAS, Honouliuli TF/SC, Honouliuli的标准和中试规模MBR, Schofield scale MBR中获得的细菌群落，GelCompar II分析。基于曲线的:皮尔逊相关;方法:Unweighted pair-grouping (UPGMA)。

结论

73%的DGGE条带被成功地测序到最接近的系统发育亲缘关系，在多个污水处理厂的混合液中发现了几个相同的细菌物种。DGGE谱带聚类分析表明，处理同一废水的中试mbr与标准mbr的相似度为72%，而标准mbr与小规模mbr的相似度为44%。东檀香山CAS和Wahiawa 53英尺中科院植物文化显示,64%相似(residentialonly城市垃圾但不同盐度),尽管有相似性较低(43%)之间的卡斯和Honouliuli TF / SC,被认为是由于不同的废物特征和操作/环境体系)。MBR组和非MBR组之间的相似性是显著的低水平(小于5%)，这是由于非常不同的操作机制，即使处理具有相同或相似特性的废水，也会导致培养菌的生理状态不同。由于试验台、中试和全面mbr、CAS和TF/SC过程中的微生物种群似乎不同，因此必须谨慎地将从试验台和中试研究收集的数据外推到全面mbr的预期效果。由于大多数研究都集中在mbr的性能和膜污染上，而没有考虑到所涉及的细菌群落，因此需要进行更多的研究来探索操作条件对mbr中微生物群落多样性和丰度的影响。

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文章信息

Aritcle类型:研究文章

引用：(2015)膜生物反应器和其他处理系统中细菌群落的分析与比较。国际污水处理2(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2381-5299.112

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出版的历史:

收到日期：2015年9月23日

接受日期：2015年11月17日

出版日期：2015年11月23日