病毒学和新兴疾病 - SCI Forschen德赢娱乐国际

全文

研究文章
与登革蛋白酶NS2B/NS3结合的脂肪酸和多肽的结构分析和分子建模研究

NHV KutumbaraoD Velmurugan＊

中国科学院晶体学和生物物理学研究所，马德拉斯大学，金奈，印度

*通讯作者:D Velmurugan, UGC-BSR学院，中科院晶体学和生物物理学，马德拉斯大学，金奈，印度，电话:9841075847;电子邮件:shirai2011@gmail.com


摘要

登革热是威胁生命的疾病之一。非结构蛋白3 (non-structural prote3, NS3)是多蛋白加工所必需的病毒蛋白酶，需要NS2B辅因子的~40残基亲水结构域的存在才能达到最佳的催化活性。NS2B/NS3活性蛋白酶复合物属于类胰蛋白酶。针对蛋白酶肽药物的设计是一种被广泛接受的对抗该病毒的策略。NS2B的构象在蛋白酶的活性和底物的结合中起着重要的作用。我们尝试通过多种途径设计抗NS2B/NS3的肽段。配体从不同来源中选择，从食用鱼类中分离的多肽到从木瓜叶中分离的天然化合物。研究了不同构象的蛋白酶配体的结合方式。

关键字

DENV;诱导契合对接;滑翔;OPLS力场

缩写

DENV:登革热病毒;世卫组织:世界卫生组织;OPLS:液体模拟的优化电位。

介绍

登革热病毒（DENV）属于黄病毒．存在4种抗基因相关血清型，分别为DEN-1、DEN-2、DEN-3、DEN-4。这种病毒是通过埃及甜菊(伊)。所有这四种血清型都是引起出血热[1]的原因。世界卫生组织将登革热列为最重要的蚊媒热带疾病。登革热感染的症状各不相同，从流感样疾病(登革热)到登革热休克综合征，在最严重的情况下是最严重的登革热出血热(伴有出血异常的严重登革热)。登革出血疾病是危及生命的疾病。

登革热病毒基因组是一种单链阳性感测RNA [2,3]，由10,723个核苷酸组成，它们编码单个聚丙烯前体，其构成两类蛋白质，结构和非结构蛋白。在RNA基因组周围有三种结构蛋白质（C，PRM和E）和脂质双层[4]，其中蛋白C（核心核壳蛋白）直接与RNA结合，蛋白质E（主要包络蛋白）和蛋白质m（膜蛋白）两者都形成蛋白质外壳[5]。存在七种非结构蛋白（NS），即NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5。聚蛋白前体经历切割（共同和翻译）以产生成熟蛋白质。负责此活动的NS3使病毒激活并有助于进一步复制。NS3在非结构蛋白区的区域为NS2A / NS2B，NS2A / NS2B，NS2B / NS3，NS3 / NS3 / NS4A和NS4B / NS5 [6-10]。

蛋白酶活性在病毒存活和复制中的重要性，以及蛋白酶抑制剂在许多情况下通常被视为一种潜在药物的概念[11-13]促使研究界设计活性抑制剂来应对登革热感染。在全长618个残基长度的多结构域NS3的n端存在180个氨基酸的蛋白酶结构域NS3片段[14- 20]。NS2B(辅因子)是激活NS3蛋白酶[16]所必需的。NS2B的结合可能会启动活性催化三联体的结构安排，以获得最佳蛋白酶活性[21,22]。该蛋白酶对底物结合具有特异性，已被许多工作者证实。Niyomrattanakit的研究结果表明，P1和P2位点是双碱性残基，P3和P4位点是碱性或脂肪族残基，P1 '位点是较小的或极性残基[23]。NS3的最小长度决定了蛋白酶的活性。NS2B的47个残基长度被确定为蛋白酶活性的关键。连接NS2B和NS3的甘氨酸连接子具有可溶性和酶活性[19,24]。蛋白酶序列在血清型内具有高度的序列相似性，活性位点残基在所有血清型中都是保守的。 The sequence alignment of the different protease structures solved from two different serotypes has been represented in the figure 1 [25]. The high similarity between the sequences is evident. This can be observed even in the case when compared with west Nile virus protease also. The DEN2 and DEN3 serotypes proteases can be observed as highly conserved, especially around the active site residues, whose color is in red. The NS2B region too has the similarity between the stereotypes which allows us to model the missing segment of one protease serotype from the other.

图1:蛋白酶NS3和NS2B的序列比较

NS2B/NS3蛋白酶是一种典型的丝氨酸蛋白酶，第一个NS2B/NS3晶体结构从DEN2菌株中以1.5 Å分辨率解析(PDBID:这是一个β - barrel构象，类似于胰凝乳酶，其活性位点由组氨酸(HIS)、天冬氨酸(ASP)和丝氨酸(SER)三个主要残基组成，被称为催化三联体。该结构在NS2B的环路区域有一个缺口。随后的许多结构都有缺失环，其中DEN2 (PDBID: 4M9T)[27]中有一个已报道的变构位点的结构有环迹，NS2B的方向与2FOM结构相似。但解决方案结构(PDBID: 2 m9p)最近存入PDB抑制剂结合的活性部位和NS2B地区显示了主要构象变化类似于构象的蛋白酶(PDBID: 3 u1i)解决DEN3 [28], 2 fom结构最早是解决结构最近的报道不活跃的构象。将该构像中NS2B片段的定位与A125C的突变结构4M9T的定位进行了比较，据报道该结构有助于蛋白酶变构区域(ALA 125)的识别。循环的运动被认为具有影响作用。loop120(117-122)和loop150(153−164)[27]的构像至关重要，并影响NS2B片段的取向。回路相对于NS2B方向的不同位置以及配体的位置如图2所示。 The movement of these loops is indeed linked to the binding mode of the ligand. This can be seen from the binding of different ligands shown in figure 2. The RMSD (Root Mean Square deviation) and orientations of superimposed structure 2FOM with 3U1I is 0.6 Å (127 atom pairs included) where as there is a deviation of 1.03 Å with 2M9P (only 80 atom pairs included). The RMSD between 3U1I and 2M9P is 1.18 Å (88 atom pairs included). There is a conformational similarity between 3U1I (DEN3) and the protease from West Nile virus, 2FP7 [26]. The positioning of the loop 120 is further deviated in the recent solution structure and the NS2B also. This can be inferred as the effect brought by different binding modes of the ligands. The various superimpositions of the structures are presented in figure 2. As the conformation adopted by the protease in 2FOM structure is inactive [29], many workers have used the subsequent structure such as 3U1I from DEN3 for modeling studies. Molecular docking and simulation studies were undertaken to understand the different binding modes of the ligands and the effect of placement of the loops for the ligand binding. The previous modeling studies were carried out using 2FOM as the target and we have analyzed the recent structures deposited and carried out the modeling analysis which lead to the binding mode of the few peptides similar to the binding mode of ligand seen in the 2M9P solution structure. The structure used for modeling from NMR (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) studies is the one with the least energy.

图2:叠加的2FOM，4M9T，2M9P，2FP7，3U1I的结构

材料和方法

蛋白质从蛋白质数据库（PDB）下载。肽用PyMOL建模。番木瓜叶天然产物的三维结构从公共化学数据库（Pubchem）下载。合成化合物的三维结构是通过晶体学研究获得的。必须优化配体的结构，以纠正空间碰撞，并计算最小势能。因此，在对接之前，使用OPLS 2005力场将所有配体最小化（液体模拟的优化电位）在Schrödinger 2009的碰撞模块中。在最小化过程中，配体首先在碰撞最小化模块中进行1000个迭代循环的最陡下降。这是一个主要步骤，可以适当处理具有空间碰撞效应的初始配体几何体。然后是共轭梯度5000次循环，使结构在能量和梯度方面具有良好的收敛性。选择该循环的输出用于对接[30]。使用蛋白质制备向导将蛋白质最小化，其中调整H原子的添加和键顺序，并使用OPLS2005力场实现进一步的能量最小化。分子对接有助于确定与蛋白质结合的配体的能量和几何有利结合姿势。在不同类型的doc中king，诱导适配对接具有更多优势。这种对接方法有助于将配体和蛋白质视为柔性。诱导适配（Glide XP）具有灵活对接选项的模块用于配体与蛋白质的对接。通过指定活性位点残基（在本例中为催化三联体残基）为对接位点指定网格。为要执行的计算指定沿每个边缘20Å的网格。分析并分析生成的输出文件分子模拟研究考虑了最佳姿势。分子动力学模拟使用琥珀12（能量优化辅助模型构建）[31]。分子动力学模拟有助于分析配体在时间尺度上的动态相互作用和行为。这也有助于我们了解蛋白质-配体复合物的稳定性。琥珀色FF99SB力场用于蛋白质分子的参数化。TIP3P水盒用于复合物的溶剂化和使用Na进行电荷中和+和Cl-离子。首先最小化与水分子的总复合物，然后进行平衡，直至系统达到稳定的温度和压力。

结果和讨论
木瓜叶中的化合物和合成化合物

从不同植物中提取的提取物具有药用价值。从植物中提取的化合物和次生代谢产物已被证明具有抗菌活性，并取得了许多成功的案例。在印度最近爆发的登革热中，有报告说，许多医疗从业人员使用木瓜叶提取物治疗登革热，也看到了成功治疗的病例。据报道，木瓜叶提取物具有抗登革热活性[32]。在此基础上，采用气相色谱-质谱联用技术对木瓜叶提取物进行分析，发现其主要成分为油酸、硬脂酸和棕榈酸三种次生代谢物。随后我们对这三个化合物对NS2B/NS3蛋白酶进行了分子建模研究，以2M9P为靶点与2FOM相比，与活性位点残基的相互作用和滑翔评分较高，且与活性位点残基的相互作用良好。给出了对接得分、滑翔能量和相互作用图。三种化合物均与催化残基有相互作用，有一个氢键相互作用，也有一些非键相互作用。油酸和棕榈酸的催化位点的结合区域是相似的，但硬脂酸的结合区域是不同的。得分、能量和相互作用的信息见表1，结合位点见图3a和图3b。 The ligands oleic acid and palmatic acid were bound in a similar binding mode as in the co-crystal structure, where as the stearic acid has a different binding. The binding orientation of the two ligands which were similar to the co-crystal is represented in figure 3c. The ligand is shown in stick and the protein residues are shown in line format, with the active site residues highlighted in cyan colour. The compounds showed an improved score and energy in the binding with the protein in the modeled NMR structure, where the full structure is modeled with NS2B fragments.

图3a：油酸、硬脂酸和棕榈酸的相互作用

图3b：油酸(绿色)、硬脂酸(粉色)和棕榈酸(紫色)的结合方式

图3C：油酸和棕榈酸的结合取向

由我们的合作者合成的化合物和报道的[33]也以3U1I为模板进行建模。这些化合物也显示出更好的结合，他们也受到了动态模拟。分析结果表明，化合物在运动轨迹中相互结合，相互作用较好。

肽作为抑制剂

与合成化合物相比，用肽作为有利的药物已经引起了广泛的兴趣，因为它们毒性小，副作用小。基于活性位点结构或基于底物的多肽设计已经有了许多努力。近年来，许多肽前导物作为登革热蛋白酶[34]的有效抑制剂已被报道。这些肽段也经过末端修饰以吸收官能团的影响。从我们之前的建模研究中，我们报道了从食用鱼中分离的多肽SHMG, GHMS，并设计了具有良好能量结合和评分[35]的多肽。结果良好的多肽与2M9P对接，以观察相互作用是否发生了任何变化。结果发现，随着分数和能量值的提高，肽与目标物的结合更好。对接得分和能量值被制成表格(表2)，其中的交互作用如图4所示。在溶液结构中，大多数肽的结合位点与共晶体配体的结合位点相似。通过对能量的影响和对接分数的增加，其他多肽的结合不仅在NS3的活性位点，还可以看到它们与NS2B残基的相互作用。 These possess hydrogen mediated interactions with SER and HIS and maintain non-bonded interactions with the other active site residues. The presence of proline and glycine in the peptide as reported in the previous modeling papers show an affinity with additional interactions. The orientation of the reverse peptides makes these to interact with both the chains. In view of the peculiar nature of its sequence and its availability in nature (these peptides are isolated from edible fishes), the reverse peptides were subjected to simulation studies. The target bound peptides were subjected to molecular dynamic simulation for 30 ns and showed a consistent binding throughout the trajectory time (data not shown). The position of the peptides and their superimposed information of the individual peptides with the 2M9P are given in the figures 5,6. It can be observed that the binding pocket of the peptides, GHMS and SMHG are similar to that of the co-crystal. The binding of the ligand with the Histidine and Serine amino acids can be found in both the peptides as seen in the co-crystal. The GHMS has a similar orientation in the pocket as in the case of cocrystal. Figures 6a and 6b show the binding orientations of the peptides and co-crystal ligand in the pocket respectively. The active site residues are represented in the cyan colour, the ligands are represented in stick model with the protein residues been projected as line with three letter indicator with residue name and number (table 3).

图4:不同多肽与2M9P(紫色)叠加的结合模式

图5：逆肽(SMHG和GHMS)的相互作用

图6:SMHG和GHMS的结合取向

图6 b:共晶的结合取向

表格1：从番木瓜叶的化合物诱导适合配合结果

表2：诱导的多肽拟合对接结果

表3:多肽与蛋白酶相互作用的细节

结论

我们试图设计针对登革热病毒蛋白酶的化合物并无一直是直接的任务。尽管登革热蛋白酶的主要结构类似于丝氨酸蛋白酶，但蛋白质，疏水口袋表面的活性位点的存在以及NS2B辅因子的影响对配体结合具有很大影响。我们设计了一系列特异于蛋白酶的肽，通过基材基于基础和有源位点的方法。通过建模研究分析它们对蛋白酶的结合模式，并通过对复合物进行复合物进行验证进行分子动态模拟。这种方法可能有助于找出静态低能量结构，也有助于稳定的复杂性。这有助于完成在网上方法鉴定最佳可能的配体作为抑制剂。从这个特殊的研究中，可以观察到配体的结合效率受到蛋白质状态和关键残基的影响，这在晶体学研究中有时不会出现。在保守的和相似的配对物的帮助下对缺失残基进行建模，将有助于选择更好的配体。与核磁共振研究报告的结构进行的对接和动态研究也证实了结合亲和力和结合方式的改善。分子动力学进一步帮助我们发现配体的动态性质及其与活性位点残基结合的能量学。受上述结果的鼓舞，正在尝试将NS2B/NS3与多肽以及油酸和棕榈酸共结晶。

承认

作者希望感谢UGC和DBT（印德语）的资助。

参考文献
  1. 默里n e a，quam m b，Wilder-smith a（2013）登革热的流行病学：过去，现在和未来的前景。Clin Epidemiol 5：299-309。［Ref。］
  2. 黄病毒;马可夫(2006)。在:Knipe DM, Howley PM (Eds) Fields病毒学，第34章，第5版。Lippincott Williams & Wilkins，美国，1153-1252。［Ref。］
  3. 库诺G，张国杰，Tsuchiya KR，Karabatsos N，Cropp CB（1998）黄病毒属的系统发育学。病毒醇杂志72:73-83[Ref。］
  4. (1)黄病毒科的研究进展。在:Knipe DM, Howley PM(编)，Fields病毒学，第5版。利平科特·威廉姆斯和威尔金斯，美国费城1102-1152。
  5. Kuhn R J，Zhang W，Rossmann M G，Pletnev S V，Corver J，等。（2002）登革热病毒的结构：对黄病毒组织、成熟和融合的影响。细胞108:717-725[Ref。］
  6. Chambers TJ，Weir RC，Grakoui A，McCourt DW，Bazan JF，（1990）证明黄热病病毒非结构蛋白NS3的N端结构域是一种丝氨酸蛋白酶，负责病毒多蛋白的位点特异性裂解。美国科学院学报87:8888-8902。[Ref。］
  7. 通过黄热病病毒NS2B-3蛋白酶在NS4A区域的新网站上在NS4A区域中的新位点进行林C，Amberg SM，Chamber TJ，是在下游4A / 4B信号酶网站上加工的先决条件。J Virol 67：2327-2335。［Ref。］
  8. Lobigs M(1993)黄病毒膜前蛋白切割和刺突异二聚体分泌需要病毒蛋白酶NS3的功能。美国国家科学院学报90:6218-6222。［Ref。］
  9. 登革病毒2型非结构蛋白NS2A、NS2B和NS3的体外加工。J病毒64:4364-4374。［Ref。］
  10. 登革病毒2特异的NS3蛋白的内部蛋白水解。J Gen病毒78:337-341。［Ref。］
  11. Tomlinson SM, Malmstrom RD, Watowich SJ(2009)基于结构发现登革热蛋白酶抑制剂的新方法。感染失调药物目标9:327-343。［Ref。］
  12. 徐金涛，王春春，陈国伟，史绍荣(2006)针对病毒蛋白酶的抗病毒药物的发现。药典12:1301-1314。［Ref。］
  13. 王志强，王志强(1998)Hiv-1蛋白酶抑制剂的结构辅助药物设计。生物物理学报27:249-284。［Ref。］
  14. (2008)黄病毒抗病毒抑制剂的设计:以登革病毒NS3蛋白为靶点。抗病毒研究80:94-101。［Ref。］
  15. Arias CF，Preagschat F，Strauss JH（1993）登革热2病毒NS2B和NS3形成稳定的综合体，可以切割螺旋酶结构域内的NS3。病毒学193：888-899。［Ref。］
  16. Falgout B，Miller RH，Lai CJ（1993）登革热病毒4型非结构蛋白NS2B的缺失分析：鉴定NS2B-NS3蛋白酶活性所需的结构域。J Virol 67:2034-2042[Ref。］
  17. Li H, Clum S, You S, Ebner KS, Padmanabhan R(1999)登革病毒2型NS3蛋白的丝氨酸蛋白酶、RNA刺激的核苷三磷酸酶和RNA解旋酶功能域在20个氨基酸区域内聚合。J病毒73:3108-3116。［Ref。］
  18. Yusof R, Clum S, Wetzel M, Krishna Murthy HM, Padmanabhan R(2000)体外纯化的登革病毒2型NS2B/NS3丝氨酸蛋白酶显示出辅因子NS2B依赖于二碱性氨基酸裂解底物。中国生物化学(英文版)［Ref。］
  19. Leung D，Schroder K，White H，Fang NX，Stoermer MJ，等。（2001）重组登革热2型病毒NS3蛋白酶在截短的NS2B辅因子、小肽底物和抑制剂存在下的活性。生物化学杂志276:45762-45771[Ref。］
  20. Li J，LIM SP，Beer D，Patel V，Wen Dy等。（2005）使用四肽和八肽基质文库的登革热病毒的所有四种血清型的重组NS3蛋白酶的功能性分析。J Biol Chem 280：28766-28774。［Ref。］
  21. Niyomrattanakit P, Winoyanuwattikun P, Chanprapaph S, Angsuthanasombat C, Panyim S, et al.(2004)登革病毒2型NS2B辅因子中对NS3蛋白酶激活至关重要的残基的鉴定。J病毒78:13708-13716。［Ref。］
  22. Barbato G, Cicero DO, Nardi MC, Steinkuhler C, Cortese R, et al.(1999)丙型肝炎病毒(HCV) NS3蛋白n端蛋白酶结构域的溶液结构为其激活和催化机制提供了新的认识。中华医学会生物学及分子生物学分会。［Ref。］
  23. Niyomrattanakit P, Yahorava S, Mutule I, Mutulis F, Petrovska R，等(2006)利用内猝灭荧光多肽研究登革病毒2型NS3丝氨酸蛋白酶底物特异性。中国生物化学学报23(4):421 - 427。［Ref。］
  24. Nall TA，Chappell KJ，Stoermer MJ，Fang NX，Tyndall JD，等。（2004）具有催化活性的重组西尼罗河病毒NS3蛋白酶的酶特征和同源模型。生物化学杂志279:48535-48542[Ref。］
  25. Corpet F(1988)基于层次聚类的多序列比对。核酸Res 16: 10881-10890。［Ref。］
  26. Erbel P，Schiering N，D'Arcy A，Renatus M，Kroemer M等。（2006年）从登革热和西尼罗河病毒激活黄病毒NS3蛋白酶的结构基础。自然结构分子二醇13：372-373。［Ref。］
  27. Yildiz M, Ghosh S, Bell JA, Sherman W, Hardy JA(2013)登革病毒NS2B-NS3蛋白酶的变构抑制。ACS Chem Biol 8: 2744-2752。［Ref。］
  28. Noble CG, Seh CC, Chao AT, Shi PY(2012)登革病毒蛋白酶配体结合结构揭示了活性构象。J病毒86:438-446。［Ref。］
  29. de la Cruz L，Nguyen TH，Ozawa K，Shin J，Graham B等。（2011）低分子量抑制剂的结合促进登革热病毒NS2B-NS3蛋白酶的大构象变化：通过伪接触位移进行折叠分析。J Am Chem Soc 133:19205-19215[Ref。］
  30. 蛋白质制备向导(2009)蛋白质制备指南，第2章，Schrödinger, LLC. [Ref。］
  31. 案例da，cheatham te，darden t，gohlke h，luo r等。（2005）琥珀生物分子模拟计划。J COMPOCH CHEM 26：1668-1688。［Ref。］
  32. Subenthiran S, Choon TC, Cheong KC, Thayan R, Teck M K, et al.(2013)木瓜叶果汁显著加速登革热和登革出血热患者血小板计数的增加速度。循证互补医学[Ref。］
  33. Timiri AK，Selvarasu S，Kesherwani M，Vijayan V，Sinha Bn等。（2015）新型磺酰胺衍生物作为登革热病毒2蛋白酶抑制剂的合成与分子建模研究。Bioorg Chem 62：74-82。［Ref。］
  34. (5)黄病毒NS2B-NS3蛋白酶解旋酶在抗病毒药物研究中的应用。抗病毒研究118:148-158。［Ref。］
  35. Velmurugan D, Mythily U, Kutumbarao(2014)作为登革病毒Ns2b/Ns3蛋白酶潜在抗病毒药物的肽抑制剂设计和对接研究。Protein Pept Lett 21: 815-827。［Ref。］

在此下载临时PDF

PDF

文章信息

文章类型：研究文章

引文：Kutummarao NHV，Velmurugan D（2016）脂肪酸和肽与NS2B / NS3登革热蛋白酶结合的结构分析及分子建模研究。J Encer Dis Virol 2（4）：DOI http://dx.doi.org/10.16966/2473-1846/241

版权：©2016 Velmurugan D，等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

  • 收到日期:2016年3月10

  • 接受日期：2016年6月2日

  • 发布日期：2016年6月6日