摘要

背景:本研究的目的是建立血红蛋白E或A基因型患者血清总免疫球蛋白G率与抗感染的关系恶性疟原虫．

方法:这是一项为期五个月对越南人血清进行的前瞻性研究。

血清来自于2002年通过静脉穿刺在研究对象中收集的全血。收集的每位患者的血液被离心，获得的血清被等分到冷冻管中，并储存在20°C下用于免疫学研究（IgG分析）.为了最大限度地提高ELISA试验的灵敏度，我们使用戊二醛和高度聚合的聚赖氨酸作为树脂偶联抗原肽。然后在添加底物后，在黑暗中进行30分钟的酶促反应，然后使用分光光度计读取结果（Opsys MR Dynex®技术）设置波长为405nm。

结果:共采集了来自35个家庭的182份血液样本。在取样时，所有受试者都没有疟疾的临床症状。年龄分布3-79岁;性别比例(M/F)为1.6。血红蛋白占血红蛋白AA载体的42%，血红蛋白EA和EA载体的58%。在不同年龄组中，恶性疟原虫抗抗原肽(MSP-1、MSP- 2和SR-11.1)的特异性总IgG呈年龄依赖性分布。研究对象3-19岁时，特异性总IgG抗体滴度恶性疟原虫低于20年以上。比较特定的免疫球蛋白对抗原肽MSP-1 MSP-2和sr - 11.1恶性疟原虫的年龄组,给MSP-1明显高于平均水平相比,sr - 11.1和MSP-2 (Khi2 = 4.12)的速度总对抗原肽免疫球蛋白与血红蛋白E主题载体是高于血红蛋白(p = 0.004)。

结论:结果表明，20年以上血红蛋白E基因型患者对疟原虫抗原(MSP-1、MSP-2和SR-11.1)的特异性总Ig G反应优于AA基因型患者。在20岁以下的受试者中，不同组的血红蛋白没有显著差异。MSP-2和MSP-1在不同年龄组的免疫原性明显高于SR11.1。

关键字

血红蛋白E;MSP1;MSP2;SR11.1;ELISA;免疫球蛋白

介绍

在西非，事实表明，在长期暴露于密集传播之后;它逐渐发展出一种非杀菌的免疫力恶性疟原虫．此外，在这些流行地区，一些人似乎对临床疟疾和/或严重形式的疟疾具有自然保护。在小鼠模型中已经清楚地证明遗传因素控制疟原虫感染，这表明疟疾临床感染的耐药性是遗传控制的[2,3]。研究清楚地证明了异常血红蛋白在抵抗疟疾发作中的作用。在这种抗性中，由甘氨酸(6 β:谷氨酸→Valin)的β链改变引起的镰状细胞性状(Hb AS)是研究最多的红细胞遗传异常[4-6]。因此，它的易感性恶性疟原虫乙肝S或乙肝C携带者感染和疟疾发作较少[7-9]。然而，调节这种抗性的机制仍不清楚。

提示，在血红蛋白病中的保护作用可能部分是由于抑制恶性疟原虫增加S寄生红细胞[10,11]，从而可能引起这些血红蛋白病[4]携带者个体免疫球蛋白G反应的调节。

最近提出的一项保护不受伤害的建议恶性疟原虫携带血红蛋白C和S的机制表明，它与受感染镰状细胞C或S表面的抗原暴露PfEMP1异常有关[6]。其他免疫流行病学研究也表明，对疟疾的保护至少部分由抗体决定[12]在Hb AS/SS/SC和AA的情况下，针对疟疾抗原的Ig G滴度较高[9,13,14]。因此，[15,16]表明嗜细胞抗体（IgG1和IgG3）对疟疾具有保护作用恶性疟原虫通过FcgRIIA激活效应细胞，而IgG4和IgG2阻断保护机制。移植HbS后，IgG3对MSP-2的反应可能影响IgG2标题的降低。

另一种血红蛋白E(纯合子或杂合子)，由于在a球蛋白链的第26氨基酸段谷氨酸取代赖氨酸，在东南亚很常见，已被描述为在红细胞中抵抗增殖恶性疟原虫和间日疟原虫(10、17)。Chotivanich等人的[18]研究表明，患者携带的血红蛋白E中的寄生虫密度较低，这可以防止疟疾的严重表现。很少有研究表明血红蛋白E参与调节对不同阶段的不同表面抗原的免疫反应恶性疟原虫或间日疟原虫．

有数据表明，血红蛋白E在严重疟疾病例和单纯疟疾患者的耐药性中起作用。我们研究的目的是建立血红蛋白E或A基因型受试者血清中总免疫球蛋白G的标题与对感染的耐药性之间的关系恶性疟原虫．

方法

病人

这是一项为期5个月的前瞻性研究，对居住在广治省XaTanh公社年龄在3-79岁的越南人的血清进行了研究。这项研究在马赛蒂莫内药学院进行:混合研究单元- md3(宿主-寄生虫关系和免疫遗传学药物治疗)。

我们的血清来自于2002年通过静脉穿刺采集的研究对象的全血。每个患者的血液都被离心，获得的血清被放入冷冻管中，在20°C下保存，用于免疫学研究(IgG检测)。选择Xa Thanh镇是合理的，因为该地区疟疾和E型血红蛋白病的发病率很高。

实验室检测:肽偶联戊二醛后ELISA

在ELISA板上用合成肽直接敏化通常是低效的，高度依赖于它们的大小和电荷。为了最大限度地提高我们测试的敏感性，我们使用戊二醛，高度聚合的聚l -赖氨酸作为树脂来偶联抗原肽。

原则:聚L-赖氨酸通过将侧链中的NH3+基团暴露在具有CHO戊二醛反应功能的反应性基团上，涂覆在用作锚定物的板上。然后使用化学反应后形成的共价键将偶联剂固定在板上。戊二醛的第二醛功能和伯氨基基团之间的第二次反应p（NH3+末端或侧向）允许疟原虫抗原（MSP-1、MSP-2和SR-11.1）共价附着到聚赖氨酸上，从而更好地附着到ELISA板上。然后使用甘氨酸的氨基功能阻断醛功能。我们使用以下方案：

Poly-L-Lysine在4°C(40µg/ml, pH=9.6)， 100µl/well包被过夜。PBS 1X冲洗3次，PBS 1X缓冲液稀释1%戊二醛100µl/孔，室温孵育30分钟。然后洗涤3次，将抗原肽溶液(10µg/ml，用PBS 1X缓冲液稀释)加入到孔中(100µl/孔)。室温孵育过夜，洗三次，室温下用1 M甘氨酸(PBS 1X, 200µl/well)阻断游离活性功能基团1 h。最后，用PBS-3% Milk(室温2 h, 250µl/well)洗涤并饱和。然后我们遵循以下步骤:

平板饱和后的每一阶段都要在0.05% Tween(每孔200µl)的PBS中洗涤三次。

含待测特异性抗体的样品用PBS 1X稀释1/20，用于测定特异性总IgG。

对于每个平板，采用非洲受试者血浆库作为阳性对照纳入标准。阴性对照是用欧洲人未接触过的自身等离子体建立的恶性疟原虫和“白色”，其中血浆被PBS 1X稀释缓冲液取代。标准的稀释范围是½。

将稀释后的血浆(1:20)置于100µl/孔中，室温孵育2小时。

然后在平板上涂上山羊的抗人免疫球蛋白G，这是一种与碱性磷酸酶偶联的二抗(根据制造商的建议(Beckman Coulter)，用1X稀释1/3000的PBS^®取100µl /孔，室温孵育2小时，搅拌均匀。

以每孔200µl的速度，将临时制备的碱性磷酸酶-对硝基苯基磷酸盐(pNPP)的底物沉淀。加入底物后，酶催化反应在黑暗中进行30分钟，然后使用波长为405 nm的分光光度计(OpsysMRDynex®Technology)读取结果。

数据统计分析

采用Excel 2007表格软件进行数据处理和分析。

在所有的吸光度值，它是减去吸光度的“白色”。

为了比较不同过程之间的值，我们对正池的值进行了标准化。然后将这种校正应用于每种血清的光密度。

样本滴定是使用从流行地区非洲人血清库中获得的范围进行的。所用因子的稀释倍数如下:20;50;100;200年和400年。1/400稀释后的吸光度值为10 AU/ml。从范围中得到的趋势线方程允许我们计算每个吸光度在AU/ml中测量的当量(图1-3)。

图1：从MSP-2的范围得到趋势线方程

图2：由SR-11.1范围得到的趋势线方程

图3:在MSP-1范围内得到趋势线方程

用于比较均值和比例的检验为卡方检验和Fisher, Kruskal Wallis检验。P值<0.05，差异有统计学意义。

结果

研究群体和研究区域的特征

血液样本是在香化区Xa Thanh镇采集的。这个小镇位于海拔较高的地区，沿着Sêpon河形成了老挝和越南的边界。该公社的领土面积为1200公顷，包括9个小村庄。上次人口普查共有居民2203人，家庭382户。所有的居民都属于Bru-Vân Kiêu族。他们主要是农民和牧民。这些家庭平均有4.8个孩子，受教育程度仍然很低。Bru Van Kiêu实行间歇性种植，每年使用远离永久房屋的燃烧区。他们经常在森林里过夜。栖息地大多是传统的; with the kitchen in the middle of the house (net use is limited due to fire fears). The people have very close relations with Laos and make frequent visits to Laos.

香化区是疟疾高发地区。已报道按蚊30余种(全省共有31种)。传播的两个主要媒介是一个。最小的东西和一个。Dirus．该省的大部分渔获是在香化区进行的(占88%)一个。最小的东西和95%的一个。Dirus）.疟疾病例的数量在雨季(6月至9月)特别多。Xa Thanh公社药房1997年至2001年收集的数据表明，在2203人中，平均每年有125例疟疾病例，每年变化范围从72例到194例。从6月到9月，对60%的疟疾病例进行了4个月的观察。有恶性疟原虫感染(98%)和恶性疟原虫感染(98%)。间日疟原虫(2%)。共采集了来自35个家庭的182份血液样本。在取样时，所有受试者都没有疟疾的临床症状。年龄分布3-79岁;性别比例(M/F)为1.6。

受试者血红蛋白类型和年龄分布

我们将患者分为四个年龄组：0-10岁的儿童、11-19岁的青少年、20-31岁的年轻人和32岁以上的成年人。对于每个年龄组，我们有相似比例的个体AA和AE。通过电泳测定这些受试者的血红蛋白表型。血红蛋白的比例为血红蛋白的42%n AA携带者和58%的血红蛋白EA和EA携带者。

总免疫球蛋白G率按年龄划分

在不同年龄组中，特异性IgG总抗MSP-1、MSP-2和SR-11.1抗原恶性疟原虫显示与年龄有关的分布。研究对象3-19岁时，特异性总IgG抗体滴度恶性疟原虫低于20年以上。比较各年龄组恶性疟原虫MSP-1、MSP-2和SR-11.1的特异性IgG, MSP-1的平均值显著高于SR-11.1和MSP-2 (chi2=4.12)(图4)。

图4:年龄和血红蛋白对抗msp - 1总IgG的影响

血红蛋白对3 ~ 19岁患者特异性总IgG率的影响

20岁以下由106人组成，平均年龄为11.7岁。血红蛋白分布为AA携带者41/106 (39%)，AE携带者44.3% (47/106)，EE携带者15.1%(16/106)。在疟疾流行地区，接触抗原的人需要获得免疫，这取决于传播的程度。对恶性疟原虫抗原(MSP-1)的特异性总IgG抗体阳性率;各组血红蛋白MSP-2和SR-11.1无显著差异(p=0.07)(图4-6)。

图5:年龄和血红蛋白对抗msp - 2总IgG的影响

图6:年龄和血红蛋白对抗sr -11.1总IgG率的影响

20年以上受试者血红蛋白对特异性IgG的影响

该年龄组的特异性总IgG的获得率在血红蛋白组间有显著差异。因此，以血红蛋白E为载体的受试者抗抗原多肽的总IgG率高于血红蛋白A(图4-6)。差异有显著性(p=0.004)。因此，在20岁以上携带血红蛋白E的受试者中，特异性总IgG的获得是不同的。

讨论

在我们的研究中，我们观察到血红蛋白E的比率为(58%)。这些结果高于Fucharoen G et al.[20]在泰国(50%)和Flatz et al.[21]老挝(43%)的结果。

尽管如此，我们的数据证实了E型血红蛋白病在亚洲的强烈代表性及其与目前疟疾的分布一致。血红蛋白S在撒哈拉以南非洲、赤道带、中东和印度部分地区发现。血红蛋白C在非洲西北部很常见，其分布与血红蛋白s一致。在亚洲则不存在。

我们还观察到，针对MSP-1水平的特异性IgG比率在年龄组中显著高于SR-11.1和MSP-2。我们注意到，在我们的研究中，个体对MSP-1、MSP-2和SR-11.1这三种多肽的特异性抗体的识别率很低。

这些针对这些抗原的低滴度抗体使得很难评估不同血红蛋白组之间的明确关系。这一结果可以用对多种寄生虫毒株抗原反应选择的可变性来解释。这也可以解释为，IgG2(和IgG4)被认为是非嗜细胞抗体，能够通过阻止嗜细胞抗体对抗原的识别来阻断保护机制[22,23]。

我们使用的三种抗原肽MSP-1和MSP-2比SR-11.1具有更强的免疫原性。

在我们的研究中，在不到20年的受试者中，没有发现血红蛋白组中特异性总IgG滴度的显著差异。Ntoumi et al.[15]在2005年加蓬儿童血红蛋白AS中显示抗体滴度有差异。这可以用红血球入侵的复杂途径来解释恶性疟原虫提高MSP-1和MSP-2的嗜细胞IgG滴度。

我们的结果可以用以下事实来解释:在疟疾流行地区，年轻人所需的抗疟免疫的获得取决于传播水平，并与年龄有关[24,25]。在我们的人群中，20岁以下的受试者还没有达到特异性IgG的最大值。

我们在20岁以上的年龄组中观察到，在血红蛋白E携带者和血红蛋白AA携带者中，抗原肽（MSP-1、MSP-2和SR-11.1）的特异性总IgG水平较高。这种差异是显著的。Verra等人在布基纳法索也做了同样的工作。[26]2007年的研究表明，当受试者是血红蛋白S或C携带者时，抗疟疾抗原（MSP-1、MSP-2、MSP-3、EBA-175和AMA-1）的特异性总IgG水平较高。

这些结果表明，血红蛋白E载体具有较好的特异性总IgG MSP-1的产生;MSP-2和SR-11表位与正常血红蛋白AA携带者比较。恶性疟原虫基因型的多样性可能有助于增加对恶性疟原虫的识别库，从而加速获得对疟原虫的保护性免疫。

结论

我们的分析结果表明，血红蛋白病的频率E(58%)在越南更高。我们已经证明，20年以上血红蛋白E型患者对疟原虫抗原(MSP-1、MSP-2和SR-11.1)的特异性总IgG反应优于AA型患者。在20岁以下的受试者中，不同组的血红蛋白没有显著差异。在不同年龄组中，即使MSP-2和MSP-1的免疫原性明显高于SR11.1。

作者的贡献

构思和设计实验:SY TY FF。进行了实验:SY TY FF。提供试剂/材料/分析工具:SY TY FF。写论文:SY FF TY SI SG。

利益冲突

我们声明我们没有利益冲突。

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条信息

文章类型:研究文章

引用:SourabiéY，BaziéWW，SangaréI，Sanou G，Fumoux F等。（2016）异常血红蛋白EA或EE携带者疟疾感染的免疫学分析。Int J疫苗免疫2（2）：doi http://dx.doi.org/10.16966/2470-9948.110

版权:©2016 Sourabié Y，等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

收到日期:2015年11月02

接受日期:2016年04月01

发表日期:2016年04月04