摘要

牛疱疹病毒1（BoHV-1）导致牛中呼吸道感染和堕胎，是牛呼吸道疾病复合物（BRDC）的重要组成部分。Bohv-1也已从绵羊与呼吸系统疾病中分离出来。实验地，鼻内接种后BOHV-1的绵羊和山羊均可用BOHV-1感染，并产生对BOHV-1的免疫应答。我们设计了一个三重植物牛仔病毒类型1（BoHV-1 TMV）疫苗病毒，其在小牛中保护抗BoHV-1。在本研究中，在鼻内接种后，我们已经测试了BoHV-1 TMV感染性和血清中和抗体滴度。结果表明，在鼻粘膜中复制鼻粘膜的BoHV-1 TMV，其滴度为7天，受感染的羔羊产生血清中和滴度。

关键字

牛疱疹病毒类型1;三基因突变体;羊;鼻内接种疫苗

介绍

牛是牛疱疹病毒1型(BoHV-1)的天然宿主，而绵羊等小型反刍动物也可感染BoHV-1。在牛中，BoHV-1会导致严重的呼吸道感染，即传染性牛鼻气管炎(IBR)，并导致怀孕母牛流产。此外，BoHV-1是牛呼吸系统疾病复合体(BRDC)的重要组成部分，也称为“航运热”[1-5]。在绵羊中，BoHV-1感染可能不会引起临床上显著的疾病;然而，它可能导致中度血清脓性鼻分泌物。我们最近开发的三突变株BoHV-1有很大的希望作为疫苗载体病毒。在世界各地都很严重的几种绵羊病毒性疾病，如裂谷热、蓝舌病和边界病，缺乏有效的疫苗。使用BoHV-1三突变株的载体疫苗可能是治疗这些疾病的可行方法。在牛中，野生型(wt) BoHV-1规避了细胞免疫应答，避免了宿主细胞毒性CD8+ T细胞识别，因为包膜蛋白UL49.5暂时性下调了主要组织相容性复合体(MHC) I类分子的细胞表面表达[6-8]。这使得病毒在鼻腔和上呼吸道上皮细胞中活跃复制，并导致脓疱和溃疡病变[9]。 This combined with immunosuppression, facilitates secondary bacterial infection resulting in pneumonia and/or BRDC [4,8,10].

在没有继发性细菌感染的情况下，被感染的动物通常存活，但成为终生BoHV-1携带者。BoHV-1在呼吸道粘膜或鼻上皮内复制后，进入鼻咽三叉神经感觉神经末梢(轴突末梢)。随后，核衣壳随被膜结构逆行(沿三叉神经轴突向上)运输到三叉神经节(TG)相应的神经元胞体，在那里建立终身潜伏期[3]。此后以及在潜伏期感染动物的整个生命周期中，应激可诱导潜伏期病毒重新激活。这通常导致其顺行运输(沿轴突向下，远离细胞体)到鼻咽(三叉神经的上颌分支)的神经末梢。这进一步导致病毒的鼻腔脱落和随后的病毒传播给易感动物，从而加强了病毒在动物群体中的维持和传播。在实验中，绵羊和山羊支持BoHV-1在鼻上皮中复制。经鼻感染的绵羊和山羊通过鼻分泌物排出病毒[11,12]。一些实验研究也表明，感染的绵羊和山羊在鼻内感染BoHV-1后产生免疫应答[11,12]。鼻内感染后，BoHV-1也可在绵羊和山羊的三叉神经节建立潜伏感染。 Like in cattle, the latent virus reactivates due to stress and results in recurrent virus nasal excretion and seroconversion (rising antibody titers) [11,12].

我们设计了一种三基因突变的牛疱疹病毒1型(BoHV-1 tmv)疫苗，该疫苗不下调MHC-I细胞表面表达，缺乏毒性，从潜伏期重新激活后也不会在鼻腔分泌物中脱落。这是因为在BoHV-1 tmv中，BoHV-1 UL49.5中下调MHC-I的结构域被删除，糖蛋白gE的整个细胞质尾序列对毒力和顺行都很重要

神经元转运和轴突顺行转运所需的整个Us9编码序列被删除[13]。最近，我们确定犊牛经鼻接种/感染后，BoHV-1 tmv明显减弱，但复制效率高，产生明显更好的保护性免疫反应，与ge -缺失病毒相比，后者也有顺行性神经元运输缺陷，从潜伏期[14]重新激活后不会在鼻分泌物中脱落。

由于野生型BoHV-1可通过鼻内感染绵羊，引起中度临床症状，并诱导血清中和抗体[11]，我们假设经鼻给药后BoHV-1 tmv在绵羊体内会减弱;然而，它会诱导鼻内感染BoHV-1特异性免疫反应。如果是这样，那么BoHV-1 tmv可以作为病毒载体表达其他感染牛、绵羊和山羊的病毒的保护抗原，如裂谷热[15]、小反刍兽疫病毒[16]、蓝舌病[17]和边境病。本研究测定了绵羊鼻感染后BoHV-1 tmv的复制/脱落特性和血清中和抗体反应。我们的结果表明，BoHV-1 tmv感染了绵羊，并诱导了BoHV-1体内感染后特异性血清中和反应。

材料和方法

细胞和病毒株

如前所述，维持用于病毒繁殖的MDBK细胞系[18]。BoHV-1 TMV病毒早期构建[13]，使用父母BoHv-1 Cooper应变。

羊羔鼻内感染

动物感染，处理，样品收集和安乐死协议先前批准了LSU机构动物护理和使用委员会。十二叶-1和BVDV阴性4-6个月雄性羊羔（Kathdin品种），称重约。选择了60-80磅。六只羊羔各自被随机分配到LSU-AG中心大型动物隔离设施的两个房间。表1中显示了羊羔和样品收集方案的感染。如前所述，接种感染组中的动物[13]用1×10接种^7.斑块形成单位（PFU）在0.5ml /鼻孔的BOHV-1 TMV（总2×10^7.每只羊微升)。对照组未感染的羔羊分别饲养，同样接种0.5 ml /鼻孔细胞培养基。

对于临床症状，每次随访时记录直肠温度、鼻腔分泌物和鼻腔病变，并对每个参数进行临床评分。直肠温度评分为0-4(<39.0°C, 39.5°C, 40.0°C, 40.5°C， >40.9°C)，鼻流评分为0-4(正常，浆液性，轻度和重度黏液脓性)，鼻腔病变评分为0-3(正常，充血，脓疱和溃疡)。

病毒滴定和病毒中和试验

将MDBK细胞以3 × 10的浓度接种于24孔板(康宁)中进行病毒滴定^5.细胞500 μl/孔。用含2%胎牛血清的DMEM稀释病毒悬液，稀释倍数为10-1 ~ 10-7。将含有细胞的24孔板上的培养基滗出后，将每种稀释液的等量200 μl加到两个相应的孔中，在CO中孵育2小时₂孵化器在37°C。随后，在每孔中加入400 μl覆盖介质，1.3%羧甲基纤维素，DMEM中含有2% FBS (Sigma #C5013)，在37℃下进一步孵育48 h。4%甲醛溶液室温固定细胞30分钟，0.35%结晶紫溶液染色15分钟。病毒滴度用菌斑形成单位(PFUs)/ml表达，公式如下:

表1:羔羊BoHV-1 TMV鼻内感染研究设计方案。

=平均斑块数×病毒稀释的倒数× 5。

为了进行病毒中和试验，如上所述制备了24孔板，其中含有MDBK细胞。血清样品在56℃灭活30分钟，然后在含2%的DMEM培养基中稀释两倍，每管中保留250 μl的稀释血清。然后用250 μl含100 pfu /100 μl的病毒悬液在37℃下孵育1 h。以含DMEM (250 μl)的5管为对照，用含100 pfu /100 μl的病毒悬液250 μl孵育。随后，将每个血清/病毒稀释剂和对照组各200 μl等量重复添加到上述24孔板的相应孔中，在37℃下进一步孵育48 h。固定细胞并按上述染色，计数每个孔内的斑块数量。将对照组孔中平均计数的斑块数记为Vo，每种血清稀释液中平均计数的斑块数记为V。每一种血清稀释液中剩余斑块的百分比用Microsoft Excel中如下公式计算=(V*100)/V_o)，然后绘制以计算每个血清样本50%的斑块减少效价。滴度表示为最高血清稀释的倒数，与病毒对照相比，最高血清稀释可使斑块数量减少50%。

结果与讨论

羔羊BoHV-1 TMV的致病性和鼻腔病毒脱落

在初次感染/接种疫苗后，测定感染羔羊的临床评分。根据结果(数据未显示)，动物没有发烧，没有明显的鼻腔病变，也没有鼻分泌物。因此，他们的临床评分与受感染的对照组没有显著差异(数据未显示)。BoHV-1 tmv在鼻上皮中有效复制，并在感染后7天内脱落病毒(dpi)。鼻拭子中病毒的最高产量为4 dpi (1-2 × 10)^4.我们早期犊牛免疫攻毒研究的结果也表明，即使BoHV-1 tmv复制良好(2 × 105 - 8 × 10)^5.pfus）在感染牛犊的鼻上皮中，小腿中没有明显的临床症状（直肠温度，鼻分泌和鼻病变[13]。

图1：鼻腔病毒脱落后初级鼻内感染/羔羊免疫羊毛，BoHV-1 TMV。作为对照，在原发性感染期间也测试了假感染的羊羔。在含有青霉素/链霉素的1mL DMEM中的指定时间点收集鼻拭子。来自鼻拭子的病毒滴定由标准斑块测定进行。如预期的那样，控制虚假感染的羊羔没有脱掉任何可检测量的病毒。

早些时候，Hage等人[11]报道，wt BoHV-1, lam株在绵羊的鼻上皮中复制，导致鼻病毒脱落，持续时间高达15 dpi，病毒产量高达10^7.5TCID50。此外，接种的绵羊有中度血清脓性鼻分泌物。在犊牛中，BoHV-1 tmv在鼻病毒脱落持续时间和临床症状[13]方面均较亲本野生型株Cooper明显减弱。在犊牛中，BoHV-1wt和BoHV-1 tmv鼻病毒脱落时间分别为12 dpi和9 dpi。值得注意的是，BoHV-1 tmv感染犊牛未表现出任何临床症状。在羔羊中，BoHV-1 tmv的鼻病毒脱落持续7天，比Hage et al.[11]报道的BoHV-1 wt绵羊鼻病毒脱落时间短9天。在本研究中，我们没有比较BoHV-1 Cooper株在羔羊中的病毒脱落。然而，基于我们早期对犊牛的研究结果(使用与本研究基本相同的方法)，我们认为，与犊牛一样，BoHV-1 tmv在羔羊[13]中显示出减弱的生长表型。这些结果也与假设一致，即BoHV-1 tmv在羔羊中比在犊牛中表现出稍微更弱的特性。

BoHV-1 tmv感染羔羊血清中BoHV-1中和抗体滴度的研究

为了评价接种BoHV-1 tmv的羔羊的BoHV-1特异性免疫反应，从感染BoHV-1 tmv和假感染的绵羊(表1)收集0、7、14和21 dpi的血清，检测血清病毒中和(VN)抗体对BoHV-1 wt的效价。感染BoHV-1 tmv的羔羊初次感染后产生VN抗体效价，21- 28dpi时，血清病毒中和效价平均为6-8。早些时候，在犊牛中，我们通过鼻内接种BoHV- 1 tmv (SN滴度在15-20之间)获得了稍好的血清中和滴度。虽然接种BoHV-1 tmv的羔羊血清中抗BoHV-1的中和效价低于犊牛，但可能具有保护作用。如果没有，我们认为通过同时肌肉注射疫苗病毒可以获得更高的血清中和效价。

总之，衰减的BoHV-1 TMV保留其在羊羔中的感染性和免疫原性性质，从而证明其可能进一步调查作为对BoHV-1的疫苗和病毒载体疫苗。Our currently ongoing research has produced encouraging results suggesting that BoHV-1 tmv can be used as a vector for protective antigens of other bovine respiratory viruses, i.e. bovine viral diarrhea virus (BVDV) envelope protein E2 [18,19], bovine respiratory syncytial virus (BRSV) envelope proteins F and G [20,21]. Furthermore, we believe that it could serve as a vector for delivering protective antigens Gc and Gn of Rift Valley Fever virus (RVFV) in cattle and small ruminants [22,23]. RVFV infection in critical livestock species such as sheep, goats, buffalo and cattle, cause significant economic losses through death, abortion and decreased milk production [24]. In addition, RVFV-infected sheep and cattle are the main source of infection to humans. In 2000, there were 747 human cases in Saudi Arabia, which was likely due to massive movements of animals and people during the Hajj [25]. Currently we are generating a BoHV-1 tmv vectored vaccine against RVFV which, if efficacious, can be used to vaccinate sheep, goats, cattle and perhaps buffalo to prevent future RVFV outbreaks in human.

图2：在BoHV-1 TMV的原发性鼻内感染/免疫后，病毒中和羊羔中的抗体滴度。在指定的时间点处收集血清样品，通过加热（56℃30分钟）灭活并储存在-20℃下。通过斑块减少测定计算血清病毒中和滴度。正如预期的那样，控制虚张理的羔羊对于BoHV-1特异性中和抗体是阴性的。

确认

USDA Grants对S.I.Chowdhury（2009-35204-05200和2007-35204-17358）提供支持这项工作。

参考文献

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条信息

文章类型:研究文章

引用:borhv -1的三基因突变体经鼻内给药后在鼻上皮中有效复制并诱导中和抗体。国际J疫苗免疫2(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/ 2470-9948.108

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出版历史：

收到的日期：2016年1月11日

接受日期:2016年1月25日

发表日期:2016年1月29日