摘要

背景:尽管对已故捐赠者肾脏的利用有所增加(DCD;DCD肾移植后，移植肾延迟功能(DGF)和原发性无功能(PNF)的发生率仍然很高，而移植后的存活率较低。增强的保存技术将有助于DCD肾和预后的质量改善。目前的研究评估了新型器官保存溶液Somah与威斯康星大学(UW)溶液延长DCD肾脏存储的能力。

方法:心源性死亡后60±10分钟获得的猪DCD肾冲洗，置于4°C贮藏液中保存72小时。在1、6、24和72小时进行组织病理学(HP)、组织高能磷酸盐(HEP;ATP+磷酸肌酸)和western blotting检测内皮-一氧化氮合酶(eNOS) von-Willebrands因子(vWF)和红细胞生成素(EPO)。代谢参数pH, pO₂, pCO₂在类似的时间点确定溶液中的葡萄糖和乳酸水平。

结果:somah贮存的肾脏大体形态正常，代谢活性和能量保存(HEP)增强。相比之下，uw肾呈斑点状外观，肾小管上皮细胞的细胞核增红程度随时间增加，代谢减弱，HEP渐进性下降，eNOS、vWF和EPO表达减少，表明贮藏期间组织受损。

结论:Somah保存肾组织的更好保存和较高的能量状态表明Somah保存的DCD肾在移植时可能表现更好。未来的研究包括移植储存在Somah的DCD肾需要进一步的评价。

关键字

体外存储;肾移植;保护解决方案;Somah;心脏循环死亡后的捐赠

缩写

CP:磷酸肌酸;eNOS:内皮型一氧化氮合酶;促红细胞生成素:促红细胞生成素;HEP:高能磷酸盐;vWF:冯·威尔布兰兹因素

介绍

去年，每100名需要肾移植的患者中，就有86人没有得到肾移植。http://www.kidney。org)。尽管在过去的几十年里，实体器官移植取得了巨大的进展，肾脏替代疗法(血液透析和腹膜透析)的可用性不仅与严重衰弱和/或危及生命的并发症有关，而且由于频繁需要，阻碍了患者的日常生活方式去医院看病，给社会带来巨大的经济负担。

去年，美国有14000名患者接受了肾移植，而每月等待肾移植的患者增加2500人，在撰写本文时，等待肾移植的患者约有10万人;平均等待时间是3到5年。然而，65%的肾移植来自于死者(DCD;与标准供体[2]相比，这些移植物发生迟发移植物功能(DGF)的可能性是标准供体[2]的两倍，原发性无功能(PNF)[3]发生率增加，移植物总生存率减半。虽然移植受热和/或冷缺血是实体器官移植的必然结果，但在此期间产生的细胞/组织损伤是移植后肾功能不理想的结果。上述数据表明，通过改进保存技术，改善DCD肾移植的质量具有巨大的潜力，从而获得更理想的长期患者预后。

为此，我们制定了一种新型的器官存储溶液，Somah，与目前的临床规范如Celsior和UW相比，在猪心脏移植物的体外静态保存方面具有明显的优越性[4-7]。合理加入Somah成分，不仅有助于减轻再灌注损伤(活性氧种)，还有助于高能磷酸盐(HEP;ATP+磷酸肌酸(ATP+磷酸肌酸)也显著增强，从而适当的代谢需求在储存和立即再灌注。Somah在体外静态存储DCD肝脏[8]和灌注存储DCD肺[9]的优势也得到了证实。

我们对猪心脏和肝脏的研究表明，体外储存过程中能量代谢的保存与储存后的生化和功能结果直接相关。本研究的目的是评估的有效性Somah扩展体外静态存储器的肾脏保存收集使用我们的经验的想法Somah其他器官的研究发表在领域,作为保护肾移植细胞生存能力的标准和能源需求在存储。

材料和方法

手术取肾

体重40-50公斤的雌性约克郡猪按照动物研究委员会批准的方案使用。给猪注射替拉唑4-6 mg/kg，氧拉嗪2 mg/kg，气管插管并连接呼吸机。静脉注射丙泊酚(10 mg/kg/小时)和瑞芬太尼(40-60 μg/小时)维持麻醉。顺式阿曲库铵(10- 20mg，静脉注射)是一种麻痹剂，于术前10分钟给予。中线胸骨切开术后，对动物进行全身肝素化处理(300 mg/Kg)，主动脉根部插管。主动脉夹持后注入冰冷的停搏液(20 mM K+)以停止心脏，然后切除心脏进行其他实验，如所述[6,7]。心脏收缩完全停止的时间被记录为身体其他器官热缺血的开始。中位剖腹手术后，肝上主动脉插管，腹腔脏器用2 L冰水冲洗(CoStorSol;保存溶液公司(Elkhorn, WI)或Somah溶液公司(Somahlution Inc.， Jupiter, FL)，在100mmhg压力和300ml /min流量下，直到灌注液通过下腔静脉(IVC)返回清晰。首先进行腹部器官切除，以供其他实验使用，然后在仔细解剖肾蒂后进行全双侧肾切除术。 Kidneys were immediately transferred to Somah or UW solution (Table 1) at 4°C and static stored for 72 hours. Kidney biopsies were obtained for histopathology, HEP and Western blot assays at time 0, and 6, 24 and 72 hour time-points. Time 0 corresponds to 1 hour in storage; time required to transport kidneys from animal research facility to lab before first biopsy.

组织病理学

组织用福尔马林固定，石蜡包埋，切割10 μ薄切片，熔在玻片上进行进一步处理。取组织切片，依次增加乙醇浓度干燥，苏木精和伊红染色，用氧嗪清净剂浸泡，盖玻片，显微镜下观察。利用奥林巴斯显微镜和图像分析系统(BX51TRF;奥林巴斯美国公司，美国)，并由独立观察员盲目评估。

ATP和磷酸肌酸测定

如前所述测量肾组织提取物中的ATP和磷酸肌酸(CP)[4-7,10]。简而言之，将20 mg肾组织悬浮于400 μl 0.4 M冰冷高氯酸中，均质两次，持续30秒。匀浆在1970 g下0°C离心10分钟。取上清液，用等量的0.4 M KHCO3冰冷溶液中和，如上所示离心。上清保存在-80°C用于ATP/CP测量。将颗粒溶解在0.1 M NaOH等体积中，离心后用于蛋白质测定。根据制造商的方案，使用生物荧光检测试剂盒(Sigma- Aldrich and GloMax Multi+Detection System, Promega)测量ATP/CP。

表1:Somah和UW溶液的组成

西方墨点法

蛋白质的提取:将20mg肾组织悬浮在含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的提取缓冲液中。组织匀浆30秒，16100 × g离心10分钟，收集上清。将不同样品中等量的总蛋白(30 μg)与含有5% β-巯基乙醇的Laemmli样品缓冲液混合，在100℃下加热3分钟。

电泳:蛋白在10% SDS-PAGE上分离，电印迹于硝酸纤维素膜上;使用抗体(抗caveolin, eNOS, vWF和EPO)和化学发光分析鉴定蛋白，条带密度归一化为β肌动蛋白，描述为[4]。

代谢分析

pH和乳酸、葡萄糖代谢、氧和二氧化碳浓度(pO₂和pCO₂)在Somah和UW评估0(1小时;使用VetScan iStat和VetScan VS2存储期间的6、24和72小时时间点。

统计分析

测量和数据提取采用盲法进行。两组比较(UW vs. Somah，每组n=7)，评价两种溶液的效果。采用单因素方差分析(ANOVA)将各种分析的量化初始值与各组内后续时间点进行比较，然后采用Dunnett的多重比较检验，组间比较分析采用t检验。在95%置信水平下接受统计学意义(p<0.05)。除非另有说明，所有值均为平均值±SEM。所有分析均使用GraphPad Prism 6 (v6.1)进行。作者有权查阅数据，并对数据完整性承担全部责任。所有作者已阅读并同意手稿所写。

结果

外植肾的形态学和组织学变化(图1)

肾脏大体形态:肾脏在4°C浸泡静态储存1-3天内进行检查。UW储存的肾脏呈暗色和斑点状(图1a)，提示器官充血。相比之下，储存在Somah中的肾脏在储存3天后表现健康，颜色均匀，形态没有变化(图1d)。

肾组织形态学:无论储存解决方案如何，在观察时间点的所有DCD肾脏中都没有明显的间质水肿，具有良好的保存肾组织的整体结构（图1B，1C，1E和1F）。在所有时间点的近端复合小管（PCT）中观察到管状腔中的正常无定形集合，并且没有增加储存持续时间。远端卷积小管（DCT）在所有时间点中仍然清除任何碎片，除了在72小时的情况下，在UW和Somah保存的肾脏中显而易见（图1c和1f）。肾小球在两种解决方案中表现出正常出现的Bowman的空间和连续的顶视性上皮，两种解决方案（图1B，1C，1E和1F）。

图1:用UW (A;a,b,c)或Somah (b;d,e,f)溶液保存72小时，在4℃体外保存0小时(见文本)、6小时、24小时和72小时采集图像进行大体形态学评估和组织病理学活检。在UW冲洗肾脏时，在所有时间点都呈现斑驳的外观和斑片状变色(a)。Somah冲洗肾脏时，肾脏颜色均匀，形态光滑，无斑片状变化(d)。组织学检查显示两UW均无间质水肿(b, 200X;c, 400X)和Somah (e, 200X;f, 400X)在所有调查时间点储存DCD肾脏。与Somah肾(f)相比，UW肾(c)在6、24和72小时时间点的小管上皮细胞更倾向于核深染(f)。

在UW和somah储存的肾脏中，均观察到肾小管上皮核异质性逐渐丧失，伴染色加深，偶尔细胞边缘缺失，提示肾小管上皮损伤(图1c和1f)。然而，在uw储存的肾脏中，这些变化的程度明显更大(p<0.05)。在UW肾中，PCT/DCT的上皮细胞核(PCT/DCT的)在0、6、24和72小时的贮藏时间点平均深染率分别为3.5%、24.4%、39.7%和37%，在Somah肾中分别为4.4%、6.2%、10.9%和11.6%。提示在somah储存的DCD肾中，肾小管上皮细胞比uw储存的肾能承受更长时间的缺血。

储存肾脏的新陈代谢

通过评估体外储存期间的代谢功能来评估DCD肾脏的生理/生化活性;UW组和Somah组的代谢活性不同。虽然新重组溶液的pH开始时更碱性(在UW中更碱性)，但在Somah中pH明显随时间而下降，但与UW(7.5-7.4)相比仍然更酸性(6.8-7.2)(图2A)。有趣的是，虽然UW溶液中葡萄糖水平暂时增加，表明糖原分解，但在6小时及以上时间点，Somah中葡萄糖水平有比较显著的下降(p<0.05)，表明肾脏组织/细胞利用Somah中的葡萄糖(图2B)。相反，与Somah相比，UW在72小时时间点的乳酸水平显著(p<0.05)升高(图2C)。

由于在像我们这样的开放实验系统中，大气中氧在溶液中的溶解度与温度成反比，由于氧消耗遵循零级动力学，由于Somah和UW都在4°C与氧过饱和，pO₂始终是200±13 mmHg（图2D），不能明确证明肾脏利用肾脏利用。然而，与UW相比，其中PCO₂在整个存储过程中显著低于Somah组(1小时7.28±0.40 mmHg和72小时7.50±0.48 mmHg)，初始时的pCO显著增加₂(p<0.01)(从最初浸泡肾脏后的5.8±1.15 mmHg到17.00±0.45 mmHg)，并在72小时内持续保持高水平，表明从储存期开始氧化代谢就开始了(图2E)。必须指出，pCO₂，是溶解CO2的指示剂，在没有器官的情况下，在Somah或UW溶液中没有变化(未显示)。碳酸氢盐在Somah中的存在可能导致pCO的增加₂在72小时的储存过程中，HCO3-的浓度基本保持不变(4.86 mM/L)。相反，UW中HCO3—浓度在72小时内从6.30 mM/L下降到4.33 mM/L，这可能是导致pCO不显著增加的原因₂(图2 e)。

图2:图表显示了储存DCD肾脏的UW或Somah溶液在72小时内代谢参数的变化。(a) pH (b)葡萄糖(c)乳酸(d) pO₂和(e) pCO₂

储存肾脏的高能磷酸盐

UW肾组织ATP、磷酸肌酸(CP)和HEP总浓度在低温贮藏期间线性显著降低(p<0.05)。HEP在6小时内下降了20%(图3)，在72小时存储结束时净下降了45%。相比之下，在Somah肾脏中，ATP、CP和总HEP水平没有明显变化，ATP的任何下降都被CP浓度的平行增加所补偿，因此在储存期间肾组织中保持较高的总能量水平。

图3：在72小时体外保存期间，UW（左）和Somah（右）储存DCD肾脏中的能量代谢的改变。
*与时间0显着不同（P <0.05）

血管内皮功能的标记物

在Somah保存的DCD肾脏中，在整个保存期间，小穴蛋白、eNOS、vWF和EPO的表达都得到了很好的保存(图4)。相比之下，在uw保存的肾脏中，小穴蛋白的表达也没有改变，但eNOS、vWF和EPO的表达呈时间依赖性下降。表明可能有肾组织损伤

图4：图表显示了在UW或Somah溶液中保存72小时的DCD肾脏中，小泡蛋白、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、vWF和促红细胞生成素(EPO)蛋白表达的时间依赖性变化。

讨论

作为对缺血抵抗力最强的内部器官之一，使用死者肾脏(DCD)供体进行移植已在世界范围内广泛应用[11-13]。虽然DCD肾池仍然高度未被充分利用，但移植后DCD肾的预后与受体DGF、PNF发生率的显著增加和移植预期寿命的降低有关。我们目前的研究结果表明，通过使用Somah维持DCD肾脏在储存期间的能量水平，可以避免细胞水平的细微损伤;因此，可能的途径，以提高DCD肾储存和移植后预后。

我们的结果显示，UW保存的肾脏在UW灌注器官后的几分钟内呈现斑片状的变色区域，并在72小时的存储期间没有消退。相反，somah保存的肾脏在所有时间点的外部形态保持一致。由于羟乙基淀粉(HES;表1)(14、15)。虽然HES有助于防止储存期间器官水肿，但它会增加溶液密度，从而干扰器官所有部位的灌注。虽然大体形态不是器官活力的最佳指标，但在采集过程中，尽管使用了大量的溶液进行灌注，但由于UW粘度更大，肾脏灌注不均匀可能导致肾脏斑块性变色(图1)。

值得注意的是，肾组织病理学显示在UW或Somahstored肾的皮质或髓质区没有大体的超微结构改变。然而，高倍镜显示细胞核的细微变化，尤其是肾小管上皮细胞，其特征是核异色性丧失和增色性增加，在uw储存的肾脏中更明显。这与UW到达肾脏各部分的不足是一致的(见上)，而Somah在收获和体外储存期间有效地到达并为整个组织提供必要的营养，从而避免了小损伤的发展，并可能改善移植后的结果。有趣的是，尽管Somah组的肾组织耐受性更好，但与UW组相比，Somah组在所有时间点的酸碱性更强。虽然有报道称酸性pH值对肝细胞、窦状上皮细胞以及心肌细胞[16]有益，但据我们所知，这是第一个显示相对酸性环境有利于体外肾脏保存的报道。

有趣的是，葡萄糖作为高代谢肾组织的重要能量来源，被排除在当前使用的肾脏保存液之外，因为葡萄糖被认为是体外储存过程中无氧代谢的产物，它会增加乳酸积累，从而导致水肿[17,18]。UW是一种常用的储存肾脏的溶液，它也不含任何葡萄糖。然而，UW中内源性的葡萄糖水平升高(可能是由于肾糖原分解)以及Somah中相应的葡萄糖水平下降证明了葡萄糖是体外肾存储过程中重要的能量来源(表1)。即使在Somah长期存储肾脏后，我们也没有通过肉眼或组织学检查观察到水肿的发展，这与之前涉及其他溶液的研究相反[17,18]。

在72小时的肾储存后，UW显示有害乳酸水平大幅上升，在Somah的所有时间点都保持低水平(图2C)，尽管葡萄糖代谢(厌氧和有氧)，Somah肾脏组织HEP的相应维持(图3)。Somah肾脏的有氧氧化磷酸化活性是通过观察到的Somah在储存期间代谢CO2的增加来证实的。这是意料之中的结果;由于Somah还含有二氯乙酸(DCA)，一种增加丙酮酸脱氢酶复合物活性的化合物，从而提高丙酮酸向乙酰辅酶a的转化，防止乳酸[19]的积累;证实了我们对Somah储存的心脏和肝脏的观察[4- 8]。此外，DCA由于其保存血管的能力，可能有助于防止移植后肾动脉狭窄的发展，进一步改善移植DCD肾[20]的预后。

在贮藏过程中，外植器官的显著能量状态损失(HEP)导致器官[21]发生不可逆转的退行性变化。因此，保存液必须通过调节器官的代谢途径来维持器官的稳态和/或使其在延长储存期间恢复。尽管潜在glycogenolysis-dependent增加葡萄糖浓度在威斯康辛大学期间存储(图2 b),肾的重要消耗消息灵通的商店很明显,相比明显的能量状态保存在Somah肾脏(图3)。这表明,威斯康辛大学肾脏是高度分解,导致损失的玫瑰和组织损伤,(图1)相反，在somah储存的肾脏中，葡萄糖的氧化磷酸化作用更强，有利于产生更多的HEP(对于等量的葡萄糖分子)，这比仅通过厌氧糖酵解[22]更有利于器官在储存期间的能量状态。在DCD uw肾中观察到的低HEP水平至少可以预测移植物功能延迟(DGF)，甚至原发性无功能(PNF)。因此，尽管UW主要用作外植肾脏的保存溶液，但它可能不能为延长DCD(或BHD)肾脏的保存提供最佳条件。相比之下，在索马保存可能是一个可行的选择。

肾皮质组织主要由血管(毛细血管)构成，肾髓质主要为管状结构。在肾小球簇崩溃在6小时内存储Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate (HTK)解决方案已经报道[18],我们并没有发现如此激烈Somah或UW存储肾脏肾小球变化,在任何的计算(图1)。然而,一个稳定的表达下降以挪士(重要的血管舒缩功能),von- willebrand因子(vWF;血管内皮细胞标记物)和红细胞生成素(EPO;DCD肾在UW储存72小时时，提示血管[23]和管状结构[24]均受到轻微损伤(图4)。这与我们在UW储存的肾中观察到的管状核增色增加的组织学发现一致。相比之下，在somah保存的肾脏中，所有研究的蛋白(包括小泡蛋白、eNOS、vWF和EPO)的表达在相同的观察期间没有变化，这表明皮质和肾小管组织都得到了保存。

结论

随着需要肾移植的患者数量的增加，提高DCD肾的可用性和质量变得极其重要。虽然传统的保存技术仍然会导致移植后DCD器官功能的严重不足，但我们提供的初步证据表明，使用Somah静态保存DCD肾脏可能会降低DGF和PNF的发生率，并改善移植后移植肾的寿命。在我们的实验室观察成为临床现实之前，BHD和DCD Somah保存肾脏都需要进一步研究不同的存储和灌注条件，包括肾移植。

确认

我们非常感谢Diane Ghera, BS，和她的工作人员在动物饲养和准备手术动物方面的帮助。我们感谢Peter Hirsch医学博士在术前和术后给予的帮助。我们要感谢Aditi Thatte的鼓励和支持，感谢Frances Achee博士和Michael Charpak的行政支持。

参考

1. 戴维斯AE，Mehrotra S，Mcleroy LM，Friedewald JJ，Skaro Ai等。（2014）美国肾移植等待时间地理差异的程度与预测。移植97：1049-1057。［Ref。］
2. Rao PS, Ojo A(2009)肾脏移植的字母汤:SCD, DCD, ECD -实践肾病医生的基础。Clin J Am Soc Nephrol 4: 1827-1831。［Ref。］
3. Hoogland ER, Snoeijs MG, Van Heurn LW (2010) DCD肾移植:结果和改善结果的措施。器官移植15,177 -182。［Ref。］
4. Thatte HS, Rousou L, Hussaini BE, Lu XG, Treanor PR, et al.(2009)开发和评价一种新的解决方案，Somah，用于获取和保存跳动和不跳动的供移植心脏。循环20:1704 - 1713。［Ref。］
5. Lowalekar SK, Lu XG, Thatte HS(2013)进一步评价Somah:长期保存、温度效应和预防缺血-再灌注损伤的大鼠DCD心脏。移植过程45:3192-3197。［Ref。］
6. acta optica sinica, 2010, 31 (4): 566 - 566 . acta optica sinica, 2010, 31 (4): 566 - 566 . acta optica sinica, 2010, 31 (4): 566 - 566 . acta optica sinica, 2010, 31 (4): 566 - 566 . acta optica sinica, 2010, 31(4): 566 - 566。Am J Transplant: 2253-2262。［Ref。］
7. Lowalekar SK, Cao H, Lu X, Treanor PR, Thatte HS(2014)使用一种新型溶液SOMAH亚稳态保存供心脏移植:一项比较临床前研究。J心肺移植33:963-970。［Ref。］
8. Lowalekar SK, Lu X, Thatte HS (2011) Somah:一种用于移植的DCD腹部器官长期保存的新“解决方案”。移植新出现的问题-座谈会。克利夫兰诊所。摘要
9. (2014)一种新型器官存储液“somah”在低血量下延长肺保存:抢救、修复和功能评估。J心肺移植33:S71。［Ref。］
10. 高氯酸溶液对心肌组织中磷酸肌酸和三磷酸腺苷提取率的影响。肛门生物化学192:117-124。［Ref。］
11. Morrissey PE, Monaco AP(2014)循环死亡后的捐赠:当前的做法，持续的挑战，和潜在的改进。移植97:258 - 264。［Ref。］
12. Johnson RJ, Bradbury LL, Martin K, Neuberger J, UK Transplant Registry(2014)英国器官捐献和移植:来自英国国家移植登记处的一份报告。移植97:S1-S27。［Ref。］
13. Ishimura T, Muramaki M, Kishikawa H, Miyake H, Tanaka K, et al.(2014)心脏死亡后捐献肾移植中供体因素对早期移植物功能的影响。移植过程46:1064- 1066。［Ref。］
14. Collins GM, Wicomb WN(1992)新的器官保存解决方案。肾脏补充38:S197-S202。［Ref。］
15. Biguzas M, Jablonski P, Thomas AC, Walls K, Howden BO, et al. (1990) UW溶液对大鼠肾脏保存模型的评价。一、羟乙基淀粉和电解质组成的影响。移植49:872 - 875。［Ref。］
16. Lemasters JJ, Bond JM, Currin RT, Nieminen AL, Caldwell-Kenkel(1993)心脏和肝细胞再灌注损伤:缺血期间酸中毒和再灌注期间pH悖论的保护。在:Hochachka PW, Lutz PL, Sick TJ, Rosenthal M(编)存活缺氧:控制和适应机制。CRC出版社，佛罗里达495-508。［Ref。］
17. Kallerhoff M, Holscher M, Kehrer G, Klab G, Bretschneider HJ(1985)保存条件和温度对犬肾组织酸化的影响。移植485 - 489。［Ref。］
18. Kallerhoff M, Blech M, Kehrer G, Kleinert H, Langheinrich M, et al.(1987)葡萄糖在保护缺血性肾脏中的作用。Urol Res 15: 215- 222。［Ref。］
19. (1)二氯乙酸对肝移植患者乳酸性酸中毒的改善作用。麻醉学81:1127 - 1138。［Ref。］
20. (1)二氯乙酸对血管损伤动物模型血管再狭窄的预防作用。自然509:641 - 644。［Ref。］
21. 陈志强，陈志强(2002)低温保存的肝脏中atp的供应:一个长期被忽视的器官活力因素。肝脏病学36:1543 - 1551。［Ref。］
22. Krebs HA(1972)巴斯德效应及其与呼吸和发酵的关系。生物化学8:1-34。［Ref。］
23. Kwon O, Hong S, Sutton TA, Temm CJ(2008)保留管周毛细血管内皮的完整性和周细胞的增加可能对缺血后急性肾损伤的恢复至关重要。Am J Physiol Renal Physiol 295: F351-F359。［Ref。］
24. 红细胞生成素(EPO)在急性肾损伤中的作用。安重症监护室1:3。［Ref。］

在此下载临时PDF

文章信息

文章类型:研究文章

引用:曹华，Lowalekar SK, Lu XG, Treanor PR, Thatte HS(2016)心脏死亡后移植肾的生化评价和存储在新型溶液Somah:一项临床前研究。移植研究1(1):doi http://dx.doi。org/10.16966/trj.102

版权：©2016曹辉，等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

收到日期:2015年12月01

接受日期:2016年3月17日

发布日期：2016年3月22日