介绍
由于造血干细胞（HSC）具有自我更新能力和分化为所有血细胞谱系的潜力，因此被认为是造血系统的唯一来源[1-5]。尽管造血干细胞可用于治疗血液疾病和恶性疾病[6]，但其临床应用受到限制，主要原因是造血干细胞仅占骨髓（BM）细胞的一小部分，并且难以维持其自我更新能力体外并避免移植过程中HSC的免疫排斥[2,3]。
诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPS)可通过过度表达特定因子产生[7-9]，具有自我更新能力和分化为任何细胞类型的潜力;因此，这些细胞在疾病治疗[10,11]、药物筛选[12]、毒理学和再生医学[13]方面都有很大的价值。然而，iPS细胞的生成是耗时且低效的(0.001-0.1%)，最重要的是，涉及几个安全问题[14,15]。为了克服这些问题，研究人员开发了细胞直接转化的方法[16-18]。根据最近的报道，这些重编程过程产生各种中间细胞类型;例如，iPS细胞是体细胞重编程的产物之一。然而，这些重编程过程的最终结果取决于许多特定条件[18,19]。Bhatia的研究小组报道，人成纤维细胞可以通过结合转录因子(TFs)到造血调节区域[19]转化为多系血液祖细胞，他们的结果表明，Oct4作为一个谱系特异性的TF[18]。
此外，最近有报道称，四种转录因子Gata2、Gfi1b、c-Fos和Etv6的组合诱导内皮样前体细胞形成造血细胞。这些细胞表现出CD45+CKIT.+CD150+CD48-类似于LT-HSCS的表型[20]。然而，这些重编程细胞的造血潜力有限。另一个报告显示，Run1T1，HLF，LMO2，PRDM5，PBX1和ZFP37的组合促进血细胞转化为HSC，表明特定因素调节HSC的基因网络[21]。然而，随着血细胞是一种明显的细胞类型，MEF细胞转化为HSC的转化仍然是一个挑战。最近，发现FOSB，GFI1，RUNX1和SPI1在人脐静脉内皮细胞和人成年人皮肤微血管内皮细胞中的表达被发现诱导显示长期MPP活性的造血细胞[22]，尽管获得人类内皮细胞很难。相比之下，MEF可以轻松获得用于重新编程过程。LaCaud的组还证明造血转录因子诱导成纤维细胞转化为造血祖细胞。然而长期体内嫁接能力未显示为[23]。
由于对造血系统的深入了解和体细胞重编程研究的最新发现，促使我们研究小鼠体细胞是否可以通过结合造血干细胞特异性因子和多能性相关基因，重编程为造血祖细胞(HPCs)，并将这些转导的细胞在体外培养HSC-specific文化条件。在本研究中，我们能够生成lineage-c-Kit+Sca-1+(LKS)、长期HSC (LT-HSC;CD34-Flk2-CD150+CD48- LKS)、短期HSC (ST-HSC;CD34+Flk2-CD150+CD48-LKS)和MPP (CD34+Flk2+CD150-CD48-通过转染pMXs-Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc/Lmo2/c-Fos/c-Myb (pMXs-7TF MEFs)小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)[24,25]。pMXs-7TF MEFs成功分化为免疫细胞体外和体内。成功生成高性能造血干细胞很可能会解决与在个体患者中使用匹配的造血干细胞相关的主要困难，并且体外扩大造血干细胞的临床应用。
材料和方法
老鼠
C57BL/6J小鼠与同基因CD45.1+C57BL/6小鼠购自Jackson实验室(Bar Harbor, ME, http://www.jax.org)， Rag2-/- ii2 γg-/-小鼠(C57BL/6J X C57BL/10SgSnAi)购自Taconic Farms[26]。以hCD34转基因小鼠(C57B6)为材料，构建了含有完整hCD34基因和12.8 kb的5 '和25.6 kb的3 '侧翼序列的PAC克隆。所有小鼠都维持在特定的无病原体条件下，我们使用8至12周龄的雄性小鼠。所有实验均按照韩国生物科学与生物技术研究所(KRIBB)机构动物护理和使用委员会(KRIBB- aec -1德赢vwin首页网址3013)的指导方针进行。
细胞培养
HSCs（Lin-c-Kit+Sca-1+使用FACSAria流式细胞仪（BD Biosciences）从小鼠BM中分离LSK）或Lin-c-Kit+（LK）细胞。将pMX-7TF MEF和HSC在骨髓培养长期培养基中培养（ST05350，STEMCELL Technologies，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华）补充2微克/毫升吲哚美辛、20微克/毫升庆大霉素、30微克/毫升SCF、50微克/毫升Flt3L、20微克/毫升TPO和20微克/毫升IL-6。所有细胞因子均从PeproTech（美国新泽西州洛基山）购买。MEF细胞在含有10%胎牛血清（HyClone）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。
MEF制剂
MEFS由13.5天的怀孕小鼠制备，用于1-2段通道。除去小鼠的头部和内部器官，将躯干切碎并在37℃下以0.1％胰蛋白酶（Hyclone）分散在0.1％胰蛋白酶（Hyclone）中。将细胞培养两次百分点（被认为是一代），然后通过冷冻。这些MEFS用于所有后续实验。MEF在含有10％胎牛血清（Hyclone）的DMEM中维持，并在达到汇合后以1：3的稀释培养亚培养。培养少于三个通道的MEFS用于PMXS-7TF MEFS生成和饲养细胞准备。
逆转录病毒感染
Oct 3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、LIM domain only 2 (Lmo2)、c-Fos、c-myeloblastosis (c-Myb)和c-Jun用pMXs载体进行转导。从Addgene中获得表达Oct 3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的pMXs质粒。Lmo2、c-Fos、c-Myb和c-Jun片段均来自21C Frontier Human Gene Bank (KRIBB)。将c-Fos、c-Myb和c-Jun导入pMXs质粒BamHI/HindIII位点，获得表达Lmo2的pMXs质粒;Lmo2被引入pMXs的BglII/HindIII位点。铂- e逆转录病毒包装细胞(plate - e cells, Cell Biolabs Inc.，[28])以6 × 10的剂量接种在6孔板上5.第二天，使用Lipofectamine和PLUS试剂（Invitrogen）将pMXs逆转录病毒载体转染这些细胞根据制造商的说明。四小时后，用含有10%FBS的5mL DMEM替换培养基，并在37°C的培养箱中培养细胞。48小时后，收集培养基作为第一种含病毒的上清液，并用新鲜培养基替换。24小时后，第二种含病毒的超滤过物收集游泳液。使用0.45μm纤维素过滤器（微孔）过滤病毒，并将等量的病毒混合，并在4g/ml聚布伦（Sigma-Aldrich）存在下转移到MEF。该感染过程每12小时重复一次，共三次。
诱导HPC
pMXs-Oct 4/Sox2/ Klf4/c-Myc/Lmo2/c-For/c-Myb共感染MEFs 3 d，产生HPCs。感染后隔天，细胞以1 ~ 2 × 10的倍数移栽5.细胞每孔0.1%明胶涂层六孔板含有丝裂霉素C (Sigma-Aldrich)处理MEF喂养细胞。将细胞置于含有HSC细胞因子(2µg/ml消炎痛、20µg/ml庆大霉素、30 ng/ml SCF、50 ng/ml Flt3L、20 ng/ml TPO和20 ng/ml IL-6)的Myelocult长期培养基(ST05350, STEMCELL Technologies, Vancouver, British Columbia, Canada)中培养。14-21天后，用100µl移液管采菌落。将菌落在37℃下用胰酶- edta (Hyclone SH30042.01)处理15min，将菌落分成小块。在MEF喂养细胞中重新播种菌落。菌落在含HSC细胞因子的髓鞘长期培养基中培养。为了确保HPCs的生成，将菌落进行HSC标记(c-Kit)染色+,本来就+，CD34+/-，Flk2+/-, CD150+/-，CD48+/-，缺乏谱系标记)，并通过流式细胞仪进行分析。为了确认HPCs的生成，我们进行了PCR和western blot分析。为了验证逆转录病毒介导的候选基因过表达，通过RT-PCR检测候选基因和GAPDH基因的mRNA水平。
流式细胞术
用CD34、FLK2、hCD34、CD48、CD150、CD117和Ly6a抗体在4℃下染色30 min，分析HSC标记物的表达情况。采用生物素化抗小鼠Mac-1 (CD11b)、Gr-1 (Ly6C)、t -119、NK1.1、CD2和B220的混合物进行谱系染色。为了区分供细胞和受体细胞，使用CD45.1和CD45.2的抗体，供细胞用CD45.2抗体染色，受体细胞用CD45.1抗体染色。使用抗Gr-1、Mac-1和Ter- 119的抗体分析骨髓和红细胞标记物的表达情况。这些抗体购自BD Biosciences或eBiosciences。数据使用FACSCanto流式细胞仪(BD Biosciences)生成，并使用FlowJo软件(ThreeStar, Ashland, OR, USA)进行分析。
蛋白质印迹分析
细胞在含有1 mM EDTA、1 mM EGTA、20 mM Tris-HCl、10 mM NaCl、1%Triton X-100、30 mM焦磷酸钠、25 mMβ-甘油磷酸、1 mM Na的裂解缓冲液中裂解3.VO4.和1mm PMSF。裂解液经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，分离蛋白转移到PVDF膜(Millipore)上，0.1%染色朱红色年代的解决方案。用5%脱脂乳或牛血清白蛋白阻断后，用anti-c-Kit (Abcam, Cambridge, MA, USA)、anti-CD150 (Abcam, Cambridge, MA, USA)或anti-actin (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA)抗体孵育膜。
逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和定量RT-PCR（QPCR）
用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA。RT-PCR分析:利用M-MLV逆转录酶和oligo (dT) 15引物(Promega, Madison, WI, USA)将每个RNA逆转录为cDNA。然后用Emerald Amp PCR Master Mix (Takara)对该cDNA进行扩增，并根据生产商的方案用SYBR Premix Ex Taq (Takara)进行qPCR。所有RT-PCR和qPCR数据均归一化至GAPDH表达水平。引物序列见补充表1。
集落形成细胞(CFC)测定
为了进行CFC测定，使用Methocult M3434培养基（StemCell Technologies）。首先，将0.4ml PMX-7TF MEF加入到含有适当细胞因子的4ml甲基纤维素的培养基中，并且管被涡旋，以确保细胞与培养基混合。将细胞混合物温育5分钟;然后，将1.1ml混合物作为液滴插入30毫米的培养皿中。将细胞在37℃下在5％CO中孵育2.在95%的湿度下保存14天3、7、14 d后，用40倍放大的倒置显微镜对菌落进行形态学评估和计数。
染色染色
为了进一步分析细胞的分化和增殖，收集细胞并在冷PBS中重悬。然后用Cytospin离心机将细胞转移到玻片上进行Giemsa染色。用甲醇固定细胞2分钟，用吉氏染色液(Sigma)染色4分钟。将载玻片转移到磷酸盐缓冲液中，用水冲洗。待载玻片完全干燥后，以滴状涂抹安装液，覆盖载玻片。显微照片是在1000倍的放大倍数下拍摄的。
体外NK细胞从pMXs-7TF MEFs分化
HSC的NK细胞分化基本上如前所述[29]。简言之，HSC或pMXs-7TF MEF接种在12孔板中，并在含有10%热灭活FBS、消炎痛（2µg/ml，西格玛）、庆大霉素（20µg/ml）、SCF（30 ng/ml，PeproTech）、Flt3L（50 ng/ml，PeproTech）和IL-7的RPMI 1640培养基中培养（0.5 ng/ml，PeproTech）培养7天以产生前体自然杀伤（pNK）细胞。然后收集pNK细胞，重新播种并在IL-15（50 ng/ml，PeproTech）存在下培养6天以产生成熟自然杀伤（mNK）使用抗CD3e和抗NK1.1抗体通过FACS分析确定mNK细胞的纯度。
体外pMXs-7TF MEFs的髓系分化
为了分化髓系细胞，将pMXs-7TF-MEF和转染pMXs对照载体的MEF接种在12孔板中，并在RPMI 1640培养基中培养，该培养基中添加10 ng/ml IL6、10 ng/ml GM-CSF、10 ng/ml G-CSF、50 ng/ml SCF、20 ng/ml IL3和10 ng/ml BMP4。两周后，我们观察到pMXs-7TF-MEF能够分化为髓系。为了通过FACS分析髓系标记物的表达，用抗Mac-1和抗Gr-1抗体对细胞进行染色。
细胞毒性分析
使用如前所述的Calcein-AM释放测定（Invitrogen）评估NK细胞死亡。简而言之，用偶尔振荡在37℃下在5μg/ ml的Calcein-AM中在5μg/ ml的Calcein-AM中孵育1小时。洗涤后，将细胞在指定的效应子下涂覆：靶细胞（E：T）比在96孔圆底板中，并在37℃下孵育4小时。孵育后，收集100μl上清液，使用荧光板读取器（激励过滤器485nm，发射过滤器530nm，Berthold，德国）分析板。
重组分析
对于竞争性重组测定，采用MEF (cd45.2+, 5 × 104.)或LK细胞(CD45.2+, 5 × 104.)将来自pMXs-7TF的MEF或BM细胞与整个BM细胞（1×10）混合6.)从C57BL/6 (cd45.1+)然后，将这些混合物静脉注射到8周大的C57BL/6 CD45.1小鼠体内+致死性γ辐射(9gy)的同基因小鼠。连续骨髓移植(BMT)采用供者来源的骨髓细胞(3 × 10)6.）从受体中注射到第二组受体小鼠中（CD 45.1+16岁)th第一次BMT后一周。收集外周血并通过FACS分析，以确定供体来源细胞的再增殖百分比。根据16岁时在BM中鉴定供体来源HSC阳性细胞，确认成功的pMXs-7TF MEFs移植th第二次移植后一周。这些移植受体维持在特定的无病原体条件下。
统计分析
除非另有说明，数据以平均值±标准偏差值表示。为了比较两组，我们使用PRISM软件（美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行了双尾配对t检验，并使用Microsoft Excel进行了双尾配对学生t检验。小于0.05的p值被认为是显著的。
结果
重新编程mef生成hpc
为了生成HPCs，我们根据早期基因表达序列分析(SAGE)数据集(补充图1A)[30]的结果选择候选基因。SAGE数据集显示，c-Jun (J)、Lmo2 (L)、c-Fos (F)、c-Myb (B)和c-Myc (M)在造血干细胞中的表达高于自然杀伤细胞(NK)。已知这些tf在淋巴系的发展中发挥作用。为了证实这些候选基因在HSCs (LKS细胞)中的表达增加，我们通过RT-PCR分析验证了这些候选基因在HSCs中的mRNA水平。如图1B所示，与其他细胞类型如mef和pNK、mNK细胞和胚胎干细胞(ES)细胞相比，这些基因在hsc中表达水平升高。接下来，将这些候选基因与Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc (OSKM)等多能性相关基因结合，使用基于pmxs的逆转录病毒系统应用于mef。流式细胞分析显示，RFPpositive MEF细胞占90%以上(Supplementary figure 1C)，每个基因在MEF中都特异过表达(Supplementary figure 1D)。
为了重编程，将候选基因转导到MEF喂养细胞上，并在长期HSC培养基(Myelocult, M5300)中培养，该培养基缺乏白血病抑制因子(LIF)，这是一种在小鼠ES细胞[31]中自我更新维持中起关键作用的化合物。培养14-21 d后，采菌落，在添加吲哚美辛、庆大霉素和SCF、Flt3L、TPO、IL-6等造血细胞因子的长期HSC培养基中，接种于MEF喂养细胞上。为了确保生成HPCs，我们对菌落进行了HSC标记的染色，并通过FACS进行分析。总体方案如图1A所示。对候选基因的各种组合进行测试，以确定转导的最佳基因(补充图2A)。菌落的数量取决于哪些基因与OSKM结合。组合如OSKML、OSKMF、OSKMB、OSKMLF、OSKMLB、OSKMFB和OSKMLFB诱导菌落形成(补充图2B)。特别是OSKMLFB组合产生了最多的菌落(补充图2C)，并产生了不同的LKS细胞群体(补充图2D)。因此，我们选择OSKMLFB组合(pMXs-7TF)作为最优重编程条件。图1B显示了对照MEFs (pMXs)、pMXs- 7tf MEFs和原始造血干细胞的形态。 The pMXs-7TF MEFs exhibited a round morphology that was similar to that of primitive HSCs. Transduction with pMXs-7TF increased the number of formed colonies compared to transduction with pMXs (Figure 1C). Next, to define the emergent hematopoietic cells, we examined the time-course of gene expression during pMXs-7TF MEFs generation. After transduction, the cells were harvested at the indicated times, and HSC marker expression was analyzed via qPCR. The expression of fibroblast-specific genes, such as Vim and Acta2, decreased gradually (Figure 1D and supplementary figure 3A), but the expression of HSC-specific markers, including c-Kit, Sca-1, CD150, CD45, Il3ra and Csf3r [20], increased in cells transduced with pMXs-7TF (Figure 1E and supplementary figure 3B). Western blot analysis confirmed that c-Kit and CD150 were highly expressed in the pMXs-7TF MEFs compared with the control pMXs-transduced cells (Figure 1F).
图1：使用七个因素将MEF重新编程为HPCSs。(一)显示pMXs-7TF MEF重编程过程的示意图。MEF被逆转录病毒感染共三天。第一天之后，病毒感染的MEF被重新接种在丝裂霉素C处理的MEF饲养细胞上。细胞在补充了几种造血细胞因子的骨髓培养长期培养基中培养。14-21天后，col在24孔板中拾取并重新播种。(B)亮场显微照片，显示用pMXs控制载体或pMXs-7F载体和HSC转导的细胞的形态。在pMXs-7F处理的细胞中检测到小圆细胞（白色箭头）。原始放大倍数：200倍和320倍。(C)用七种转录因子表达（PMXS-7TF）载体或PMXS对照矢量转导MEF。感染后14-21天计数菌落数。误差栏代表S.D.（n = 3）;* P <0.05与PMXS转导的MEF相比。(D)成纤维细胞相关基因(Vim和Acta2)在pmxs - 7tf转导的mef中的相对表达水平。转导的MEF或菌落在MEF喂养细胞上重新播种后的0-6周(W)收获。通过qPCR评估目的基因表达，并将其归一化到GAPDH表达水平。用造血干细胞作为对照。（E）用7种转录因子表达载体(pMXs-7TF)转染mef。转导后，在指定的时间收获细胞，并分析HSC标记物的表达。造血干细胞或胚胎干细胞作为对照。通过qPCR评估目的基因的表达，并将其归一化到GAPDH水平。所有的实验都独立地重复至少三次，误差条代表标准差。（F）HSC标记物表达的时间过程分析。通过Western blot分析确定c-Kit、CD150和β-肌动蛋白的表达。（-）表示pMXs控制载体转导细胞；（+）表示pMXs-7TF转导细胞。
图2：pMXs-7TF MEF的多能容量体外．(一)在Flt3L、SCF和IL-7的作用下，将hsc或pMXs- 7TF mef与丝裂霉素c处理的OP9细胞共培养6天，观察其向NK细胞分化的能力。6天后，在IL-15的存在下再培养6天，生成mNK细胞。然后用抗cd3和抗nk1.1抗体对细胞进行染色。通过FACS分析确定CD3e-NK1.1+亚型的表型。评估门控淋巴细胞群中NK细胞的百分比。将造血干细胞作为阳性对照。(B)pMXs-7TF MEFs或pmxs转导MEFs来源的mNK细胞的细胞毒性。mNK细胞以E:T比值(10:1,5:1,2.5:1或1.25:1)孵育于calcein- am标记的Yac-1细胞中。4小时后，收集上清，使用荧光平板阅读器(485 nm激发，530 nm发射)检测平板。所有实验都独立重复至少三次。(C)诱导pMXs-7TF MEFs髓系分化体外pMXs-7TF-mef维持在含有多种细胞因子的髓系培养基中。两周后，用抗Mac-1和抗Gr-1抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。(D)CFC图像和来自pMXs-7TF转导细胞的CFU形成的相对频率。左面板显示CFU-E、CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM菌落的图像。原始放大倍数：40倍。右面板显示菌落形成的相对频率。显示了三个独立实验的代表性结果。（E）第14天pMXs-7TF mef中Methocult菌落的Giemsa染色。原来放大:1000 x。(F-H)流式细胞术测定细胞群的分化状态。红色的细胞（F），髓样细胞（G）和B细胞(H)。14天后，收集Methocult菌落，用谱系特异性抗体染色。
为了验证多能性的承诺，我们检测了多能性标记在指定时间点的表达模式。Oct4、Sox2和Klf4总水平呈时间依赖性下降，在hsc中高表达的c-Myc在pMXs-7TF mef和hsc中表达水平升高(补充图4A)。在pMXs-7TF mef中，Oct4和Sox2的内源性表达低于ES细胞(补充图4B)。Nanog和E-Ras是多能细胞的标记物，在pMXs-7TF MEFs中以基础水平表达(补充图4C)。综上所述;这些发现表明pMXs-7TF MEFs重编程过程不需要iPS细胞的生成。
为了进一步分析细胞表型，我们检测了转导细胞的表面抗原表达。LKS细胞、长期HSC、短期HSC和MPP（CD34+Flk2+CD150-CD48-在pMXs-7TF mef中检测到来自单个菌落的细胞群。如图5A-5B所示，Sca-1，而不是c-Kit，在pMXs对照载体转导的mef中表达。Sca-1在多种细胞中表达，包括间充质干细胞、心肌细胞和成纤维细胞[32,33];这种广泛表达解释了在pmxs转导的细胞中检测Sca-1的原因。尽管pMXs-7TF MEFs中的表面抗原表达与原始造血干细胞中的不完全相同，但pMXs-7TF MEFs显然包含一个LKS细胞群。接下来，我们进行qPCR，比较pMXs-7TF MEFs、hsc和ES细胞之间的基因表达谱(补充图5C)。这些HSC标记物在pMXs-7TF mef中的表达水平与HSC相似。接下来，我们进行RT-PCR分析。如补充图5D所示，在HSC中高表达的HSC表面标记物，如c-Kit、sa -1、CD150和CD34，以及转录因子，如c-Jun、Lmo2、c-Fos、c-Myb和Trim28，在我们的pMXs-7TF mef和HSC中均强表达。Nanog在pmxs - 7tf转导的细胞中不表达。 In addition, the protein levels of these factors were verified via Western blot analysis. As expected, c-Kit and CD150 were expressed in the pMXs-7TF MEFs (Supplementary figure 5E), and these results were verified via immunocytochemistry using antibodies against SSEA (a pluripotent cell marker), c-Kit and Sca-1 (Supplementary figure 5F). The HSC surface markers c-Kit and Sca-1 were highly expressed in pMXs-7TF MEFs and HSCs, but SSEA was not expressed in pMXs-7TF MEFs. Taken together, these results demonstrated that pMXs- 7TF MEFs display similar molecular characteristics to primitive HSCs. To determine whether these pMXs-7TF MEFs continually expand and maintain their HSC properties体外pMXs-7TF-MEFs在长期HSC培养基中培养2个月。我们发现LKS细胞群在培养两个月后仍然存在（补充图5G）。
分化势评估体外
接下来，我们通过测量pMXs-7TF mef分化为淋巴和髓系谱系的能力，检查了它们的多效性。为了证实淋巴谱系的分化，我们使用两步法从pMXs-7TF mef中生成NK细胞体外分化方案[34]。如图2A所示，pMXs-7TF MEF可分化为CD3e NK 1.1+原始HSC中观察到的mNK细胞，这些细胞对其他NK细胞标记物呈阳性，如DX5（补充图6A）[35]。然后，我们检查了来源于pMXs-7TF MEFs的mNK细胞的细胞毒性。来源于pMXs-7TF MEFs的mNK细胞（补充图6B）显示出针对Yac-1肿瘤细胞的细胞毒性活性，而PMX转导的细胞没有显示出这种活性（图2B）接下来，为了验证pMXs-7TF MEF向髓系的分化，将细胞培养在含有多种细胞因子的分化培养基中，包括IL6、GM-CSF、G-CSF、SCF、IL3和BMP4。两周后，我们观察到pMXs-7TF MEF分化为Gr-1+Mac-1+髓系（图2C）。为了确定pMXs-7TF-转导细胞的特异性造血潜能，我们使用补充有重组细胞因子（M3434）的甲基纤维素基培养基进行CFC测定。红系集落形成单位（CFU-E）、粒细胞巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）、红系爆发形成单位（BFU-E）和粒细胞-红系巨噬细胞巨核细胞集落形成单位（CFU-GEMM）集落成功地从pMXs-7TF MEFs中衍生出来（图2D）。基于CFC分析获得的菌落用Giemsa染色，大多数菌落形成细胞表现出粒细胞和巨噬细胞谱系特征（图2E）。为了进一步验证这些谱系的身份，使用针对Mac-1和GR-1（髓系，图2F）、Ter119（红系，图2G）和B220（淋巴系，图2H）的抗体对基于CFC分析的菌落进行染色。我们发现这些细胞表达髓系和红系标记物。这些结果证实了这些pMXs-7TF-MEF的集落形成潜能和多向分化能力。
pMXs-7TF MEFs的功能特性体内
造血干细胞在移植到接受骨髓消融术的受者体内后，对于造血重建至关重要[3,36,37]。为了研究这些pMXs-7TF MEF对造血系统的再生能力，我们将重组细胞培养在MEF喂养细胞上。2-3周后，pMXs-7TF MEFs中的LK细胞(CD45.2+)或BM (HSC, CD45.2+)与同类竞争者(BM, CD45.1)进行分选移植+)进入致死γ辐照同源小鼠(CD45.1+)．16周后，我们通过FACS分析重建的细胞群(图3A)。为了验证供者来源的细胞在血液中的植入，我们收集了移植后5周、9周和12周的外周血。与bm来源的LK细胞(HSC)相似，pMXs-7TF MEFs来源的LK细胞(pMXs-7TF)在外周血中表现出重建能力(图3B-3C)和供者来源的CD45.2+在移植受体小鼠的BM中检测到LKS细胞群+)免疫细胞，包括NK细胞、T细胞和B细胞(图3D和补充图7A)。
为了证实这些细胞的重组特性，将pMXs-7TF-MEF移植到不含可检测NK1.1的Rag2/II2G双基因敲除小鼠体内+NK细胞或Thy1+T细胞[38]。移植后9周，NK1.1+DX5+NK和CD4+CD8+在pMXs-7TF MEFs-和HSC移植受体小鼠的脾脏中观察到T细胞（图3E和补充图7B）。正如先前的报告所示，Oct 4可以诱导人类成纤维细胞的血祖细胞直接转化，并且这些细胞可以分化为髓系，但不能分化为淋巴细胞[19]，我们检测了移植来源于pMXs-7TF MEF或BM细胞的LK细胞（CD45.2）的受体小鼠（CD45.1）中是否存在髓系细胞。我们发现CD45.2+Gr-1+Mac-1+受体BM中可见髓系细胞(图3F和补充图7C)。这些数据表明pMXs-7TF mef具有向淋巴系和髓系分化的潜力。
为了证实这些pMXs-7TF mef再生造血系统的能力，我们进行了一系列BMT。pMXs-7TF MEFs中的LK细胞(CD45.2+)或BM (HSC, CD45.2+)与同类竞争者(BM, CD45.1)进行分选移植+)进入经致死辐照的同源小鼠(CD45.1+在第一次骨髓移植后16周，来自受体的供者来源的骨髓细胞被注射到次级受体小鼠(cd45.1)+)（图4A）。在每次BMT后16周，通过FACS收集和分析外周血（PB），以确定供体来源细胞的再填充百分比（图4B和补充图8A）.在第二次BMT后16周，我们通过FACS分析重组细胞群。首先，为了验证移植后4周、8周、12周和16周时，我们收集了PB（图4C和补充图8B）。类似于BMLK细胞（HSC）pMXs-7TF-MEFs衍生的LK细胞通过PB中的B细胞和髓系细胞的程度表现出多谱系重建（图4D-4E和补充图8C）。此外，供体衍生的CD45.2+在移植受体小鼠的骨髓中检测到HSC群体(图4F和补充图9A)。Donor-derived (CD45.2+)在受体小鼠中观察到免疫细胞，包括NK细胞、T细胞、B细胞和髓系细胞（图4G，补充图9B和9C）。这些数据表明pMXs-7TF MEF具有分化为淋巴系和髓系的潜力。
图3:pMXs-7TF MEF的多能容量体内．(一)竞争重构试验的实验设计。照射后的CD45.1同源小鼠用5 × 10移植5.来自供者来源的BM (CD45.2)或pMXs-7TF MEFs (CD45.2)的LK细胞与竞争细胞(CD45.1, 1 × 106.)．16周后，采用流式细胞术检测供体来源LKS、NK、T和B细胞的频率。(B)在骨髓移植后5周、9周和12周采集外周血，测定供者来源细胞的百分比。误差柱代表标准差(n=4)。(C)采用流式细胞术分析外周血中的D细胞（CD45.2+）。(D)Donor-derived (CD45.2+)受体BM中的LKS、NK、B或T细胞（CD45.1+)。误差柱代表标准差(n=4)。*p<0.05， **p<0.01。；参见补充图7。（E）pMXs-7TF MEFs移植到Rag2 KO小鼠体内。9周后，将野生型小鼠(C57BL/6J, WT)、Rag2 KO小鼠(pMXs)、HSC移植小鼠(HSC)或pMXs- 7tf MEFs移植小鼠(pMXs- 7tf MEFs) Rag2 KO小鼠安乐死并进行流式细胞术分析。左侧为NK细胞，右侧为T细胞。；参见补充图7。误差柱代表标准差(n=3)。从三个重复实验中的一个中给出了有代表性的结果。（F）确认骨髓细胞群的产生体内，我们证实了CD45的存在+GR-1+Mac-1+供体来源细胞中的细胞群。LK细胞(5 × 105.)从iHSCs或BM细胞移植到致死性照射的同源小鼠（CD45.1）中。9周后，供体来源的髓样细胞（CD45.2+(CD45.1+). ; 另见补充图7。误差条表示s.d.（n=3）。
图4:pMXs-7TF MEF系列BMT。(一)BMT系列实验设计。照射后的CD45.1同源小鼠用5 × 10移植5.来自供体来源的BM（CD45.2）或pMXs-7TF MEF（CD45.2）的LK细胞与竞争细胞（CD45.1,1×106.)在第一次BMT后16周，供体来源的BM细胞（3×106.)注入第二组受体小鼠(cd45.1 +)。(B)在第一次和二次BMT后16周收集PB，测定供体来源细胞的百分比;参见补充图8。(C)为了验证供体来源的细胞在血液中的植入，我们在继发性骨髓移植后4、8、12和16周收集PB。(d e)在第二次BMT后16周，提示人群的PB重建。供体嵌合表现为供体细胞的百分比。（F-G）Donor-derived (CD45.2+）HSC群体，NK，T，B和髓样细胞在受体BM中（CD 45.1+)第二次BMT测定后16周时；另见补充图9。误差条表示标准差（n=3）。*与HSC相比，p<0.05和**p<0.01
hCD34在小鼠LT-HSC中的表达
进一步证实pMXs-7TF-MEFs的重组能力,我们使用转基因小鼠(tg)携带hCD34轨迹和12.8 kb 5和25.6 kb的3 '侧翼地区,这是必要的直接hCD34表达只在LT-HSCs[27],这样pMXs-7TF mef再生可以监控基于hCD34表达式。从hCD34 tg小鼠获得的mef被转导到携带候选基因Oct 4, Sox2, Klf4, c-Myc, LMO2, c-Fos和c-Myb的逆转录病毒。从hCD34 tg衍生的mef中获得pMXs-7TF mef后，分析HSC标记物的表达。如图补充图10A, hCD34所示+在LT-HSC群体中观察细胞。然后，我们进行qPCR和RT-PCR以验证hCD34和HSC标记基因的表达。如预期的那样，c-Kit、Sca-1、CD150和hCD34在pMXs-7TF-转导细胞中高表达；然而，hCD34在pMXs-转导野生型或hCD34 tg-MEF、ES细胞或HSC中不表达（补充图10B和10C）。这些结果证实pMXs-7TF MEF在hCD34基因表达方面与原始HSC相似。
讨论
在这项研究中，我们证明MEF可以通过表达Lmo2、c-Fos、c-Myb、Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc转化为小鼠HPC。首先，重新编程的pMXs-7TF MEF表达HSC表面标记物，如c-Kit和Sca-1，它们产生可检测的长期HSC、短期HSC和MPP细胞群。其次，我们研究的pMXs-7TF MEF重新维护体外期的延长。为了确定pMXs-7TF MEFs是否能长期扩增，我们将pMXs-7TF MEFs培养在含有造血细胞因子的Myelocult长期培养基中。两个月后，我们观察到LKS细胞群仍然存在于pmxs - 7tf转导的细胞中。第三，pMXs-7TF mef的基因表达谱与原始造血干细胞几乎相同。HSC表面标记物(c-Kit, Sca-1, CD34和CD150)和转录因子(c-Jun, Lmo2, c-Fos, c-Myb, c-Myc和Trim28)在pmxs - 7tf转导的细胞中强烈表达，尽管多能细胞标记物SSEA, Nanog和E-Ras在这些细胞中未检测到。第四，pMXs- 7TF mef显示出分化为多个谱系的潜力体内和体外．当pMXs-7TF MEFs注射到致死辐照的同源或免疫缺陷小鼠时，它们表现出强大的重建能力。此外，pMXs-7TF MEFs分化为淋巴系和髓系，具有不同的功能。综上所述，这些结果表明pMXs-7TF MEFs可以使用特定基因进行重编程，而不需要产生iPS细胞，这些pMXs-7TF MEFs显示出HPCs的表型和功能特征。
根据SAGE数据集，HSC中c-Jun、Lmo2、c-Fos、c-Myb和c-Myc的表达选择性升高。这些转录因子是调节HSC特性（如自我更新和分化潜能）所必需的。c-Myc是HSC分化和存活的重要转录因子之一[39,40]并调节HSC自我更新和分化之间的平衡[41]。Lmo2和c-Myb对HSC的发育至关重要[42-44]，尤其是Lmo2对于促进胚胎成纤维细胞的造血命运至关重要[23].c-Fos是AP-1转录因子的成员，与c-Jun蛋白复合物调节AP-1结合基因的表达[45]。AP-1转录因子在造血前体细胞发育为成熟血细胞（包括粒细胞单核细胞和红系细胞）过程中发挥多重作用[46,47].c-Fos在HSC中高度表达[48]，对HSC中的细胞生长和G0/G2转换非常重要。根据最近的研究，c-Fos促进内皮细胞和造血基因表达[20]在本研究中，我们鉴定了一组HSC特异性转录因子，在Oct4、Sox2和Klf4存在的情况下诱导MEF转化为HPC。
综上所述，hsc特异性转录因子如Lmo2、c-Fos、c-Myb与多能相关基因Oct 3/4、Sox2、Klf4、c-Myc结合，可诱导mef直接转化多能ihsc。目前的研究表明，ihsc具有分化为免疫细胞和造血重建的潜力体内．从患者自身的体细胞中成功生成iHSC将有助于多种疾病的治疗，并可用于替代造血干细胞。这种方法将加速iHSC生成作为一种患者特异性造血干细胞再生平台技术的临床应用。
确认
作者非常感谢Daniel G. Tenen(哈佛医学院)提供了hCD34转基因小鼠。这项工作得到了研发融合计划(No。CRC- 15-02-KRIBB)，科学、信息和通信技术与未来规划部GRL项目(FGM1401223)，韩国保健技术研发项目(A121934)，保健和福利部，KRIBB研究计划，韩国。
作者的贡献
H.Y.S.设计了实验并撰写了论文。h.y.s.， h.w.s.， y.k.k.， W.K.和S.Y.进行了实验。E.L.产生hCD34转基因小鼠。e.l.、h.j.、S.R.Y、t.d.k.和y.j.p提供了批评意见。I.C.监督了这个项目并撰写了论文。
利益冲突披露
作者声明没有相互竞争的经济利益。
