摘要

客观的：

目的:验证人类和犬的牙龈间充质干细胞具有相似的干细胞特性，以及低强度脉冲超声(LIPUS)增强了这些特性的假设。

方法:

分离人、犬牙龈间充质细胞(HGMCs和CGMCs)，扩增后分为2个亚组，1个亚组用LIPUS处理20分钟，另1个亚组作为对照组。利用超声装置应用LIPUS，产生30 mW/cm的空间平均时间平均强度²．脉冲为1.5 MHz，脉冲重复频率为1 kHz。24小时后，收集细胞，用流式细胞仪检测干细胞标记物CD11b;CD14;CD34;CD45;CD73;CD90和CD105。在常规α - DMEM或成骨培养基中培养。进行碱性磷酸酶分析、DNA分析和MTT分析。

结果:

流式细胞术分析表明，对照和脂肪处理的犬CGMC仅适用于CD90和干细胞标记物的其余部分的阴性。然而，与非唇脂处理的CGMC相比，CD90表达减少（5％）。另一方面，HGMCs显示比CGMCs更高的CD73，CD90和CD105表达。此外，脂肪增强了这些干细胞标记物在HGMC中的表达。MTT在常规或成骨培养基中以HGMC升高，而其在骨质发生介质中仅在CGMC中增加。当在具有或不含唇血的骨质培养基中培养时，ALP在HGMC中显着增加。CGMC和HGMC关于DNA表达的差异。

结论:

无论是否应用LIPUS, HGMCs都比CGMCs表现出更多的多能潜能，特别是在成骨培养基中培养时。

关键词

牙龈干细胞;低强度脉冲超声(LIPUS);小猎犬的狗;人类

介绍

在过去的几十年里，牙科地区的研究一直专注于干细胞疗法和组织工程。干细胞疗法和/或组织工程需要足够数量的干细胞对治疗缺陷组织或器官或用于组织工程师丢失或缺陷的器官。干细胞治疗和/或组织工程中的挑战之一是干细胞资源的可用性。与颅面组织工程中的骨髓间充质细胞相比，最近研究了牙龈干细胞作为替代来源[1]。近年来近年来，与其他使用细胞治疗或组织工程，由于其可用性和其隔离技术中没有多少侵入性[1-5]，近年来近年来近年来受到了极大的关注。以前的研究表明，机械应力在不同类型的细胞中诱导生物学效应[6,7]。最近，在人类颅面积的再生潜力方面，低强度脉冲超声（LIPUS）是一种在人类颅面积的再生潜力的广泛研究。已被证明唇膏对不同类型的细胞具有合成代谢效应，包括粘液，牙周炎韧带细胞，牙龈细胞，皮肤成纤维细胞，肌肉细胞，软骨细胞，滑膜细胞，骨膜细胞，骨髓干细胞和人脐驯化的间充质干细胞[2-4,8-​​22]。到目前为止，没有关于超声波在比格犬牙龈牙龈干细胞的影响的报道。翻译研究假设当与人类患者体验类似的治疗方式时，动物中的实验结果反映在人类中。 In reality, there are many differences in treatment responses between animals and in human. Therefore, it is not usually expected that a positive treatment outcome in animals would produce similar effect in human. For this particular reason. The aim of this study was to compare the effect of LIPUS on canine (Beagle dogs) and human gingival stem cells.

材料和方法

比格犬和人类的牙龈细胞

从7只比格犬(beagle dog, CGMCs)和10例人类患者(HGMCs, human patients, HGMCs)中分离到牙龈间充质干细胞。作为加拿大埃德蒙顿阿尔伯塔大学先前批准的动物护理方案的一部分，从比格犬的牙龈中分离出cgmc。此外，根据阿尔伯塔大学批准的人类伦理规程，从人类牙龈组织中分离牙龈干细胞。牙龈间充质干细胞的分离方法已有报道[2,6]。细胞要么接受MEMα介质(αMEM: 450毫升,胎牛血清(的边后卫):50毫升,青霉素和链霉素:5毫升,玫瑰:10更易)或成骨的介质(DMEM: 450毫升,胎牛血清(的边后卫):50毫升,地塞米松:10 nM, B-Glycerophosphate: 10更易与抗坏血酸:50 mg / l,玫瑰:10更易,青霉素和链霉素:5 ml)，分别给予或不给予LIPUS处理。细胞在37°C和5% CO下孵育₂然后扩展10天，直到P4和培养基每3-4天更换一次。所有检测都在三个不同的井中进行了三次，每次检测共9个读数。组间比较采用单因素方差分析，土耳其采用SPSS (Version 22)统计软件包(SPSS, Chicago, IL, USA)进行后处理。

利普斯疗法

细胞扩增后，将细胞播种于12孔板上，播种后一天，用LIPUS处理20分钟，共1天。LIPUS使用定制的LIPUS设备(SmileSonica Inc.， Edmonton, Canada)，该设备产生1.5 MHz脉冲，脉冲重复频率为1 KHz，强度为30 mW/cm²换能器表面积。使用超声凝胶从下方和培养箱中施用于细胞培养板上的脂肪（Smilesonica Inc.，Edmonton，Canada）。

细胞生存能力

如前所述，MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)测定用于评估细胞活力[2,21]。简单地说，将100 ml MTT溶液(以5 mg/ml溶解在汉克平衡盐溶液(HBSS)中)加入每孔含有0.5 ml基本培养基(Dulbecco 's Modified Eagle medium (DMEM))、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素(Invitrogen公司，Carlsbad, CA, USA)的细胞。

2小时后，用2ml二甲基亚砜取代培养基，以溶解形成的MTT福马赞晶体。然后，在570 nm处测定吸光度，用于评价细胞活力[2,23]。

使用流式细胞术进行免疫表型分析

为了识别HGMC或CGMC的细胞表面标记物，使用FITC标记的抗体，即CD11b、CD14、CD34、CD45、CD73、CD90和CD105，通过流式细胞术分析检测相应结合位点的存在[24]CD14和CD11b在单核细胞和巨噬细胞上显著表达，最有可能在MSC培养物中发现的细胞，CD34-R-藻红蛋白（它标记原始造血祖细胞和内皮细胞），CD45-藻红蛋白（是一种泛白细胞标记物），CD73（被称为外5'核苷酸酶，最初由单克隆抗体SH3和SH4识别）、CD90（Thy1）R-藻红蛋白和CD105（被称为内皮胶蛋白，最初由单克隆抗体SH2识别）[24]（R-PE，BD Bioscience，Mississauga，ON，Canada）。FITC共轭同型小鼠IgGa1和PE共轭同型小鼠IgGk1用作二级抗体（对照抗体）。使用运行Cell Quest软件（Becton Dickinson，Missisauga，ON，Canada）的FACS can流式细胞仪采集并分析10000个标记细胞。

ALP / DNA测定

ALP被认为是矿化开始前活性最高的膜结合酶，也是成骨/成骨细胞分化的生化标志物[2,21,22]。细胞用HBSS洗涤，用ALP缓冲液(0.5 M 2-氨基-2-甲基丙烷-1-醇和0.1% (v/v) Triton X-100;pH值10.5)。裂解1小时后，在96孔板中加入100 ml裂解液(重复)，并在裂解细胞中加入100 ml 2 mg/ml ALP底物对硝基苯酚磷酸盐(pNPP) (Sigma, St.Louis, MO)，使最终浓度为1 mg/ml的pNPP。在405 nm处以20 min为周期间隔测量吸光度。根据形成的p-NPP产物(对硝基苯酚;在mmol/min/ml)，并与DNA含量归一化得到特定的ALP活性(ALP/DNA)。根据制造商的说明，使用CyQUANT DNA试剂盒(Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA)测定裂解液的DNA含量。用CyQUANT试剂盒提供的DNA标准品进行校正，测量各组细胞的DNA浓度。使用荧光平板阅读器(美国维诺斯基，VT，美国BioTek Instruments公司生产的ELx 800通用平板阅读器)对DNA进行定量(激发波长为480 nm;发射波长为527 nm)。

结果

脂肪对细胞活力的影响

采用MTT法检测LIPUS对CGMCs和HGMCs活力的影响。在成骨培养基中，LIPUS可显著提高MTT在CGMCs和HGMCs中的吸光度(P<0.005)。而α培养基处理CGMCs时，LIPUS对MTT的吸光度无明显差异。相比之下，通过LIPUS, HGMSCs的MTT吸光度显著增加(P=0.031)(图1A和B)。与CGMCs相比，各组HGMSCs的MTT值均有统计学意义(图1C)。

LIPUS对细胞标志物表达的影响

与那些表现出与干细胞相似行为的HGMCs相比，具有干细胞标记物(+ve到CD73, cd90, CD105， -ve到CD11b, CD14, CD34和CD45)的门控标记细胞，CGMCs没有CD73或CD105的+ve表达。然而，CGMSCs与HGMSCs在其他所有标记的表达均相似。在CGMCs中(图2A和2B)， LIPUS不影响-ve对CD11b、CD14、CD34、CD45、CD73或CD105的反应。然而，LIPUS使CD90标记的门控CGMCs的平均百分比降低了5% (P<0.05)。另一方面，LIPUS增加了CD73 (P<0.005)、CD90和CD105 (P<0.001)标记的门控HGMCs均值(图2b)。

LIPUS对ALP/DNA的影响

对比HGMCs和CGMCs的ALP、DNA和ALP/DNA比值，与HGMCs相比，CGMCs各参数均显著降低(图3A、3B和3C)。LIPUS降低了成骨培养基中HGMCs的ALP和ALP/ DNA比值，差异无统计学意义(图3A和3C)。此外，无论是α培养基还是成骨培养基，LIPUS都没有改变cmcs中ALP和DNA的浓度(图3A和3B)。虽然LIPUS增加了cmcs中ALP/DNA的比例，但这种增加并不具有统计学意义(图3C)。

图1:CGMC在α和成骨培养基中的MTT吸光度比较。***=P<0.001。

图1B：CGMC在α和成骨培养基中的MTT吸光度比较。***=P<0.001。

图1c：在alpha和成骨培养基中，CGMCs和HGMCs的MTT吸光度比较。* * * = P < 0.001。

图2:LIPUS应用前后HGMCs的流式细胞术比较。** = p <0.005， *** = p <0.001。

图2 b:LIPUS应用前后CGMCs的流式细胞术比较。* = P < 0.05。

讨论

虽然有假设认为人牙龈成纤维细胞可能被用于细胞治疗和组织工程，但研究这些细胞的细胞表面标记物以将其视为间充质干细胞是合乎逻辑的。虽然以前的报告显示这些细胞具有一些干细胞表面标记[4]，但这些标记需要更多的研究，以确认或丢弃它们作为潜在的干细胞。前人研究表明，LIPUS对人牙龈成纤维细胞[2]具有合成代谢作用。然而，尚不清楚LIPUS是否会改变这些干细胞在CGMCs和HGMCs中的表面标记。因此，我们的研究目的是检测LIPUS对HGMCs的影响。此外，在转译研究中，比格犬等高级动物被认为是临床前实验的理想动物模型。因此，了解cgmc是否具有干细胞标记也很重要，如果是，LIPUS对这些干细胞表面标记有什么影响也很重要。我们的研究首次评估了CGMCs中的间充质干细胞标记物，以及应用LIPUS对这些标记物的影响，以及细胞活力(通过MTT评估)、ALP、DNA活性/浓度。细胞活力实验表明，LIPUS能提高HGMCs和CGMCs的MTT吸光度。这反映出LIPUS对两种细胞类型都没有显示出任何有害影响。 This is in agreement with previous studies [2,11-15,19,26,27]. Our study showed that beagle dogs’ gingival mesenchymal cells lack the expression of CD73 and CD 105. Previous position paper reported that in order to identify cells as mesenchymal stromal cells and have pluripotent characteristics, these cells must be expressing CD73, CD90 and CD105 more that 95%. The lack of expression of CD73, CD105 by CGMSCs suggest that CGMCs cells cannot be identified or considered as potential stem cells as they fail to have these important criteria. In addition, CGMCs expression of CD 90 was 50% without LIPUS and 45% with LIPUS. Regardless the decreased CD90 expression by LIPUS in CGMCs, these cells at the current time may not be considered as stem cells. Also, HGMCs, although showed expression of CD73, CD90 and CD105, these markers expression in our study was lower than 95%. Although LIPUS increased CD73, CD90 and CD105 expression, one LIPUS application did not increase the expression of these markers to the 95% level that can make these cells considered as stem cells. Future studies may be aimed at changing LIPUS parameters in order to increase the expression of these markers to the 95% level. It is to be noted that previous study showed an anabolic effect of LIPUS on human gingival fibroblasts, this anabolic effect was noted mainly after 3-4 weeks [2]. In our study, LIPUS application was for one time only based on other previous studies that applied LIPUS to different cells for one application [14,26,27]. Future studies may evaluate these effects on longer effect on both types of cells. Our results also showed no effect of ALP, DNA or ALP/ DNA ratio. This is in agreement with previous studies during the first week of their studies [2,13]. Future studies may be conducted to evaluate these effects on long term basis (1,2,3 and 4 weeks) with different LIPUS application times (5,10,15 and 20 minutes).

图3:应用LIPUS前后alpha和成骨培养基中CGMCs和HGMCs的ALP检测比较* * * = P < 0.001。

图3 b:应用LIPUS前后α和成骨培养基中CGMC和HGMC之间DNA测定的比较。***P<0.001。

图3 c:比较应用LIPUS前后alpha和成骨培养基中CGMCs和HGMCs的ALP/DNA比值。* * * = P < 0.001。

结论

对于短期申请，血脂增强了HGMC在常规和骨质培养基中的细胞活力，仅在骨质发生介质中的CGMC。HGMSCs的人干细胞标志物的唇脂显示出来，而Lapus的表达降低了GMCs（CD90）的唯一阳性干细胞标志物。CGMCs具有比HGMC的稳定性分化潜力较低。

确认

这项研究由卡塔尔国家研究基金（NPRP09-557-3-144）资助。

参考文献

1. 李洪波，李洪波，李洪波(2001)牙龈和牙周韧带成纤维细胞表达骨相关大分子。牙周病杂志36:31 -141。[参考。］
2. Mostafa NZ, Uludağ H, Dederich DN, Doschak MR, El-Bialy TH(2009)低强度脉冲超声对人牙龈成纤维细胞的合成代谢影响。Arch Oral Biol 54: 743-748。[参考。］
3. Shiraishi R，Masaki C，Toshinaga A，Okinaga T，Nishihara T，等。（2011）低强度脉冲超声暴露对牙龈细胞的影响。J Surgontol 82：1498-1503。[参考。］
4. El Bialy T，Alhadlaq A，Wong B，Kucharski C（2014）超声对牙龈干/祖细胞神经分化的影响。Ann生物医学工程42:1406-1412[参考。］
5. Mostafa NZ, Uludağ H, Varkey M, Dederich DN, Doschak MR, et al.(2011)体外诱导人牙龈成纤维细胞骨再生。Open Dent J 5: 139-145。[参考。］
6. 松田，横山K，竹下S, Watanabe M(1998)表皮生长因子及其受体在体外机械应力诱导人牙周韧带细胞分化中的作用。Arch口腔生物学43:987-997。[参考。］
7. Cowan KJ，Storey KB（2003）有丝分裂原活化蛋白激酶：在细胞对环境胁迫的反应中起作用的新信号通路。J Exp Biol 206:1107-1115[参考。］
8. Harle J, Salih V, Mayia F, Knowles JC, Olsen I(2001)体外超声对骨和牙周韧带细胞生长和功能的影响。超声医学生物学27:579-586。[参考。］
9. El Bialy T，Alhadlaq A，Lam B，（2012）治疗性超声对牙科和牙周组织工程用人牙周膜细胞的影响。打开凹痕J 6:235-239。[参考。］
10. Saito M，Fujii K，Tanaka T，Soshi S（2004）低强度和高强度脉冲超声对MC3T3-E1成骨细胞胶原翻译后修饰的影响。钙化组织Int 75:384-395[参考。］
11. 周S，Schmelz A，Seufferlein T，Li Y，Zhao J，等。（2004）低强度脉冲超声在人皮肤成纤维细胞中的分子机制。J Biol Chem 279：54463-54469。[参考。］
12. Dalla-Bona DA, Tanaka E, Oka H, Yamano E, Kawai N, et al.(2006)体外超声对成骨水泥代谢的影响。超声医学生物学32:943-948。[参考。］
13. Dalla-Bona DA, Tanaka E, Inubushi T, Oka H, Ohta A, et al.(2008)低强度和高强度超声培养成骨水泥细胞刺激。Arch Oral Biol 53: 318-323。[参考。］
14. Inubushi T, Tanaka E, Rego EB, Kitagawa M, Kawazoe A, et al.(2008)超声对成骨质细胞增殖和分化的影响。牙周病79:1984-1990。[参考。］
15. Nakamura T, Fujihara S, Katsura T, Yamamoto K, Inubushi T, et al.(2010)低强度脉冲超声对il -1β刺激滑膜细胞透明质酸合成酶和透明质酸酶表达和活性的影响。安生物工程38:3363-3370。[参考。］
16. Rego EB, Inubushi T, Kawazoe A, Tanimoto K, Miyauchi M, et al.(2010)超声刺激通过EP2/EP4受体途径诱导PGE2合成，促进成骨质细胞分化。超声医学生物学36:907-915。[参考。］
17. Nagata K, Nakamura T, Fujihara S, Tanaka E(2013)超声调节炎症反应，促进受伤肌肉的再生。安生物工程41:1095-1105。[参考。］
18. Iwabuchi Y, Tanimoto K, Tanne Y, Inubushi T, Kamiya T, et al.(2014)低强度脉冲超声对下颌骨髁突软骨细胞环氧合酶-2表达的影响。J口腔面部疼痛头痛28:261-268。[参考。］
19. Lim K, Kim J, Seonwoo H, Park SH, chung PH, et al.(2013)体外低强度脉冲超声刺激对牙组织工程用人牙槽骨源性间充质干细胞成骨分化的影响。Biomed Res Int 2013: 269724。[参考。］
20. (2014)低强度脉冲超声刺激促进人牙周韧带细胞成骨分化。PLoS One 9: e95168.[参考。］
21. 梁国强，张WH，张超，李坤明，Lo HK(2004)低强度脉冲超声刺激人骨膜细胞成骨活性。临床整形相关Res 418: 253-259。[参考。］
22. Yoon JH, Roh EY, Shin S, Jung NH, Song EY，等(2009)将脉冲低强度超声引入人脐带来源间充质干细胞的培养。莱特31:329-335。[参考。］
23. Issa Y，Brunton P，Waters CM，Watts DC（2008）通过线粒体脱氢酶活性评估金属离子对人少突胶质细胞和人牙龈成纤维细胞的细胞毒性。Dent Mater 24:281-287[参考。］
24. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, et al.(2006)定义多功能间充质间质细胞的最低标准。国际细胞治疗学会立场声明。Cytotherapy 8: 315 - 317。参考。］
25. 骨中矿物质的形成机制。实验室投资60:320-330。[参考。］
26. 血管内皮生长因子与成牙细胞样细胞:低频超声刺激。Arch Oral Biol 54:185-191.[参考。］
27. al - daghreer S, Doschak M, Sloane AJ, Major PW, Heo G, et al.(2013)低强度脉冲超声对离体三维牙培养的短期影响。超声医学生物学39:1066 -74.[参考。］

在这里下载临时PDF

条信息

Aritcle类型:研究文章

引用:El Bialy T，Kucharski C，Farid M，Ghaffar KA，Fawzi E，et al.（2015）人类和狗的牙龈干细胞是不同的。Int J干细胞研究1（1）：doihttp://dx.doi.org/10.16966/2472-6990.103

版权:©2015 El Bialy T等人。这是一篇根据知识共享署名许可证条款发行的开放获取文章，允许在任何媒体中不受限制地使用、发行和复制，前提是原始作者和来源均已获得授权。

出版的历史:

收到日期:2015年6月24日

接受日期:2015年7月15日

发表日期:2015年7月22日