摘要

背景

有报道称，透明质酸(HA)为基础的水凝胶可提高鼠模型移植后干细胞的存活率。在这里，我们在一个大动物模型中测试了HA血清水凝胶(通过自体血清交联HA合成)封装MSCs的效果。我们在猪慢性心肌缺血模型中进行了目前的研究，通过向慢性缺血心肌中注射含水凝胶和不含水凝胶的MSCs，来比较移植后几个时间点的细胞存活情况。

方法

自体间充质干细胞分别在缺血区域(4周前在左旋动脉近端应用缩窄动脉形成)的标记区域注射水凝胶或不注射水凝胶。细胞移植后2、4、6、12周处死动物2只，进行组织病理学检查。

结果:

与没有水凝胶注射的区域相比，水凝胶包裹的间充质干细胞移植在短期内促进了移植细胞在注射区域的滞留，并刺激了血管生成。值得注意的是，尽管在注射的水凝胶中间充质干细胞分散均匀，但间充质干细胞离开水凝胶并迁移到周围的心肌。这表明一旦注射，MSCs对宿主组织有更强的亲和力。

结论

在大型动物模型中，ha血清水凝胶包裹的MSCs心肌移植早期增强了心肌细胞滞留，促进了血管生成。基于这些结果，为了优化ha血清水凝胶在细胞治疗中的应用，有必要进一步研究跨壁梗死心肌的囊化细胞递送。

关键字

水凝胶;间充质干细胞;慢性心肌缺血

介绍

在动物实验和临床心肌缺血或梗死患者中，间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)被广泛应用于细胞治疗以改善心脏功能[1-6]。然而，移植后的细胞滞留和存活问题仍然是基于细胞的治疗的主要障碍。目前的研究重点是干细胞基因操作[7,8]或利用水凝胶[9-12]等材料，以提高移植后细胞的存活率和归巢。

透明质酸(HA)是心肌细胞外基质的主要成分之一。细胞通过细胞表面受体CD44和CD168与HA结合，这两种受体在细胞粘附和运动中起重要作用[10-12]。HA降解产物在血管生成[10]中发挥作用，这是心脏再生的机制之一。羟基琥珀酰亚胺(NHS)修饰HA的羧基，生成HA-NHS基团。这些HA-NHS基团与血清中的胺基团以及细胞和组织反应形成酰胺键。水凝胶将干细胞包裹并粘附在组织上。HA:血清水凝胶可通过心肌内注射或心外膜应用于心脏干细胞移植。我们之前的工作表明，透明质酸(HA)为基础的水凝胶可以提高啮齿动物模型移植后干细胞的存活率。在这里，我们测试了HA血清水凝胶(通过将HA与自体血清交联合成)包埋MSCs的效果，通过将有或没有水凝胶的MSCs注射到猪慢性缺血心肌模型中，目的是评估移植干细胞在移植后几个时间点的存活情况

材料和方法

动物

实验方案经国家心肺血液研究所动物保护与使用委员会批准，调查符合国家心肺血液研究所动物保护与使用委员会规定实验动物的护理和使用指南(国家科学院出版社，1996，华盛顿特区)。选用8头初重15-20公斤的约克郡家猪进行试验。所有的动物都被关在笼子里，并允许自由获得水和商业猪粮。

研究设计

如图1所示，8只动物在全身麻醉下进行小切口左胸，并在左旋动脉近端周围放置ameroid括约肌，如前所述建立慢性心肌缺血模型[5,6]。在第一次手术中，采集骨髓(15毫升)体外MSC扩张。4周后，对每只动物进行第二次左开胸手术，暴露旋回区域(缺血区)，在一个标记区域注射体外扩增的MSCs，在另一个标记区域注射MSCs加水凝胶，均在缺血区。在注射后的第2、4、6和12周，分别处死2只动物，取心脏并切片。采用H & E染色、抗von Willebrand因子抗体和平滑肌肌动蛋白免疫组化染色检测有无水凝胶注射的细胞命运和血管生成作用。

骨髓间充质干细胞的制备与培养

采用与前面所述相同的方法制备和培养骨髓源性间充质干细胞[5,6]。对MSCs进行CD标记、核型分析和各自的多能分化能力检测。

改性透明质酸的制备与贮存

以10 w/v% HA (MW 16 kDa;LifeCore Biomedical)的67 w/v% 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC;Sigma)和25 w/v% n -羟基琥珀酰亚胺(NHS;Sigma)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，如前所述[9]。

自体猪血清收集

术前用血清管采集猪外周血。血清分离:1500rpm离心10min。

水凝胶的制备

以10 w/v%的HA- nhs溶解在PBS中，与猪血清按1:1.5的比例混合制备HA- Ser水凝胶。所有聚合都是在p^H7-7.4室温下静置5分钟。将细胞悬浮在适量的血清中，将HA溶于PBS中。两种组分混合30秒后，用粘性吸管将最终体积为600µl的水凝胶转移到0.5 mL无菌注射器的桶中。我们选择了600µl的血清与HA的比例为1:1.5，以获得注射用水凝胶的最佳粘度和最大的粘附性。为了确保移植后NHS组的功能，将HA溶解在PBS中5min内合成水凝胶。

图1:实验时间轴展示了放置ameroid，只注射MSCs或MSCs加水凝胶，动物安乐死和实验结束时的组织学评价。

单纯间充质干细胞移植和间充质干细胞加水凝胶移植

自体骨髓间充质干细胞(1.2 × 10⁸)的制备和洗涤，如前所述[5,6]。将间充质干细胞悬浮在2.4 ml生理盐水中，并等量分成两份。1次(仅MSCs, 6 × 10⁷)，在左心肌缺血区缝线标记区域(12个注射点，每个注射点100µl)用25号针(注射深度0.5 cm)心肌内注射。将这些间充质干细胞与如上所述的新鲜制备的水凝胶混合，以同样的方式注射到缺血区另一个标记区域。

组织和免疫组织化学分析

在注射后2、4、6和12周，每个时间点处死2只动物。在缺血区域内，分别仔细切断仅MSCs和MSCs加水凝胶标记区域。切除标本周围组织，切成4块。每个切片进一步切成3份5 × 5mm厚的切片，或收集在磁带中，用10%缓冲福尔马林固定石蜡包埋，或在OCT中冷冻切片不固定。石蜡包埋切片用苏木精、伊红和三色马尾松染色进行形态学分析。采用小鼠单克隆抗人抗体进行免疫组化或免疫荧光染色。一抗孵育后，检测与抗小鼠IgG结合的异硫氰酸酯或罗丹明的荧光，细胞核用4 '，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)标记。

结果

动物结局和存活

水凝胶包膜的间充质干细胞移植后未见不良反应。2只动物在放置ameroid后1-2周因大面积心肌梗死而意外死亡(1只动物死于严重的外科伤口感染，另1只动物死于尸检确定的放置ameroid后肺水肿)。本初步研究未发现与细胞注射后相关的动物死亡。8只动物活了下来，并按计划实施了安乐死。

组织学分析

在这项大型动物模型研究中，我们发现水凝胶包被的间充质干细胞移植与早期仅注射的间充质干细胞相比，可以促进移植细胞在注射区滞留，促进血管生成。在注射后2周，水凝胶注射区域显示了比仅注射间充质干细胞区域更多的细胞聚集的证据。在MSC +水凝胶移植组中，MSC向靠近周围心肌的细胞簇周围迁移(图2)。尽管在注射前水凝胶和细胞分散均匀，但这种迁移仍然发生。这表明一旦注射，MSCs在宿主组织附近表现出更多的聚集。此外，在较晚的时间点，与仅注射MSC相比，水凝胶组仍可见更多的细胞团块(图3和图4)。

水凝胶降解:注射后，水凝胶凝固，在2周时间点可以在H&E染色切片上看到白色区域(图2)。重要的是，在4周时几乎没有注射水凝胶的证据(图3)，这归因于降解。

纤维化:我们观察到，与只注射MSC相比，水凝胶注射区域的纤维化更大(图3和图4)——差异在6周和12周最显著。12周时，纤维化程度明显加重，肉眼可见，单MSC和单MSC加水凝胶注射区差异显著(图5和图6)。

图2:注射后2周，水凝胶注射区细胞团块(A,B,C)多于单纯MSC注射区(D,E,F)。细胞团块中央可见凝固的水凝胶(箭头在A和B)，注射的细胞迁移到细胞团块边缘(箭头在B)。放大倍数为AD=10X, BE=50X, CF=200X。

图3:4周时，水凝胶逐渐吸收(A,B箭头)，但与单纯注射MSC相比，注射区域纤维化更严重。在D中，黑色箭头表示注射的细胞团，白色箭头表示用于标记注射的缝线。放大倍数为AD=10X, BE=50X, CF=200X。

炎性细胞浸润、血管生成:每隔2周和4周，在含水凝胶区域也观察到炎症细胞浸润。在注射后2、4、6和12周，我们对冷冻切片进行了VIII因子和平滑肌肌动蛋白的免疫荧光染色。在水凝胶注射的动物中，在2周时，在球形细胞簇周围出现了增加的毛细血管密度，这是由阳性的VIII和SMA染色提示的。这些差异在以后的时间点变得不那么明显(图7)。

评论

自从细胞疗法作为一种刺激缺血性心脏病治疗性血管生成的方法在世纪之交被引入以来[13-23]，最佳的细胞递送技术一直是一个备受争议的话题。冠状动脉内灌注最初尝试用于缺血性冠状动脉疾病患者[3,13-18]。这种做法的主要限制是需要在细胞输注期间和输注后几秒钟内阻碍冠状动脉血流，这可能导致再灌注后细胞被冲洗出来。同样，静脉输注异体间充质干细胞导致大部分移植细胞包封在肺而不是心脏，正如[4]成像所报道的。研究人员还尝试使用特殊的注射装置[20,21,24]，或在心脏直视手术[2]中直接注射心外膜。这部分解决了细胞归巢到目标组织的问题。然而，在注射到跳动的心肌后，细胞滞留并不理想。因此，人们研究了以多糖为基础的策略，试图创造一个友好的环境，以增加细胞在分娩后的存活和保留[9-12]。研究者认为，细胞外基质的缺乏是分娩[25]后细胞滞留减少的主要原因之一。

图4:6周时，水凝胶注射区纤维化明显增加。与单纯MSC注射组相比，水凝胶组仍可见更多的细胞团块。箭头表示细胞团块，箭头表示纤维化组织。放大倍数为AD=10X, BE=50X, CF=200X。

图5:12周时，水凝胶注射区显示大面积的纤维化组织。箭头所指的是其中一个纤维化区域。放大倍数AC=100x, BD=200x。

图6:12周时，水凝胶注射区可见大面积纤维化组织，肉眼可见。白色箭头表示组织块中的纤维化区域，从标记的注射区域中切割出来，显示出间充质干细胞单独注射和间充质干细胞加水凝胶注射区域之间的显著差异。

透明质酸，或称透明质酸，是细胞外基质的重要组成部分的几种多糖之一[10-12]。由于透明质酸具有很强的黏度并能保持水分，因此在组织内稳态和生物力学完整性方面发挥着非常重要的作用。我们将HA与血清(一种我们称为水凝胶的产品)一起使用，在带有心球源性细胞(cdc)的急性心肌梗死啮齿类动物模型中，发现这些水凝胶可以在注射部位停留长达4周。水凝胶包封CDC可促进心肌梗死[9]后的存活和增殖，改善左心室射血分数。

在目前的研究中，我们在猪慢性心肌缺血模型中测试了水凝胶的作用，以观察MSC和水凝胶移植后，细胞保留和存活是否在几个时间点改善。我们发现，水凝胶在早期显著增加了细胞滞留，促进了血管生成，但水凝胶也引起了大量的纤维化，从第4周开始，12周达到高峰。我们仔细比较了这些结果与我们的啮齿动物模型，没有引起明显的纤维化，因为注射心肌瘢痕组织。在大型动物研究模型中，我们将水凝胶注入缺血但存活的心肌中，由于水凝胶滞留在心肌中，可能导致注射道心肌细胞的破坏。因此，水凝胶注射到存活心肌可能会因注射后水凝胶凝固而引起心肌损伤，且需要较长时间才能被吸收。水凝胶注射引起的纤维化是否对左心室功能有影响尚不清楚。功能研究有必要进一步描述缺血心肌中囊化细胞输送的益处。这些研究可能为ha血清水凝胶是否在注射干细胞中具有协同效益提供更明确的数据，并可能进一步优化ha血清水凝胶在细胞基础治疗中的使用。虽然将注射的干细胞分化成有功能的心肌细胞是细胞基础疗法的最终目标，但一些研究表明移植后细胞分化不良。可能的解释包括细胞移植不良、存活不足和增殖不足。

图7:仅MSC和MSC+水凝胶注射后2、4、6和12周冰冻切片中因子VIII（绿色）、平滑肌肌动蛋白（SMA）（红色）和DAPI（蓝色）的免疫荧光染色。在水凝胶注射的动物中，2周时球形细胞簇周围的阳性因子VIII和SMA染色显示毛细血管密度增加。这些差异在后来的时间点变得不那么明显。白色箭头表示细胞簇。放大倍率为100倍。

致谢

作者特别感谢他们在NHLBI动物医学和外科实验室的同事，感谢他们在动物外科研究中的协助。

参考文献

1. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, et al.(1999)成人间充质干细胞的多系潜能。科学。284:143 - 147。［Ref。］
2. (1)自体成体干细胞移植与充血性心脏损伤的相关性研究。J胸心血管外科杂志130:1631- 1638.e2。［Ref。］
3. 陈少林，方文文，叶芳，刘玉华，钱军，等(2004)冠脉内移植自体骨髓间充质干细胞对急性心肌梗死患者左心室功能的影响。心脏杂志，94:92-95。［Ref。］
4. (2009)急性心肌梗死后静脉注射成人间充质干细胞(Prochymal)的随机、双盲、安慰剂对照、剂量递增研究。J CollCardiol。54: 2277 - 2286。［Ref。］
5. Zhou Y, Wang S, Yu Z, Hoyt RF Jr, Sachdev V, et al.(2009)直接注射自体间充质干细胞改善心肌功能。生物化学学报。39:902-907。［Ref。］
6. 关键词:骨髓基质细胞，异体移植，缺血心肌，血管系统安胸外科，91:1206-212。［Ref。］
7. Jo J, Hong S, Choi WY和Lee DR(2014)细胞穿透肽(CPP)偶联蛋白是操纵人类间充质基质细胞的有效工具。Sci代表4:4378。［Ref。］
8. zhao J, Song H, Park SG, Lee SH, Ko JJ, et al.(2012)通过细胞穿透肽介导共激活因子相关精氨酸甲基转移酶1蛋白在细胞浆内传递调控人间充质干细胞分化潜能。干细胞。30:1703-1713。［Ref。］
9. 等(2012)透明质酸-人血水凝胶用于干细胞移植。生物材料33:8026 - 8033。［Ref。］
10. Gerecht S, Burdick JA, Ferreira LS, Townsend SA, Langer R, et al.(2007)透明质酸水凝胶用于控制人类胚胎干细胞的自我更新和分化。美国国家科学院院刊104:11298-11303。［Ref。］
11. Toole BP(2001)透明质酸在形态发生中的作用。Semin Cell Dev Biol 12: 79-87。［Ref。］
12. Toole BP(2004)透明质酸:从细胞外黏液到细胞外线索。癌症4:528-39。［Ref。］
13. asmus B, Schächinger V, Teupe C, Britten M, Lehmann R, et al.(2002)急性心肌梗死(TOPCARE-AMI)中祖细胞移植和再生增强。循环106:3009 - 3017。［Ref。］
14. Britten MB, Abolmaali ND, Assmus B, Lehmann R, Honold J, et al.(2003)急性心肌梗死(TOPCAREAMI)患者冠状动脉内祖细胞治疗后的梗死重构——来自连续增强磁共振成像的机制观察。发行量108:2212 - 2218。［Ref。］
15. Schächinger V, Assmus B, Britten MB, Honold J, Lehmann R，等(2004)急性心肌梗死祖细胞移植和再生增强- TOPCARE-AMI试验一年的最终结果。J Am CollCardial 44:1690-1699。［Ref。］
16. 作者简介:王志强，男，河北人，博士，主要研究方向为自体冠状动脉内单核骨髓细胞移植修复心肌梗死。发行量106:1913 - 1918。［Ref。］
17. Strauer BE, Brehm M, Zeus T, Bartsch T, Schannwell C，等(2005)慢性冠状动脉疾病患者冠脉内自体骨髓细胞移植再生心肌的研究。J Am Coll Cardial 46: 1651-1658。［Ref。］
18. Wollert KC, Meyer GP, Lotz J, Ringes-Lichtenberg S, Lippolt P, et al.(2004)心肌梗死后冠脉内自体骨髓细胞移植:BOOST随机对照临床试验。《柳叶刀》364:141 - 148。［Ref。］
19. Meyer GP, Wollert KC, Lotz J, Pirr J, Rager U, et .(2009)心肌梗死后冠状动脉内自体骨髓细胞移植:随机对照BOOST试验5年随访。Eur Heart J 30: 2978-2984。［Ref。］
20. Perin EC, Dohmann HF, Borojevic R, Silva SA, Sousa AL, et AL .(2003)经心内膜自体骨髓细胞移植治疗严重慢性缺血性心力衰竭。发行量107:2294 - 2302。［Ref。］
21. Fuchs S, Baffour R, Zhou YF, Shou M, Pierre A, et al.(2001)经心内膜移植自体骨髓增强慢性实验性心肌缺血猪侧支灌注和局部功能。J Am Coll Cardiol 37: 1726- 1732。［Ref。］
22. 引用本文:Fuchs S, Satler LF, Kornowski R, Okubagzi P, Weisz G, et al.(2003)无选择的晚期冠状动脉疾病患者的导管自体骨髓心肌注射:可行性研究。J Am Coll Cardial 41: 1721-1724。［Ref。］
23. Kang HJ, Kim HS, Zhang SY, Park KW, Cho HJ, et al.(2004)冠状动脉内灌注粒细胞集束刺激因子动员的外周血干细胞对心肌梗死冠脉支架置入术后左心室收缩功能和再狭窄的影响:MAGIC细胞随机临床试验。《柳叶刀》363:751 - 756。［Ref。］
24. 关键词:猪心肌梗死，间充质干细胞，经皮心肌内输送，左室功能，骨髓单个核细胞开展5:196 - 205。［Ref。］
25. 王成春，陈超，林伟文，黄明明，谢家平，等(2008)心肌内直接注射间充质干细胞片改善心肌梗死后心脏功能。心血管研究77:515-524。［Ref。］

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条信息

文章类型:研究文章

引用:(2015)水凝胶在猪慢性心肌缺血模型细胞治疗中的作用。Int J Stem Cell Res 1 (1): doi http://dx.doi。org/10.16966/2472 - 6990.102

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出版的历史:

收到日期:2015年5月20

接受日期:2015年6月17日

发表日期:2015年6月23日