摘要

用体重150 ~ 200 g的幼(4 ~ 5月龄)和250 ~ 350 g的龄(25 ~ 28月龄)大鼠进行脂质代谢和氧化过程的研究。在大鼠脑组织的线粒体部分，观察到脂质过氧化(氢过氧化氢、丙二醛)的速率增加，以及蛋白质氧化修饰产物的积累。对老龄大鼠脑组织脂质多样性的研究表明，衰老伴随着脂质组成的定性和定量的变化。发现糖脂代谢的改变导致脑苷类和硫化物的表达减少。此外，还观察到鞘氨醇水平(中性糖脂水解的产物)的增加。研究表明，脂质代谢紊乱在衰老过程中的病理变化中起着关键作用。

关键字

老化;脂质过氧化;线粒体;脑苷脂;神经节甘脂;Spingozin;蛋白质的氧化修饰

介绍

衰老问题是当前分子和细胞生物学研究的热点。众所周知，衰老过程伴随着与年龄相关的病理过程的发展，如中风、脑血管意外、动脉粥样硬化性脑病、恶性生长、内分泌和免疫紊乱等。了解老化过程背后的分子机制，可能提供解决老化相关问题的最佳策略。在假设和理论来解释的主要机制老化,一个重要的地方属于自由基理论与年龄相关的变化与分子的积累损伤细胞膜和细胞的遗传装置由自由基和脂质过氧化产物,蛋白[1,2]根据这一理论,自由基是机体内各种氧化反应的结果，对大分子(脂类、核酸、蛋白质)具有多重破坏作用，导致其降解和老化。在两股不同DNA、DNA和蛋白质之间的碱基之间的活性氧物种的影响下，或蛋白质的两个氨基酸残基能形成共价键，或“连接”?这种连接的形成是极其危险的，因为这会破坏蛋白质和基因的功能活性，并可能发生突变。氧化反应导致:细胞内平衡失调，这有助于疾病的发展或过早衰老。脂质不仅是细胞膜的结构成分;它们在功能活动中也起着重要作用。 The activity of membrane ferments and receptors, as well as cell phagocytosis and adhesion, depend on the phase properties of the lipid membrane, such as viscosity, surface charge, and polarity. Impaired lipid metabolism in an aged organism can result in a number of pathological processes in humans and animals. Among the most important apoptosis regulators are sphingosine, ceramid, sphingosin1-phospate which plays the role of the secondary messengers of the apoptotic signal. Ceramid and sphingosine modulate the activity of a variety of enzymes and transcription factors; particularly, they activate various protein kinases involved in the transduction of proapoptotic signal [6,7].

材料和方法

研究对象为体重150 ~ 200 g(幼龄)和250 ~ 350 g(老年)的白色远缘大鼠。每组20只大鼠进行7系列(神经节苷类和中性糖脂类)、10系列(蛋白质氧化修饰和脂质过氧化)实验。所有实验都是按照《欧洲保护用于实验和其他科学目的的脊椎动物公约》进行的。在含有0.25 M蔗糖和0.01 M pH 7.4的Tris HCl缓冲液的培养基中，在600 g速度力下沉淀细胞核后，在13 000 g速度力下差速离心分离脑线粒体。采用德国默克公司(Merck)的平板薄层色谱法，溶剂体系为氯form:甲醇:2.5 M铵(60:35:8)。通过n -乙酰神经氨酸的含量来评价神经节苷的含量[8,9]。氯仿甲醇脂提物经三氯乙酸和水处理后，脑苷类和硫化物在水和氯仿层界面形成致密白色层的能力决定了脑苷类和硫化物的沉淀。以氯仿:甲醇:浓氨(80:20:0.4)为流动相，采用TLC (TLC plates, Merck, Germany)对脑苷脂和硫化物进行分离。测定脑苷的含量通过测定了糖渣与间苯二酚的相互作用及硫化物的含量通过硫酸基与天青[8,9].3的相互作用

为分离鞘氨醇残基，将脑苷和硫化物混合物用H₂所以₄:甲醇混合物(1:20)，78-80°C, 6 h，然后用乙醚提取鞘氨醇渣。通过与甲基橙的显色反应测定415 nm波长处的吸光度来测定鞘氨醇的含量[8,9]。通过丙二醛(MDA)水平检测脂质过氧化(LPO)。通过与硫代巴比妥酸反应检测MDA水平[8,10]。通过氧化氨基酸残基与2,4 -二硝基苯肼(2,4 DNPH)相互作用检测蛋白质的氧化修饰，生成2.4-二硝基苯肼[10]。蛋白质含量按Lowry程序[11]测定。使用学生测验评价结果的统计学意义;p≤0.05时，认为差异有统计学意义。

结果与讨论

通过研究大脑中神经节苷脂的含量（图1），我们发现4种神经节苷脂的神经氨酸含量不同，神经氨酸具有高交换性。发现所有主要神经节苷脂组分（单唾液酸神经节苷脂、二唾液酸神经节苷脂、三唾液酸神经节苷脂和四唾液酸神经节苷脂）均减少。这些糖脂位于质膜的外单层中，因此它们携带总负电荷的碳水化合物链暴露在外部环境中。质膜鞘糖脂成分的调节也可能影响神经元的兴奋性（因为神经节苷脂被带负电荷的唾液酸饱和）。在轴突受损的脊神经节神经元中，神经节苷脂代谢发生改变，并伴有细胞膜上唾液酸含量增加。人们认为，质膜上负电荷的增加（由于唾液酸）导致神经元过度兴奋[5,12]。神经节苷脂是由N-酰基鞘氨醇（神经酰胺）通过脑苷形成合成的，它们的主要区别在于结构中存在N-乙酰神经氨酸。对对照动物大脑中中性糖脂的研究发现了两种脑苷脂和磺酸盐，以及脂肪酸含量不同的两种磺酸盐组分（图2）。这项研究的结果表明，随着年龄的增长，大脑中中性糖脂的总成分和部分成分的含量都会下降。年轻大鼠的中性糖脂总含量为18.03 mg/g，而老年大鼠的中性糖脂总含量为9.39 mg/g。脑苷脂主要分布在髓鞘中，而磺酸盐则分布在非髓鞘白质中。髓鞘的主要功能是通过被髓鞘包围的轴突快速传播神经冲动。除了传递神经冲动外，髓鞘还是神经纤维的营养来源，也为神经提供结构支持和保护。我们认为，老年大鼠研究组分的减少可能是衰老过程中观察到的脑功能受损的潜在原因之一。老年大鼠大脑中鞘氨醇含量的增加特别令人感兴趣。鞘氨醇是中性糖脂水解分解的产物，其研究结果表明，老年动物大脑中鞘氨醇的含量增加。游离鞘氨醇是由鞘氨醇和脑苷脂通过神经酰胺酶的酶裂解形成的，因此鞘氨醇酶形成鞘氨醇和脂肪酸。鞘氨醇髓鞘酶几乎存在于所有细胞中，但大部分包含在脑细胞的髓鞘中。最近公布的数据表明，鞘磷脂酶的激活依赖于细胞内的氧化过程。当自由基过程被激活时，鞘磷脂酶活性增加，从而导致神经酰胺和鞘氨醇的积累。鞘氨醇参与细胞增殖和细胞死亡的调节，因为它可以抑制蛋白激酶C的活性[13]。神经酰胺和鞘氨醇介导细胞凋亡，它们在脑细胞中的积累导致细胞凋亡的激活。细胞膜脂质含量的变化以及代谢变化通常是由自由基氧化过程引起的。在幼年大鼠的脑组织中检测到一定稳定水平的自由基反应。在老年大鼠脑组织线粒体部分氧化过程的研究中发现MDA含量增加。脑组织中易氧化底物的高含量，如多不饱和脂肪酸和非血红素铁（是脂质过氧化的激活剂），导致脑组织线粒体部分脂质过氧化物水平升高。在这些条件下，线粒体电子转移链成为活性氧（ROS）的重要来源，而活性氧是代谢的不稳定和高活性副产物。（图3）活性氧引起氧化蛋白修饰，与膜损伤增加相关。人们认为，在氧化应激下，活性氧首先攻击膜蛋白，而不是脂质[14]。数据分析表明（见图），老年大鼠脑组织线粒体部分的羰基水平明显高于年轻动物组织。这表明与年龄相关的氧化蛋白损伤增加。（图4）

图1：脑内正常的神经节苷含量(唾液酸μg /g组织)和衰老时观察到的含量(n=7) р< 0.001。

图2:脑中性糖脂和鞘氨醇正常含量及衰老时观察到的含量(mcg/g) р<0.001。

图3:幼龄和衰老大鼠脑组织线粒体部分MDA含量的定量研究Nm /mg蛋白(n=10) p<0.05。

图4：年轻和老年大鼠脑组织中2，4-二氢苯肼衍生物的含量。p<0.05（n=10）mg/g组织。

356 nm(碱性醛衍生物)

370nm（碱性酮衍生物）

430 nm(中性醛衍生物)

530 nm(中性酮衍生物)

事实上，蛋白质中的所有氨基酸残基都是氧化的目标，从而导致其功能的改变。磺胺基或邻近的氨基酸和羟基被氧化，导致蛋白质之间或蛋白质与其他含NH分子之间形成交联₂组。氨基酸氧化可引起蛋白质二级和三级结构的破坏，从而导致膜相关酶[14]失活。

结论

结果表明,氧化过程在老老鼠被激活,丙二醛的含量和增加2.4 -dinitrophenylhydrazone计数结果的蛋白质氧化的修改和脂质过氧化造成的破坏大分子脑组织细胞的结构。是破坏老年大鼠脑细胞细胞膜的结构完整性，破坏中性和酸性糖脂的代谢，аs a的结果，神经酰胺和鞘氨醇的量增加，从而导致细胞凋亡。因此，我们获得的氧化和脂代谢变化的数据可以帮助我们更好地了解衰老的机制。

工具书类

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条信息

Aritcle类型:研究文章

引用:Laura H, Gayane G, Hasmik Z(2019)实验性大鼠衰老过程中的脂质代谢和氧化应激。细胞干细胞再生医学4(1):dx.doi.org/10.16966/2472-6990.121

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出版的历史:

收到日期:2019年1月28日

接受日期:2019年4月17日

发表日期:2019年4月24日