摘要

研究骨缺损愈合的机制对于有针对性地促进骨缺损愈合具有重要意义。巨噬细胞作为骨缺损愈合过程中的重要因素之一，可以通过诱导骨形成促进骨修复，影响骨吸收。然而，调控巨噬细胞的上游因子在促进骨缺损愈合过程中起着重要作用巨噬细胞移动抑制因子（MIF）MIF能调节巨噬细胞的迁移和吞噬，与骨修复密切相关。本研究旨在研究MIF是否能调节巨噬细胞对骨缺损的修复。本研究采用大鼠钻孔模型检测了MIF在骨修复过程中的表达和分布，发现MIF大量分布在溶酶体中巨噬细胞中，MIF+F4/80+巨噬细胞分布于骨修复活跃的区域，如骨小梁；进一步发现，初级骨痂期的双阳性细胞远远多于成熟骨痂期的双阳性细胞。这些结果表明，MIF参与了骨缺损愈合促进的过程MIF对巨噬细胞的调节可能是通过溶酶体进行的。

介绍

外伤、骨肿瘤切除、骨髓炎、先天性骨缺损等引起的骨缺损，给患者的身心带来极大的痛苦。研究骨缺损愈合的具体机制，从而有针对性地采取措施促进骨折愈合具有重要意义。巨噬细胞是骨修复过程中不可缺少的因素。Raggatt等[1]发现，清除巨噬细胞后，小鼠骨无法修复。巨噬细胞通过诱导骨形成和调节骨吸收促进骨修复[2]。然而，巨噬细胞在骨修复中的调控因子尚不清楚。MIF是一种重要的促炎因子，可抑制巨噬细胞[3]的迁移，促进[4]的浸润、聚集、增殖和炎症中巨噬细胞[6]的活化，增强其黏附和吞噬[7]，促进多种炎症细胞因子[8]的产生。考虑到MIF对巨噬细胞的强大作用，本研究旨在观察MIF是否通过调节巨噬细胞促进骨修复。

材料和方法

材料12只雌雄SD大鼠

由第四军医大学实验动物中心提供;Holt的阿拉伯胶的蔗糖溶液：由蔗糖和阿拉伯胶溶解在ddH 2 O中的100毫升1g的30克得到的;OCT冷冻切片包埋剂（组织-Tek公司4583）;多聚甲醛（IS014，西安胡特生物技术有限公司）;抗荧光封固含有DAPI培养基（HNFD-02，广州郝翅生物技术有限公司）;抗MIF抗体（ab7207，Abcam公司，稀释倍数500X）;的Alexa Fluor488的驴的AffiniPure抗 - 兔IgG（H + L） - MIF对应的次级抗体（711-545-152，杰克逊免疫研究公司，稀释因子1000X）;F4 / 80（A-19）抗体（sc26642，圣克鲁斯，300X）;Alexa氟594的AffiniPure驴抗羊IgG抗体（H + L） - F4 / 80对应的第二抗体（705- 585-003，杰克逊免疫研究公司，稀释因子1000X）。

大鼠胫骨钻孔模型

12只大鼠随机分为A组和B组，每组6只，每组随机分为实验组和假手术组，每组3只，A组为术后7天制作的材料，B组为术后14天制作的材料，实验组大鼠注射腹腔注射1%戊巴比妥钠（45mg/kg体重）。胫骨在仰卧位被破坏、剃毛和消毒，并用无菌孔巾覆盖。胫骨被破坏的皮肤用as calpel切割，附着在胫骨中突上的肌肉用眼剪切开，以显示胫骨被破坏。使用直径为2mm的钻头在胫骨嵴上钻孔t平面，穿过单侧皮质骨。钻孔过程中用自来水冲洗钻孔器。再次用盐水冲洗钻孔。用缝合线缝合皮肤并用碘伏消毒。手术到此结束。假手术组的操作程序与实验组相同l组，但不钻孔。

Immunofluorescent染色

神经组织冰冻切片的获取：取giant的隐神经和坐骨神经后立即放入4%多聚甲醛中固定24小时以上。之后，在霍尔特相思蔗糖溶液中脱水72小时。将OCT冷冻包埋介质置于冷冻切片机(LEIKACM1850) -20℃下包埋，切成8um厚片，-20℃长期冷藏保存。

大鼠胫骨钻孔模型冰冻切片的获取:通过手术制作钻孔模型的大鼠，通过血管灌注40°C盐水，然后再灌注4%多聚甲醛，排空血液。然后，固定大鼠进行解剖。获得胫骨钻孔区域，并在4%多聚甲醛中固定一周n将其放入脱钙溶液中，脱钙溶液每3天更换一次。用刀片切割试样的额外端部以测试脱钙状态。完全脱钙后，将试样在holt’s acacia蔗糖溶液中脱水72小时，并将OCT冷冻包埋培养基包埋在冷冻培养基中将切片机（LEIKA CM1850）在-20℃下切片成8um厚，并在-20℃冰箱中长期保存。

Immunofluorescent染色:冷冻切片在37°C下孵育1h重新饲养；PBS洗涤3min×3次；0.25%Triton X-100钻孔30min；PBS冲洗3min×3次；1%BSA阻断37°C孵育30min；一级抗体在4°C下孵育过夜；PBS冲洗3min×5次；用相应的方法孵育。

在37℃下在添加了1H第二抗体;PBS冲洗3mins×5倍;加入抗荧光封固介质含有DAPI后安装。用尼康Eclipse的80显微镜所包括的NISElement˚F软件中观察到的结果和图像进行保存。

结果

大鼠胫骨钻孔模型的建立及其术后愈合状况

我们用大鼠胫骨钻孔模型来研究骨修复的过程。HE染色显示了手术后7天形成大量新生骨小梁的，但他们都是比较短。骨小梁开始沿着操作后14天的应力方向进行连接，在骨髓腔内的骨小梁的数目开始降低，和骨髓腔开始逐渐渗透。如图1所示，骨修复是在后7d重塑的早期阶段，和14d是在重塑的中间阶段。

图1：大鼠胫骨钻孔模型的建立及其术后愈合状态。
答:操作图;
X线显示大鼠胫骨钻孔模型；
氟。HE染色显示骨折修复情况;
C、 E 7^th术后天;
d，14 F.^th术后第第七天，HE染色显示骨折修复在重建和重建的早期，术后第十四天处于重建和重建的中期。

MIF是被巨噬细胞吞噬功能和在骨修复活动，是活跃的地区本地化

免疫荧光染色显示F4/80能标记巨噬细胞。MIF+F4/80+双阳性细胞分布于骨修复活跃区，如新生骨小梁周围。在阳性细胞中，溶酶体结构清晰可见，MIF也定位于溶酶体囊泡中(图2)。

图2：MIF和巨噬细胞在胫骨钻孔骨修复中的分布。
A-F4/80，红色
B-MIF，绿色
B、 C-DAPI-细胞核，蓝色
在阳性细胞中(A)，溶酶体结构清晰可见，MIF也定位于溶酶体囊泡中(黄色箭头)。MIF + F4 / 80 +双阳性细胞定位于重塑小梁周围(紫色箭头)。

MIF+F4/80+双阳性细胞在骨修复早期功能更强

免疫荧光染色显示骨缺损中MIF+F4/80+双阳性细胞数量较多^th比在14日^th术后第天（图3）。

图3：MIF和巨噬细胞在胫骨钻孔骨修复中的分布。
A-F4/80，红色
B-MIF，绿色
B、 C-DAPI–细胞核，阳性细胞呈蓝色（A），溶酶体结构清晰可见，MIF也定位于溶酶体小泡（黄色箭头）。MIF+F4/80+双阳性细胞定位于重塑小梁周围（紫色箭头）。

讨论

巨噬细胞参与骨修复的每个阶段，需要清除坏死组织[9]，延长新的骨结构，以恢复正常的骨结构和功能[10]。固有的免疫细胞，特别是巨噬细胞，在骨损伤的早期阶段就能立即被检测到。这些巨噬细胞诱导的级联反应首先清除损伤后形成的血块，并导致m被肉芽组织[12]取代;随后开始肉芽组织的合成代谢，诱导其逐渐演变为骨膜愈伤组织或骨桥可用于结构;这些临时骨结构随后逐渐重塑为正常的骨结构和强度[13]。巨噬细胞在骨修复中非常重要，但在这一过程中调控巨噬细胞的关键因素尚不清楚。

MIF在骨修复中起重要作用。小鼠MIF敲除遭受被显著低与正常小鼠[14]相比于骨缺损修复一个严重的延迟，并在那里对工序的矿物沉积速率。野寺[15]等人，检测小鼠股骨骨折模型中表达和MIF的分布。半定量PCR结果显示，MIF是高度在整个愈合过程中表达，达到对骨折后的第四天的峰。免疫HISTO化学结果表明，MIF的表达增加定位于骨修复的活动区域。MIF出现在骨折后肉芽组织4天;出现在增厚的骨膜膜，在它之下和软骨7-10天后愈合组织的软骨成骨细胞膜内;并出现在软骨愈合组织的软骨14-28天后。该阶段后，MIF的量逐渐减少。这项研究表明，MIF + F4 / 80 +巨噬细胞位于所述骨重塑活性的区域，如新骨小梁形成区域。 Further, we found the double positive cells on the 7^th术后天数明显多于14天^th这些结果表明，MIF+F4/80+巨噬细胞参与骨修复，且大多数在骨修复早期发挥作用。此外，MIF更多地定位于巨噬细胞溶酶体中，提示MIF可能通过溶酶体调节巨噬细胞。但具体机制尚需进一步研究呃学习。

结论

MIF参与巨噬细胞的骨修复过程。其对巨噬细胞的调节可能是通过溶酶体。

工具书类

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文章信息

Aritcle类型:研究文章

引用:李军，吴辉，张世生，姜辉，王军，等。(2018)MIF通过调节巨噬细胞促进骨缺损修复。细胞干细胞再生医学3(2):dx.doi.org/10.16966/2472-6990.119

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出版历史：

收到的日期：2018年8月17日

接受日期：2018年9月5日

出版日期：2018年9月11日