
图1:质子交换膜燃料发电装置。
MSCs暴露于15hz, 2.4 mT均匀PEMF中20分钟/天,3倍/周,持续21天。由亥姆霍兹线圈产生的磁场。用示波器检测频率,用高斯计测量场强。
克里斯蒂娜·L·罗斯*
再生医学系,维克森林再生医学研究所,维克森林中西医结合中心,医学中心大道。温斯顿塞勒姆,北卡罗莱纳,美国*通讯作者:克里斯蒂娜·L·罗斯,美国卡罗莱纳温斯顿-塞勒姆391号技术路,维克森林医学院再生医学研究所,电话:+ 1-336-713 - 7274;传真:+ 1-336-713-7290;电子邮件:chrross@wakehealth.edu
在发达国家,60岁以上的人口中有一半患有骨质疏松症。各种合成代谢、抗吸收、激素替代疗法和骨移植已被用于保持健康的骨量和强度;然而,它们会产生严重的不良影响。为了测试药物的替代疗法,我们评估了FDA批准的3-D可生物降解聚L-丙交酯酸支架的效果,该支架种植有成骨细胞和间充质基质/祖细胞,暴露于15 Hz、2.4毫特斯拉脉冲电磁场中,通过刺激成骨促进成骨骨再生。一旦粘附,细胞支架被评估为活性成骨骨蛋白,以提供PEMF加速成骨细胞和MSC增殖、分化和矿化的证据。对活性成骨标志物的评估显示,脉冲电磁场可使细胞治疗中的骨钙素、骨桥蛋白和碱性磷酸酶水平增加30%。在7-14天之间观察到成骨率的增加,这为脉冲电磁场疗法与细胞种子组织工程支架的结合提供了一个有效窗口。PEMF与生物工程红细胞疗法的结合可以为目前组织可用性有限、供区发病率、免疫排斥和自体移植引起的病原体转移等问题提供替代治疗。
脉冲电磁场;间充质基质细胞;骨组织工程;骨质疏松症;骨生成
PEMF:脉冲电磁场;MSCs:间充质基质细胞;BTE:骨组织工程;HRT:激素替代疗法;甲状旁腺素:甲状旁腺激素
骨质疏松症是一种骨骼疾病,其特征是骨强度降低,增加骨折的风险。除了生活质量受损外,患者伴有骨质疏松症的死亡率增加[1]。目前的估计预测,在发达国家,有一半的人口60岁以上的老人将患有骨质疏松症[2],直接以170亿美元被花在骨质疏松性骨折的治疗在美国在2005年,预测疏松症相关的直接成本将增加到2025年的250亿美元[3]。药理疗法如激素替代疗法(荷尔蒙替代疗法),开出抗再吸收药物的合成和目前正在用于治疗骨质疏松症,但不同治疗的副作用如激素替代疗法(HRT)可能诱发乳腺癌的发病率高,根据病人的治疗和年龄的长度[4]。据报道,用于治疗骨质疏松症的生物磷酸盐可导致颌骨骨结构[5]骨坏死,而长期使用甲状旁腺素[PTH]已收到美国食品和药物管理局关于骨源性肉瘤[6]的“黑盒”警告。同种异体骨移植和自体骨移植也被使用;然而,由于自体[7]移植引起的病原体转移和同种异体[8]移植引起的免疫排斥反应会导致这些手术的并发症。
在不使用药物或骨移植的情况下,可以替代骨质疏松症的治疗方法是成人干细胞。成人干细胞已经在临床上应用了十多年,主要用于治疗组织损伤和免疫紊乱。特别是,来自成人骨髓的间充质基质/祖细胞[MSCs -有时被称为间充质干细胞],由于其免疫抑制和免疫逃避特性,为骨骼疾病的骨修复提供了一种有前途的干细胞群体;然而,它们在骨组织再生中的一致性仍在研究中。越来越多的数据表明,干细胞功能受到来自细胞外微环境的外源信号的严重影响[10,11]。
脉冲电磁场[PEMF]治疗骨质疏松症的最新进展表明,骨小梁和皮质骨微结构[12]的恶化程度有所降低,骨力学性能如最大载荷、刚度和弹性模量[13]也有所改善。这种效应涉及成骨细胞及其祖细胞的一系列反应。另一种治疗骨质疏松的非药物疗法是骨组织工程[BTE],它是通过生物材料、细胞和生长因子[7]的协同结合,诱导新的功能性骨再生。在本研究中,我们将MSCs植入BTE支架,并暴露于PEMF中,以确定这三种联合疗法如何能提供更有效的刺激骨再生的方法。使用间充质干细胞是因为它们很容易粘附在组织培养的聚合物[14]上,而且它们的高增殖率,再加上它们能够耐受冰冻温度,使得它们在临床上的相关数量可以扩大[15]。它们还倾向于在表达炎症分子的受损组织部位安家,这表明植入炎症组织的效果更高。用分化培养基[DM]刺激培养的MSCs可影响组织类型[16]。有报道称,将适当的物理刺激(如PEMF)应用于培养中的MSCs,可以克服标准培养体系带来的挑战,即扩散受限、细胞基质分布不均匀、细胞增殖和分化减少[17]。据报道,添加三维生物可降解聚合物支架促进骨形成,支持MSCs的积累,并增加MSCs直接作用于损伤组织部位[18]的剂量。虽然基于聚l -乳酸[PLLA]的BTE[19]和MSCs[20]对成骨分化的贡献已经被证实,但本研究的目的是研究PEMF是否可以利用这些BTE和MSC方法形成骨,加速成骨过程。
成骨细胞:作为对照,ATCC[Manassas,VA]胎儿成骨细胞[FOB]在Ham's F12培养基Dulbecco改良Eagle's培养基和2.5 mM L-谷氨酰胺[不含酚红]的混合物中培养。为了制作完整的生长培养基,将0.3 mg/ml G418和10%胎牛血清[FBS]添加到基础培养基中。细胞在34°C下培养,添加5%的CO2,根据制造商的说明。细胞数量增长到80%的一致性。模拟原位环境,用于增强成骨分化的生长因子包括:20mg / mL转化生长因子-β[TGF-β];20mg / ml血管内皮生长因子[VEGF];和20mg / ml骨形态发生蛋白[BMP-2]。
人类BM-MSCs:间充质干细胞生长培养基和补充物[MSC-GM, Lonza, Walkersville, MD]用于培养之前描述的hBM-MSCs[21]。细胞在T-75烧瓶中培养,每烧瓶使用36 ml培养基,37℃,5% CO2在诱导骨质发生前生长至100%汇合。为了刺激成骨,使用分化[诱导]培养基[DM]结合DMEM低葡萄糖[Invitrogen,Carlsbad,Ca],10%FBS,100nM地塞米松σ10nmβ-甘油磷酸术[sigma]和0.05mm 2-磷酸-1抗坏血酸[sigma]。通过完全取代新鲜成骨感应培养基,每3-4天每3-4天改变培养基每3-4天。
BTE支架和细胞播种:Poly-D, l -乳酸[PLLA] Bio Mesh [Biomedical Structures, Pinebluff, NC]孔隙率为83.5%,平均大小为12.1µ。选择这种特殊的聚合物是因为它的强度和柔韧性,类似于天然骨[22]。为避免降解,生物群落保存在-80°C直到准备使用。用无菌镊子和剪刀剪开补片至1cm2方形的硅胶三明治框。用环氧乙烷[EtO]进行杀菌。使用5ml移液管,将支架浸泡在磷酸盐缓冲盐水[PBS]和20 mg/ml纤连蛋白[Thermo Fisher Sci, Waltham, MA]中,直到充分吸收。支架材料有点疏水性,所以需要用软压力彻底浸泡它,而不破坏纤维。支架饱和后,至少孵育1小时,然后抽吸PBS。然后将细胞培养基移液管移入非组织处理过的150mm板中,以10 × 10的尺寸将细胞播种到支架上6细胞/厘米2.将培养基加到硅胶夹层模具中心,确保支架和框架不漂浮。细胞支架分为4组:1]仅含分化培养基[DM]的成骨细胞[FOB + DM];2] DM细胞暴露于PEMF [FOB + DM + PEMF];3]仅伴DM的MSCs [MSC + DM];4] MSCs + DM + PEMF暴露于DM的MSCs。
PEMF治疗:梗塞部位支架,在帧,直接取自孵化器在板块包括媒体,和被放置在34°C(成骨细胞)或37°C (msc)水浴和暴露15赫兹,2.4公吨制服PEMF由亥姆霍兹线圈生成(图1),20分钟,每周3 x为3周。之所以选择这个时间点,是因为之前有报道称它能成功刺激成骨分化[23]。使用之前描述过的BM-MSC细胞株[21],我们的目的是证明PEMF可以加速种植在FDA批准的可生物降解PLLA支架上的MSCs的分化能力。DM细胞含有甘油磷酸酯、抗坏血酸和地塞米松,这些物质已被用于在CO保存外的细胞中保持高达90%的细胞活力2孵化器高达24小时[24]。成骨细胞和MSC都有来自在培养箱中保持的相同细胞批次。媒体变化后立即给出所有PEMF治疗。在第0天[24小时],7,14和21天进行上清液样品。
图1:质子交换膜燃料发电装置。
MSCs暴露于15hz, 2.4 mT均匀PEMF中20分钟/天,3倍/周,持续21天。由亥姆霍兹线圈产生的磁场。用示波器检测频率,用高斯计测量场强。
形态学评价:形态学评估检测细胞对支架的附着,包括使用共聚焦显微镜[Olympus Fluo view FV 10i]拍摄的图像,通过Dapi [Dapi与PBS的浓度比为1:1000]对细胞核进行染色来评估细胞附着。根据厂商说明书,使用活[绿]/死[红]钙黄素试剂盒[Molecular Probes, Eugene, OR]测定细胞活力。所有图像都是用10倍物镜拍摄的。扫描电子显微镜]was used to detect bone formation and tissue matrix. All images were taken at day 0 [24 h], 7 days, 14 days, and 21 days.
骨蛋白评估:酶联免疫吸附测定试剂盒(ELISA):骨钙素试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA);骨桥蛋白试剂盒[Ray Bio Norcross, GA]和碱性磷酸酶试剂盒[Ray Bio]使用在-80°C中冷冻的细胞上清样。一旦测试,样品在450nm的微滴度板上读取。
统计分析:试验共进行四次试验。结果用均数±均数标准误差表示。采用单因素方差分析确定ELISA组间的统计学差异,p < 0.05认为显著。
骨重塑是由骨细胞骨质体和骨组织形成的高度综合过程,由成骨细胞产生精确平衡的骨架物质,重新改造矿化基质。生物蛋白质是羟基磷灰石沉积在细胞外基质[ECM] [25]中的方法。用于再生骨的理想参数将包括生物相容性支架,其密切地模仿躺下骨组织基质所需的天然骨ECM,MSC或成骨细胞。形态发生信号还有助于将细胞引导至表型所需的类型[7]。
在这项研究中,与对照组相比,暴露于PEMF处理超过21天的细胞显示出更好的聚集和附着。FOB与FOB+PEMF和MSCvsMSC + PEMF在7-14天内表现出最佳附着效果(表1)。在21天内进行活/死评估,在7-14天也是最有效的(表2)]used to assess bone formation and tissue matrix after exposure to PEMF, show more effective differentiation of both FOB and MSC to bone-like structure between 7-14 days when exposed to PEMF for 20 min/day 3d/wk for 21 days, compared with controls (Table 3). After 21 days cells became osteoclasts [bone resorption], which is defined as the process by which osteoclasts break down bone and release the minerals, resulting in a transfer of calcium from bone fluid to the blood.
表1:细胞附着:用DAPI染色检测细胞在PLLA支架上的附着情况。使用奥林巴斯Fluoview FV 10i成像系统共聚焦显微镜10倍成像,比例尺设为100µm。当暴露于PEMF时,最佳的细胞聚集和附着出现在播种后的7-14天。
表2:细胞活力:使用活/死染色技术(活绿、死红)评估细胞活力,并使用Olympus Fluoview FV 10i共聚焦成像系统10倍成像,标尺设为100µm。细胞在PLLA支架上播种并暴露于PEMF后7-14天表现出最具活力。
表3:细胞成骨:扫描电镜(100 - 200µm)显示,在PLLA支架上播种细胞后7-14天,骨样结构的成骨形成更大。绿色箭头表示胶原纤维,红色箭头表示钙化,黄色箭头表示囊泡基质。
评估骨形成的活性标记物,并与骨髓来源的成骨细胞进行比较,以确定骨形成过程。这些标志物包括骨基质的合成和致密矿化的形成。对成骨细胞和MSC支架样品进行了骨钙素[OCN -形成骨组织的标记物]、骨桥蛋白[OPN -将骨细胞锚定在矿化骨表面]和碱性磷酸酶[ALP -使磷酸盐可用于钙化]的检测。所有似乎增加了通过接触PEMF 7 - 14天时间(图2)。OCN增加蛋白质含量最高(图2),OPN(图2 b),和高山(图2 c)在成骨细胞,三倍和1.5折msc接触PEMF治疗后7天至14所示,在21天的研究。数据(图2d)显示了不同骨蛋白和时间点的平均值±SD。
图2:生产OCN, ALP和OPN骨蛋白。对成骨细胞和间充质干细胞支架样品进行检测
OCN。
b)opn。
c)alp.
采用ELISA法检测各组蛋白水平。在第7天到第14天,这三种骨标志物水平的增加是最大的。
d) ELISA检测OCN、OPN、ALP水平。
在第7天到第14天,这三种骨标志物水平的增加是最大的。
成骨是骨髓[BM]来源的MSCs分化生成新骨的一系列复杂事件。骨蛋白表达的时间和功能模式是成骨细胞成熟过程的特征,可分为增殖、分化和矿化阶段。OCN或骨Gla蛋白[B.G.P.], is the major non-collagenous protein of the bone matrix. It is synthesized in the bone by the osteoblasts, whereby OCN levels reflect the rate of bone formation [26]. OPN has been shown to improve bone toughness, suggesting its importance in preventing crack propagation, thereby affecting bone mass, structure, and matrix porosity [27]. As an active marker of osteoblasts and hard tissue formation, alkaline phosphatase [ALP] is crucial to the mineralization process [28]. In osteogenesis, success is measured by robust expansion of ALP, leading to mineralization of the neotissue [29,30].
骨髓间充质干细胞具有特征钙[Ca2+涉及细胞内信号传导的波浪。加利福尼亚州2+振荡在pemf诱导的细胞向不同组织类型分化中起着关键作用。PEMF刺激成骨的能力取决于成骨细胞的成熟阶段,在此阶段,分化和矿化过程中骨标记基因的表达增加,可以增强钙化基质的生成[332,33]。质膜通常被认为是PEMF信号的主要靶点,大多数结果表明,由于受体位点作为信号级联[16]的调节剂,对离子或配体结合速率的影响。特低频脉冲电场[34]对膜表面电荷和电势等电性能的影响尤为明显。例如,PEMF可以诱导细胞膜的去极化,随后细胞内钙离子的增加或减少2+]i[34]。作为第二信使,Ca2+离子参与细胞生长和发育的所有阶段的调控,包括增殖和分化,以及细胞骨架元素[34]的组装和拆卸。
在理解生长因子对骨祖细胞的调节方面取得的重大进展表明,由生长因子激活的信号通路[35]之间存在广泛的交叉。这也适用于PEMF与信息传递的交互。质膜是细胞外环境和细胞内环境之间的一个重要屏障,无论是在电阻方面还是在信息传递方面。有报道称,暴露于外部刺激,如PEMF,可通过离子动力学和小信号分子[16]促进BM-MSCs的增殖和分化。质膜通常被认为是PEMF信号的主要靶点,因为它会影响在受体位点作用的离子或配体结合的速率,从而调节信号级联[16,36,37]。当干细胞向特定方向移动和生长形成组织时,离子通量密切参与了分化的控制。据报道,PEMF会影响许多生物学功能,如基因表达、细胞命运和细胞分化;然而,一定范围的低频振幅会产生特定的效应[16,37]。一种可能的解释是PEMF可能与现有的膜信号转导机制相互作用,这种机制对于检测和转导细胞外环境中低水平的信号[38]具有极高的灵敏度和特异性。
本研究采用已知的PLLA支架与MSCs结合的成骨增强方法,以确定PEMF是否可以加速骨分化以治疗骨质疏松症。以前的研究报道了骨髓间充质干细胞用于骨移植的有益用途,因为它们可以很容易地从成人骨髓中分离出来,并在创伤[15]后自然分化。PEMF刺激用于骨折愈合已有多年,具有临床益处[16,39],多项研究表明其具有促进骨组织再生的能力,且无不良影响[13,40-42]。特别有趣的是,治疗参数在15 Hz [0.4 mT - 3.2 mT][16]范围内最有效,因此效果似乎是频率特异性的。PEMF多年来一直被认为是一种很有前途的骨质疏松症药物治疗替代方案,它可以增加骨密度和防止骨丢失[43,44]。PEMF也可以外源性应用于术后[45]的连续效应。本研究中使用的PEMF [15 Hz, 2.4 mT]的频率和强度与之前的MSC分化[16]和骨生长[46]的报道一致。为了确定PEMF是否刺激了其他的成骨信号,以及是否产生了足够的血管化以满足生长组织的营养供应,还需要进一步的研究。
PEMF联合MSCs和BTE支架可以为目前药物治疗骨质疏松、自体移植物引起的病原体转移、同种异体移植物引起的免疫排斥等问题提供替代治疗。据报道,低频脉冲电磁场可有效促进成骨,在药物治疗和移植中无负面影响。这里我们展示了15 Hz, 2.4 mT,每天20分钟,每周3次,持续3周的增强效果。PEMF有能力刺激成骨细胞和间充质干细胞的骨生长,形成骨的速度比以前使用的方法快30%。药效窗口期为7-14天。综上所述,这些结果表明PEMF比单独的分化培养基更有效地增强了MSC种子支架形成成骨细胞的承诺。
这项工作得到维克森林综合医学中心(批准号120-330-740196)和维克森林再生医学研究所(批准号730-120000-00000-110494)的支持。作者希望感谢Graça Almeida Porada医学博士慷慨捐赠了本研究中使用的Stro-1间充质基质细胞[MSCs]。
作者没有利益冲突的报告。
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Aritcle类型:研究文章
引用:Ross Cl(2017)使用骨组织工程膜疗法和脉冲电磁场[PEMF]治疗骨质疏松症的优化时间。细胞干细胞Regen Med 3(1):Doi http://dx.doi.org/10.16966/2472-6990.116
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