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研究文章
囊性纤维化小鼠发生自发性慢性博氏杆菌气道感染

Darrah R1 *Bonfield T2LiPuma JJ3.Litman P1霍奇斯CA4Jacono F5·米6

1Frances Payne Bolton护理学院，凯斯西储大学，克利夫兰，美国俄亥俄州
 2美国俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学儿科
 3.美国密歇根大学医学院儿科和传染病学系
 4美国俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学放射学系，生物医学工程学系和儿科
 5美国凯斯西储大学医学系和路易斯·斯托克斯弗吉尼亚州克利夫兰医学中心
 6美国俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学儿科和遗传基因组科学系

*通讯作者:美国俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学护理学院，Rebecca Darrah电话:216-368-4911;电子邮件:rjm11@case.edu


摘要

慢性肺部疾病和感染是囊性纤维化(CF)患者发病和死亡的主要原因。虽然铜绿假单胞菌，最常见于CF患者的呼吸道，人们越来越重视CF微生物群的多样性，包括其他类群，如博代氏杆菌属．在这里我们描述的识别和影响博代氏杆菌属pseudohinziiCF小鼠感染，此前人们认为CF小鼠不会发生自发性气道感染。我们发现CF小鼠更容易受到b . pseudohinzii与非cf小鼠相比，它们的抗感染能力更弱。此外，在CF和非CF小鼠中，b . pseudohinzii感染导致明显的呼吸频率降低和cf特异性免疫反应。这些结果建立了CF小鼠模型作为研究CF相关感染的重要工具，并突出了其潜在的贡献博代氏杆菌属CF临床病理。


介绍

囊性纤维化(CF)患者表现出一种复杂的肺部表型，以气道感染、炎症和阻塞为特征。肺部疾病主要是由多种微生物群的气道感染引起的，占CF患者死亡率的90%。

CF患者肺部最常见的细菌种类是铜绿假单胞菌，一种在其他患者群体中不常见的病原体[1]。CF患者感染铜绿假单胞菌与非CF患者相比，CF患者的身体功能明显较差，体重增加，呼吸症状和治疗负担增加假单胞菌感染[2]。由于这种临床负担，大量的研究集中在患病率和治疗P.aeruginosa在CF患者。最近的研究表明，CF气道微生物组实际上更为复杂和多样化，通常由许多其他细菌种类组成[3,4]。呼吸道细菌种类的鉴定历来涉及痰液或气管拭子的培养和分析培养中存在的细菌。然而，这种方法是有偏见的，基于所选择的培养条件(时间、培养基、温度)，以及生物在混合培养中生存的竞争能力，这种混合培养通常包含许多不同的物种。下一代测序技术通过消除对培养的需求，提供了一种更少偏向的微生物群检测和鉴定方法。通过这种方法，很明显，CF气道中的微生物群落是多样的，包括细菌种类，如博代氏杆菌属以前与CF肺部感染[5]无关。博代氏杆菌属感染可能特别具有致病性，因为它们是已知的几种能避开中性粒细胞胞外陷阱的病原体之一，而中性粒细胞胞外陷阱是呼吸道感染的关键免疫机制。

CF小鼠模型的局限性是缺乏自发性气道感染P.aeruginosa在这些动物。我们之前的工作描述了未感染CF小鼠呼吸频率的增加和肺力学的改变，表明肺部表型的存在不仅仅是感染的结果[7,8]。然而，在这些研究的过程中，自发的博代氏杆菌属通过常规监测发现CF小鼠模型存在呼吸道感染。与非CF小鼠相比，CF动物中感染更为常见，明显表现为支气管肺泡灌洗液中中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的增加和鉴别博代氏杆菌属通过16S rRNA基因测序测定[5,9]。初步测序结果表明，从小鼠菌落中分离的细菌为博代氏杆菌属hinzii；然而，更深入的序列分析表明，这实际上是一个最近被描述的新物种博代氏杆菌属被称为博代氏杆菌属pseudohinzii(9、10)。b . pseudohinzii在其他肺疾病[11]小鼠模型中被确认为混杂种。偶然的识别B.pseudohinziiCF和非CF小鼠感染的影响B.pseudohinzii本文介绍了CF和非CF小鼠的呼吸频率和感染反应。

材料和方法
小鼠模型

这些研究使用了一种描述良好的CF小鼠模型:F508del (Cftrtm1kth)是人类最常见的CF突变[12]的小鼠版本。这些CF小鼠模型在C57BL/6J背景上同源，因此以野生型C57BL/6J作为对照。每隔五代将每个小鼠系回交至C57BL/6J背景，以尽量减少品系之间可能的遗传漂移。凯斯西保留地大学动物保护和使用委员会批准了实验方案。研究中使用的所有小鼠都是成年小鼠(至少6周大)。所有小鼠都被允许无限制地获取食物(Harlan Teklad 7960;Harlan Teklad Global diet, Madison, WI)和无菌水与渗透泻药Colyte (Schwarz Pharma, Milwaukee, WI)，并在平均环境温度22℃下维持光照12小时，黑暗12小时的周期。

全身体积描记法

在适应期(如前所述[13])后，用体温平衡全身体积描记器(采样率=200 Hz)记录自发呼吸小鼠的呼吸模式。腔内的压力变化被转换为代表呼吸模式的信号，通过前置放大器(Max II, Buxco Electronics)，获得(Power1401, CED, Cambridge, UK)，并通过呼吸采集软件(Spike 2, CED)存储，以进一步分析呼吸模式动力学。对60年代的呼吸模式进行量化。报告了三个时代的平均值。增强呼吸、叹息、吞咽、明显运动和喘气被排除在分析之外，并在可比条件下记录动物。

博代氏杆菌属感染

生长曲线分析b . pseudohinzii建立病原菌的对数期，以提高接种物的活力。小鼠经鼻接种106b . pseudohinzii菌落形成单位(cfu)，基于细菌的培养和生长模式。的压力B pseudohinzii使用的是最初从我们的CF小鼠群体中分离出来的[5,9]。每天随访小鼠2周，之后每周随访小鼠体重和临床评分，并在不同时间点进行体积描记和支气管肺泡灌洗(BAL)。BAL液用于测定细胞在肺内的募集和细菌定植。

其余的肺也均质以评估细菌负荷。细菌负荷的定量是用琼脂板进行标准稀释分析，这也会显示任何污染问题。

支气管肺泡灌洗液分析

用四象限血球计评估小鼠全体体积描记后获得的BAL液的总细胞数，并用细胞旋光度法和赖特吉姆萨染色法进行差异评估。将BAL液置于37℃培养72h的血琼脂平板上进行细菌培养。

博代氏杆菌属ELISA

小鼠血清稀释1:50，分两份预涂B.hinzii阳性和阴性抗原孔(XpressBio)，并按照制造商说明在37°C孵育30分钟。然后用提供的洗涤液(带有表面活性剂的tris缓冲液)洗涤孔，吸干，并与过氧化物酶结合物在37°C下孵育45分钟。孵育后，最后一次冲洗孔，吸干，在室温下与ABTS基质孵育30分钟。在405nm的吸光度板阅读器上立即读出比色变化。从阳性抗原孔中减去阴性抗原孔作为背景，取重复数平均值，如果抗体在405nm处为>0.300，根据制造商的建议，则认为结果为阳性。

结果

博代氏杆菌属感染最初是通过每月例行的随机小鼠筛选在小鼠群体中检测到的。一旦检测到，我们使用BAL液体培养对CF和非CF小鼠进行全面监测。与非CF小鼠(14.9%)相比，我们菌落中的CF小鼠更有可能筛查出感染阳性(66.6%的测试小鼠)，尽管由于共同居住而共同暴露。博代氏杆菌属说明CF小鼠对感染的易感性较强，但清除感染的能力较弱(表1)。我们从CF小鼠群体中收集纵向ELISA数据(测量IgG和IgM水平)，以计算CF和非CF小鼠感染或曾经感染的百分比博代氏杆菌属．在大约2年的时间里，我们筛查了180只CF小鼠和137只非CF小鼠。29%的CF小鼠为阳性博代氏杆菌属相比之下，只有2%的非cf小鼠被检测(表2)。

博代氏杆菌属感染 Non-CF老鼠n = 67 CF老鼠n = 33
10/67 (14.9%) 22/33 (66.6%)

表1:通过BAL培养确定首次暴发期间博氏杆菌的自发感染发生率。

波氏杆菌ELISA检测阳性 Non-CF老鼠N = 137 CF老鼠N = 180
3/137 (2%) 53/180 (29%)

表2:老鼠阳性博代氏杆菌属ELISA。

在最初的爆发之后博代氏杆菌属感染后，我们发现CF和非CF小鼠电流呈阳性博代氏杆菌属感染(通过BAL培养测定)也显著降低了呼吸频率(112±32次/分钟)vs．每分钟216±64次呼吸;p<0.001)(图1)。作为一项正在进行的研究的一部分，我们测量了最初发现为阳性的小鼠子集的呼吸频率博代氏杆菌属．这些结果如图1所示。

图1:非CF和CF小鼠的呼吸频率降低博代氏杆菌属感染(112±32次/分钟)vs．每分钟216±64次呼吸;p < 0.001)。

评价…的效果博代氏杆菌属对CF小鼠呼吸频率和免疫反应的影响，我们将未感染的小鼠经鼻接种b . pseudohinzii培养并使用容积描记术监测呼吸频率。CF小鼠在接种48小时后呼吸速率下降速度快于非CF小鼠vs．接种后1周)和非CF小鼠在3个月的研究期间均能从感染中恢复，而CF小鼠则不能(图2A)。与非CF小鼠相比，CF小鼠在感染3个月后呼吸频率仍显著降低(88±15次/分钟)vs．每分钟155±11次呼吸;P <0.01)，说明感染对呼吸频率的影响仍存在。在接种后3个月最后一次测量呼吸频率后，收集BAL液，培养7/9 (78%)CF小鼠博代氏杆菌属与此相比，非cf小鼠只有1/11(9%)(表3)。

图2:非CF (n=12)和CF (n=10)小鼠随后均表现出呼吸频率降低博代氏杆菌属(A) CF小鼠接种后3个月，CF表现出明显增加的中性粒细胞应答博代氏杆菌属与非cf小鼠相比感染(B)。

博代氏杆菌属感染 Non-CF老鼠n = 11 CF老鼠n = 9
1/11 (9%) 7/9 (78%)

表3:接种后3个月波氏杆菌感染的发生率。

最后，我们研究了CF小鼠与非CF小鼠在免疫应答方面是否存在差异。CF小鼠在接种后48小时、2周和3个月的BAL液中中性粒细胞百分比显著增加，表明对感染的免疫反应强烈而持久(图2B)。

讨论和结论

我们描述了慢性自发肺部感染的CF小鼠模型由于博代氏杆菌属．博代氏杆菌属与非CF小鼠相比，CF小鼠更容易被检测到感染，两组小鼠的呼吸频率都显著降低，其中CF小鼠在有意感染后出现呼吸频率降低的时间点更早。虽然呼吸频率降低的机制仍有待阐明，但需要注意的是，CF和非CF小鼠都没有表现出其他疾病或痛苦的外部迹象。然而，78%的CF小鼠仍然有博代氏杆菌属在感染后3个月从他们的BAL液中培养，相比之下，非cf小鼠只有9%。综上所述，这些数据表明CF小鼠对博代氏杆菌属感染，清除能力下降。

CF小鼠在感染后48小时、2周和3个月的BAL液中中性粒细胞比例较高。这些数据表明他们无法清除博代氏杆菌属肺部感染并不是在感染后无法进行免疫应答的反映。这与我们之前使用条件句的研究是一致的雌性生殖道发现这些小鼠的降解能力降低假单胞菌提示CFTR缺失导致免疫功能受损[14]。

最后，大部分CF小鼠仍然呈阳性博代氏杆菌属在感染后3个月从他们的BAL液中培养，相比之下，只有一个非cf小鼠。提示细菌可能定植于CF气道，这与人类CF气道疾病一致。

所有种类的博代氏杆菌属产生腺苷酸环化酶毒素(ACT)、皮肤坏死毒素和气管细胞毒素[15]。ACT的表达被认为与呼吸道定植[16]有关，皮肤坏死毒素引起组织损伤[17]，气管细胞毒素引起纤毛麻痹[18]。这三个共同构成了博代氏杆菌属感染，尽管有特定种类的毒素，如百日咳毒素，可以存在于这些之外。ACT由B.hinzii不同于其他博代氏杆菌属物种(如博代氏杆菌属百日咳)，因为它对钙调素的亲和力降低。因此，它不会引起cAMP水平的升高b .百日咳这被认为是导致这两个物种之间毒力差异的原因。B.hinzii尚未得到充分的研究，但它是可信的，尽管总体毒性可能降低与其他研究充分的波氏杆菌种类(如b .百日咳和博代氏杆菌属bronchospetica)感染B.hinzii可能会有类似的影响，尽管比较温和。

虽然博代氏杆菌属已经在CF患者的气道中发现，但尚不清楚它在CF肺疾病的病理生理学中扮演什么角色[19-24]。博代氏杆菌属据估计，CF患者中有5-7%发生感染，尽管人们认为存在博代氏杆菌属当用标准方法培养时，由于来自其他物种的竞争，可能被广泛低估。对CF患者的痰液进行直接测序发现了一种新型的博代氏杆菌属[25]除检测以前鉴定的菌株外。因此,虽然博代氏杆菌属已在CF患者中发现[25-27]，但其对CF肺病理生理学的贡献尚未被描述。

CF患者通常使用多种抗生素疗程来控制肺部感染。特定的抗生素治疗通常是根据痰中培养的细菌来选择的，特别注意是否存在Pseudomonas和[28]葡萄球菌。博代氏杆菌属很难培养，因为它经常在培养水平上被其他微生物物种[24]竞争。的博代氏杆菌属从我们的CF小鼠群体分离的物种对四环素和强力霉素最敏感。有趣的是，这些药物通常只在CF治疗的后期使用(平均在初次诊断后20年)，一旦患者被诊断为洋葱伯克霍尔德氏菌复合感染[28,29]。因此，如果CF患者感染了博代氏杆菌属在美国，他们不太可能接受最有效的抗生素治疗。B.hinzii，最接近的亲戚b . pseudohinzii也被发现对庆大霉素敏感，但对妥布霉素[30]不敏感。然而，庆大霉素并没有像妥布霉素那样广泛使用，因为它会增加CF患者的肾毒性。因此，目前对CF的临床干预在预防或治疗所有方面可能是不够的博代氏杆菌属感染。

总之，我们描述了增加的易感性博代氏杆菌属CF小鼠模型感染。这种感染导致CF和非CF小鼠的呼吸频率降低。有趣的是，CF小鼠一旦感染，就会变成慢性感染，尽管它们的中性粒细胞反应增强，但它们似乎无法清除感染。是否博代氏杆菌属在人类CF肺部感染的致病性中发挥重要作用尚不清楚，但小鼠模型为这些研究提供了令人兴奋的新途径。

致谢

这项工作得到了美国国家卫生研究院和NHLBI的1R21HL130839-01A1 (Darrah/Flask MPI)的资助。


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条信息

文章类型:研究文章

引用:Darrah R, Bonfield T, LiPuma JJ, Litman P, Hodges CA，等。J感染Pulm病3(2):doi http://dx.doi。org/10.16966/2470 - 3176.128

版权:©2017 Darrah R，等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

  • 收到日期:2017年10月11日

  • 接受日期:2017年10月28日

  • 发表日期:2017年11月02