结核病:意见- Sci Forschen德赢娱乐国际

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研究文章
基于微阵列的与呼吸道感染相关的病毒病原体分子检测

Muhammet Guzel Kurtoglu1*欧雅Akkaya1Ayse Ruveyda Ugur1Edibe Nurzen Bozkurt2Nurettin岩石3.

1土耳其科尼亚医学微生物学系科尼亚训练研究医院
 2土耳其共和国，卫生部，土耳其安卡拉
 3.土耳其统计研究所，安卡拉地区理事会，土耳其安卡拉

*通讯作者:Muhammet Guzel Kurtoglu, Konya培训和研究医院，医学微生物学系，土耳其，Konya，电话:00903323236709;电子邮件:kurtoglumg@gmail.com


摘要

病毒是全世界急性呼吸道感染(ARI)的主要原因，估计发病率为20-60%。本研究的目的是通过基于微阵列的多重PCR检测方法，及时识别儿童和成人呼吸道感染症状患者的呼吸道病毒病原体，并调查病原体随年龄和季节的发生频率。

2013年1月至2015年12月，共纳入1290例1个月至75岁的ARI患者。采用微阵列逆转录酶聚合酶链反应(M-PCR)方法，在呼吸道标本中检测人呼吸道病毒(RSV)、人鼻病毒(HRV)、流感病毒(IV)、人博卡病毒(HBoV)、副流感病毒(PIV)、人偏肺病毒(HMPV)、腺病毒(ADV)和人冠状病毒- 229e (HCoV-229E)。

在1290例患者中，1110例(86%)为儿童，180例(14%)为成人。在750份(58%)样本中至少确定了一种病原体。750份阳性标本中，单病毒感染率为76%，联合感染率为24%。165份标本中检出双病毒剂，15份标本中检出三联病毒剂。2013年、2014年和2015年样本总阳性率分别为41%、33%和26%。阳性标本大部分来自儿科门诊(94%)，64.4%的病毒性ARI患者年龄≤2岁。冬季和春季阳性率分别为40%和39%。检测到的最常见病毒如下;RSV (47%)， HRV (15%)， IV (10%)， HBoC和PIV (8%)， HMPV和ADV (%5)， EV和HCoV-229E(%1)。

关键字

呼吸道感染，病毒，病原体，微阵列，多重PCR

介绍

病毒是全世界急性呼吸道感染(ARI)的主要原因，估计占所有病例的20-60%[1-3]。引起急性呼吸道感染最常见的病毒是;甲型流感和乙型流感(IAV和IBV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒(PIV)、腺病毒(ADV)和人鼻病毒(HRV)。近年来，人偏肺病毒(HMPV)和人冠状病毒(HCoV)等新出现的病毒与ARI[4]有关。

据报告，全球每年的肺炎发病率在0.28%至1.16%之间。急性呼吸道感染(ARI)的发病率和死亡率在生命早期和老年阶段均呈上升趋势，一直是三大致死原因之一。世界卫生组织(WHO)报告2014年中等收入国家5岁以下儿童ARI死亡率为13-15%，指出其总死亡率高于艾滋病、疟疾、麻疹等大多数传染病，甚至高于其总死亡率[6]。

目前的疫苗不能有效预防病毒引起的呼吸道感染。因此，对病毒性呼吸道感染应采取有效的控制和治疗措施。由于地理、气候和社会经济因素的不同，需要采用不同的方法来避免不同病毒引起的感染[7-10]。

Paramyxoviridae家族的RSV是一种包裹病毒，具有单身RNA基因组。RSV菌株分为两个主要群体;RSV-A和RSV-B取决于它们的抗原和遗传多样性RSV是婴儿和幼儿的支气管炎和肺炎的重要病因。RSV也是成人发病率和死亡率的重要原因。属于Picornaviridae的HRV和肠病毒（EV）也可能导致儿童的上呼吸道感染。它们是具有单链RNA基因组的非包裹病毒。HRV有超过100个血清型。肠道病毒属中已鉴定十二种和超过100个亚型。流感病毒（OrthomyXoviridae）被包膜病毒，具有单链和分段的RNA基因组。Para流感病毒是副乳柳虫仙女家族的成员，拥有包络和单链RNA。 They cause upper and lower airway infections such as rhinitis, otitis, laryngotracheobronchitis, and pneumonia. Human bocavirus (HBoV), which causes acute respiratory infections, was identified in 2005 as a new parvovirus of the Parvoviridae family. It is an non-enveloped and single-stranded DNA virus. An enveloped RNA virus, HMPV can cause acute respiratory tract infections in children and in adults. ADV is a non-enveloped double-stranded DNA and can cause respiratory tract infections in addition to gastroenteritis, cystitis and meningoencephalitis. Up to now, over 50 serotypes of ADV have been identified. HCoV is a single stranded RNA virus and implicated in respiratory tract infections, enteritis, cardiovascular infections and neurological defects [11].

RSV、IAV、IBV、ADV、PIVs -3和HMPV可通过直接荧光抗体和细胞培养方法鉴定。除上述病毒外，还可用分子方法检测HRV、HCoV、HBoV、PIV 4、RSV血清型A型和B型。近年来，多重聚合酶链反应(multiple polymerase chain reaction, M-PCR)方法在实验室中也被广泛应用于ARI的早期诊断[12,13]，该方法可以同时检测多种呼吸道病毒。

很少有流行病学研究调查不同年龄组，特别是土耳其儿童中引起急性呼吸道感染的病毒病原体的频率。本研究的目的是通过基于微阵列的多重PCR检测方法，及时识别儿童和成人呼吸道感染症状患者的呼吸道病毒病原体，并调查病原体随年龄和季节的发生频率。

材料和方法
取样和逆转录酶PCR检测

从就诊于各种诊所(主要是儿科诊所和胸科诊所)的患者身上采集的鼻咽刷样本，以适当的病毒运输介质(HiViral)送到实验室TM交通媒体，HIMEDIA，印度)在2013-2015年期间约36个月。-20ºC保存至RNA/DNA提取。对每个样本，采用CLART进行基于微阵列的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测®提取RNA/DNA后的肺病毒（西班牙基因组）。最常见的19种呼吸道病毒，RSV A型（RSV-A）、RSV B型（RSV-B）、HRV、甲型流感（H3N2、H1N1、B、C和H1N1/2009亚型）、HBoV、PIV 1、2、3和4（A、B亚型）、ADV、HCoV-229E、肠病毒（回声病毒）、HMPV（A和B亚型）通过扩增病毒基因组的特定片段来检测和表征。使用扩增内部控制来确保过程的适当执行。扩增过程完成后，使用低密度微阵列平台：CLART检测扩增子（临床阵列技术），通过其8孔条带形式的平台，使得产品沉淀的杂交和可视化非常容易（图1）[14]。

计算男性和女性患者的发病率和年龄。根据病人的年龄、季节和诊所来测量病原性病毒的分布。采用Z检验估计各季节病毒发生频率。

图1:CLART-StripR -CS平台采用8口井的条带形式。

结果

2013年1月至2015年12月期间，在科尼亚教育与研究医院各诊所就诊的发热、喉咙痛、咳嗽和呼吸困难患者(年龄1个月至75岁)。查体后，1290例患者因出现ARI症状体征、听诊异常、胸片异常而确诊为ARI。最常见的症状是发热(≥38o C)、咳嗽和喉咙痛。采集1290例患者呼吸道标本。其中男性684例(53.1%)，女性606例(46.9%)。大多数患者是儿童(86%对14%)。平均年龄为5.66岁(SD=12.81116)。年龄组的范围见表1。

年龄 ≤2. 3 - 5 6 - 18 19-59 ≥60 总计
n（%） 328 (25.4) 475 (36.8) 307 (23.8) 79 (6.2) 101 (7.8) 1290 (100)

表1:ARI患者年龄分布[n (%)]

呼吸道标本采用多重RT-PCR检测(图2-4)。540例(42%)样本未检测到病毒制剂，750例(58%)样本至少检测到一种病原体。在750例样本呈阳性的患者中，686例为儿童，64例为成人(表2)。病毒制剂在冬季(40%)和春季(39%)更常见。570份(76%)阳性标本中检出一种单一病毒病原体，180份(24%)样本中检出多种病毒制剂(表3和4)。大多数阳性标本(96%)来自儿科诊所。165份样本中检出双重病原体，15份样本中检出三倍病原体。19种病毒中，RSV是最常见的病毒(47%)，其次是HRV(15%)和A-B型流感(10%)。多种病毒的比率为24%(表4)。混合感染中最常见的病毒是RSV，其次是流感病毒和腺病毒。

图2:微阵列井。

图3:患者的阴性结果。

图4：患者的阳性结果。

年龄 ≤2. 3 - 5 6 - 18 19-59 ≥60 总氮
RSV 150例(31%) 90例(53%) 15 (44%) 8 (24) 5 (17%) 268
HRV 53 (11%) 17 (10%) 5 (15%) 8 (24) 3 (10%) 86
4 24 (5%) 14 (8%) 8 (23%) 5 (14) 6 (20%) 57
HBoV 28 (6%) 8 (5%) - 8 (24) 3 (10%) 47
此外 38 (7.8%) 5 (3%) - - - 43
HMPV 25 (5%) 3 (2%) 3 (9%) - - 31
阿德 19 (4%) 2 (1%) 3 (9%) - 2 (7%) 26
电动汽车 5 (1%) - - - 1 (3%) 6
hcov - 229 e 1 (0.2%) - - 2 (5) 3 (10%) 6
合并感染 140例(29%) 30 (18%) - 3 (9) 7 (23%) 180
总n (%) 483例(64.4%) 169例(22.6%) 34 (4.5%) 34 (4.5%) 30 (4%) 750

表2:根据年龄范围检测到病毒的比率[n（%）]

病毒 冬天
n (n / 216 = %)		 春天
n (n / 227 = %)		 夏天
n (n / 40 = %)

秋天n (n / 87 = %)

总氮
RSV 126 (58) 130 (58) 2 (5)

10 (12)

 268
HRV 12 (6) 30 (13) 8 (20)

36 (41)

 86
4 23日(11) 30 (13) 3 (7) 1 (1) 57
HBoV 11 (5) 9 (4) 13 (32)

14（16）

 47
此外 14日(6) 0 7 (18)

22 (25)

 43
HMPV 20 (9) 10 (4) 1 (3) 0 31
阿德 6 (3) 12日(5) 4 (10) 4 (5) 26
电动汽车 0 4 (2) 2 (5) 0 6

hcov - 229 e

 4 (2) 2 (1) 0 0 6

单一病毒感染

 216 (38) 227 (40) 40 (7)

87 (15)

 570

交叉感染

 88 (49) 65 (%6) 12 (7) 15 (8) 180

总n (%)

 304 (40) 292 (39) 52 (7)

102 (14)

 750

表3:按季节检测到的病毒分布率[n (%)]

病毒 2013
n (n / 235 = %)		 2014
n (n / 180 = %)		 2015
n (n / 155 = %)		 总氮
RSV 97 (41) 98 (54) 73 (47) 268
HRV 47 (20) 20 (11) 19 (12) 86
4 24 (10) 15 (8) 18 (12) 57
HBoV 18日(8) 18 (10) 11 (7) 47
此外 16日(7) 12 (7) 15 (10) 43
HMPV 15 (6) 8 (4) 八(5) 31
阿德 12日(5) 6 (3) 八(5) 26
电动汽车 2 (1) 1 (1) 3 (2) 6
hcov - 229 e 4 (2) 2 (2) 0 6
单一感染 235 (41) 180 (32) 155 (27) 570
合并感染 70 (39) 70 (39) 40 (22) 180
总n (%) 305 (41) 250 (33) 195 (26) 750 (100)

表4：按年份检测到的病毒分布率[n (%)]

冬季和春季阳性率分别为40%和39%。呼吸道合胞体病毒在冬季和春季检出率最高，HRV在秋季检出率最高，IV在春季检出率最高(表3)。2013年、2014年和2015年样本总阳性率分别为41%、33%和26%。(表4)。经Z检验统计(Z值>Z(0.05)表值)，差异有显著性。

讨论

呼吸道感染是世界上最常见的传染病中的主要疾病。因此，急性呼吸道感染的高发病率和高死亡率带来的治疗费用、住院费用、劳动力损失等因素，造成了巨大的经济负担。此外，它仍然是一个巨大的问题，因为它是5岁以下儿童死亡的主要原因之一。下呼吸道感染(LRTI)较上呼吸道感染(URTI)少见。但是，LRTI的经济影响高于URTI。1-13%诊断为LRTI的患者住院治疗。据估计，儿童的病毒性LRTI治疗费用每年约为24亿美元。

5岁以下儿童最常见的病毒病原体是RSV、HRV、PIV、IV和HBoV，其次是HMPV、ADV、EV和HCoV。成人(≥19岁)中最流行的病毒为RSV、HRV、IV和HBoV，其次是HCoV、ADV和EV。值得注意的是，PIV和HMPV在成人中未检出。

与我们的研究一致，Akkaya et al.[16]报道，HRV是儿童ARI的第二大常见原因，但RSV和IV是成人最常见的两种病毒。广泛的流感疫苗接种计划可能是RSV相关ARIs相对上升的原因[16,17]。

Hak等人[18]报道了荷兰最常见的导致呼吸道感染的病毒病原体有:IV、PIV、RSV和advv。在不同的研究中也有报道PIV是主要的病毒病原体，特别是在免疫不完全的幼儿中可引起再次感染[19,20]。中国最常见的致病病毒为IV(30%)、PIV(18%)、RSV(16%)、ADV(15%)、HRV(11%)和HMPV(1.5%)[21]。

在我们的研究中，2013- 2015年期间，HRV和HMPV的检出率略有上升，RSV和HBoV的检出率在2014年有所上升，IV和PIV的检出率在2015年有所上升。与文献一致，我们发现RSV和IV在冬季和春季比秋季和夏季更常见。HRV在秋季和夏季最常见，在冬季和春季频率有所下降。HBoV、ADV和肠道病毒的检出率在夏季呈上升趋势，PIV检出率在秋季最高，春季未检出。此外，尽管2013-2015年全年的总频率非常低，但秋季和冬季未检出肠道病毒，夏季和秋季未检出HCoV。

与我们的研究一致的是，不同的研究者报道了北半球冬季呼吸道病毒更常见，并且RSV和IV是最常见的病毒病原体[16,21-26]。HCoV、HMPV和HBoV的检出率在各种研究中分别低至10-15%、2-12%和1-5%[3、18、23、24、27]。有趣的是，在本研究中，31例HMPV均仅在儿童中检测到。其他研究也在儿童中检测到HMPV，[21]。在我们的研究中，ADV在儿童中比在成人中更常见，这与文献中的各种研究一致[9,28,29]。ADV全年在所有年龄组均有地方病发生，特别是在免疫抑制患者中[30-32]。

HCoV是成人重要的呼吸道病原体。我们仅在一名2岁以下的儿科患者和五名成人病例中检测到HCoV。有许多研究报道HCoV在成人中比在儿童中更常见[21,34,35]。也有研究报道HCoV导致ARI在免疫抑制患者中更为常见[32,36,37]。

本研究发现单病毒感染率为76%，这在儿童年龄组(77%)中经常观察到。许多研究人员报道，单次感染更常发生在儿科年龄组，发病率从35.15%到36.6%不等[18,21,38-44]。

最近发展起来的M-PCR技术也显示多种病毒可以同时感染呼吸道，特异性和敏感性都很高[45-50]。在我们的研究中，合并感染率为24%。RSV病毒最常见的组成部分,其次是第四,并放置在不同的研究中,合并感染率各有不同的速度5 - 62%,据报道,这些感染RSV是最常见的组成部分,其次是副词,HBoV, IV(51岁,18日,22日,52)。这些研究结果与我们的研究结果一致，并且合并感染多见于儿童年龄组[22,24]。

生物技术概念上到达的终点之一是微阵列方法。它的原理是允许在一个简单的芯片上显示目标基因组。它还允许确定许多基因的相互作用。微阵列技术最初起源于“南方杂交”技术。这种快速自动化的技术也被用于基因表达分析、基因和突变分析、环境研究、抗药性基因分析，以及识别传染源[53,54]。在两项研究中，在调查了511份病毒病原体的样本中，有349份通过微阵列鉴定为阳性，这与PCR和DNA测序方法获得的结果一致[55]。因为微阵列方法是一个自动化系统，它最大限度地减少了人为错误[56]。尽管有许多优点，但必须知道微阵列方法也有一些缺点，例如一次执行太多数据，需要花时间分析所有结果，复杂的解释性结果通常不够定量，并且仍然是一项昂贵的技术[57]。

结论

总之，在本研究中，我们在初步诊断为ARI的患者中检测到病毒病原体，患病率为58%，其中大多数为小儿年龄组(86%)。呼吸道病毒感染在冬季和春季更为常见。合并感染多见于儿科患者。RSV、HRV、IV和HBoV是最常见的病原体。及时和同时查明所有病原体对疾病的预后以及减少治疗费用和住院时间至关重要。基于微阵列的多重PCR方法具有较高的敏感性和特异性，可以同时检测多种病原体并进行早期诊断，避免不必要的抗生素使用，降低ARI的发病率和死亡率。因此，M-PCR可以被认为是传统诊断方法的替代方法。病毒感染的早期诊断很重要，因为它减少了治疗费用和住院时间。我们将病毒出现频率略有差异的原因归结为患者群体的人口统计学特征的差异、季节变化和特定的流行差异。

对病毒性急性呼吸道感染(ARI)进行快速和准确的诊断非常重要，特别是对住院患者而言，这样可以避免不必要的抗生素使用，采取必要的感染控制措施，如果存在针对病原体的特定抗病毒治疗，则可以在必要时给予特定治疗。此外，在病毒病原体鉴定的帮助下，信息的改进允许根据病人的年龄和季节等因素预测病原体。因此，我们推荐M-PCR在儿科ARI住院患者诊断中的应用。

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条信息

文章类型:研究文章

引用:Kurtoglu MG, Akkaya O, Ugur AR, Bozkurt EN, Kaya N(2017)基于微阵列的呼吸道感染相关病毒病原体的分子检测。J感染Pulm病3(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2470-3176.122

版权:©2017 Kurtoglu MG，等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

  • 收到日期:2017年1月31日

  • 接受日期:2017年2月17日

  • 发表日期:2017年2月23日