摘要

哮喘的发病率和严重程度在世界范围内持续上升。β-激动剂是治疗哮喘最常用的处方药物，但对一些哮喘患者疗效较差，长期持续使用会产生副作用。开发新型哮喘治疗方法的需求突出了使用相关体内动物模型有效筛选和测试潜在支气管保护化合物的标准化方法的必要性。在这里，我们描述了一种验证的方法，以测试潜在的治疗化合物在室内尘螨攻击动物模型诱导支气管收缩期间的快速疗效。

关键字

支气管扩张剂;体内;哮喘

介绍

哮喘是一种慢性且常为长期的肺部疾病，其特征是炎症和可逆性气道阻塞。哮喘的发病率和严重程度在全球范围内持续上升，据报道，2015年有多达2400万美国人（成人的7.4%和儿童的8.6%）患有哮喘[1]。哮喘影响男女，与年龄、社会经济背景和种族无关。虽然大多数哮喘患者在医生的指导下得到了良好的治疗和预防措施，但是没有治愈的方法，而且哮喘患者的亚群对普通疗法的反应很差。哮喘发病率和死亡率的一个重要原因是急性加重，可导致气道损伤、重塑、肺功能下降甚至死亡[2-4]。严重哮喘患者的病情恶化尤其令人担忧，因为该人群的病情恶化与肺功能加速下降有关[2]。

由于肺功能下降是严重加重的危险因素[5,6]，这种恶性循环促进了哮喘加重倾向表型。此外，对于长期使用最常用的处方哮喘药物(皮质类固醇[7]或短效β2激动剂)的副作用也存在担忧[8,9]。因此，随着哮喘患病率的上升，需要更好地控制病情恶化，以及希望减少常用哮喘药物的长期副作用，提高了对使用相关体内动物模型有效筛选和测试潜在支气管保护化合物的标准化方法的需求。

目前，强迫振荡技术(FOT)是在小动物体内进行肺功能试验(pft)的金标准[10,11]。该技术通过在受试者气道开口处应用一个简短、小幅度、振荡的气流测试信号，并表征输入信号和输出信号[10]之间的关系，提供了准确和可重复的动物肺功能测量。

在肺力学的单室模型中使用预定义频率(2.5 Hz)的单个正弦波，测量整个呼吸系统[12]的总阻力(Rrs)和弹性(Ers)。相比之下，宽带低频测量是使用覆盖宽频谱(1-20.5 Hz)的互素频率波范围进行的。在常相模型中使用这些测量值来分离出与中央气道(Rn)和外围气道(G, H)[12]相关的值。

虽然这项技术可以适用于多种动物模型，但小鼠是迄今为止在哮喘研究中最常用的物种。正如Bates & Irvin[13]所描述的，该技术要求对受试者进行麻醉、气管切开或口服插管和机械通气。使用脚本可以预先定义PFT测量的自动化序列，以重复捕获呼吸系统在梗阻和僵硬以及/或中央气道和周围组织力学之间的划分方面的整体变化。pft可以在基线条件下进行，也可以通过一系列的methacholine挑战来评估实验动物[11]的气道反应性。

虽然研究人员采用了各种方法来模拟体内使用支气管扩张剂化合物，但其输送方法（皮下输注、腹腔注射、气管内滴注）并不总是与支气管扩张剂的临床输送一致[14,15].最近的研究使用了与临床环境中的药物输送更为一致的给药技术，使用了雾化器、单鼻吸入或鼻内输送技术[16-22].尽管上述所有研究都获得了相关信息，但在支气管收缩事件期间，对潜在的新型治疗性吸入化合物进行一致的验证方法测试，以快速缓解快速发作的支气管保护作用，目前尚未发表。

我们在此描述一种改进的实验方法，以测试潜在的快速作用的支气管保护化合物在甲胆碱挑战。我们使用一种常见的哮喘支气管扩张剂沙丁胺醇硫酸盐(Nephron Pharmaceuticals Corporation)验证了我们的方法，这是一种快速吸入短效β2激动剂，用于快速逆转哮喘患者的支气管收缩。

方法

为了验证我们的方法，我们采用8-10周龄Balb/C公、母小鼠致敏，并用100µg屋尘螨提取物(HDM;在异氟醚麻醉下进行三次鼻内滴注(图1A)。最后一次HDM刺激后两天，用无菌dH中制备的浓度为125 mg/ml的聚氨酯(Sigma, U2500)麻醉小鼠_2.O并以16微升/克体重腹腔内给药。一旦达到手术麻醉平面，受试者的气管用19号金属套管按照前面描述的方法进行插管[11,23]。接下来，受试者连接到商用计算机控制的活塞式呼吸机（flexiVent，SCIREQ Inc.，蒙特利尔，Qc，加拿大）用于机械通气和PFTs[11]。一种麻痹剂，潘库溴铵（0.8 mg/ml盐水，Sigma P1918），然后通过腹腔注射给麻醉小鼠，体积为10微升/克体重，以防止受试者在PFTs期间的任何干扰。在默认机械通气设置（150次呼吸/分钟，潮气量为10毫升/千克，PEEP为3 cmH2 O）下的短暂平衡期后，两次招募操作（充气至30 cmH的标准压力_2.O超过3秒并保持3秒)，以打开封闭的肺区域并标准化肺容量史。

图1：（A）小鼠在第0、7和14天接受HDM攻击。第16天，所有的HDM小鼠被分为两组B):对照组（左图）;用盐水，和沙丁胺醇组（右图）雾化;雾化用硫酸沙丁胺醇（在盐水中0.083％）。（C）之后，两组均立即接受雾化乙酰甲胆碱支气管缩窄剂激发（10、30、100 mg/ml），并使用强迫振荡技术记录肺功能。箭头指示何时给予生理盐水或沙丁胺醇和乙酰甲胆碱。

启动了一个预先定义的脚本，用于在支气管收缩事件中测试快速作用的支气管保护治疗化合物(图1B)。首先是两次深度充气，然后是连续的两次密集雾化，使用两个独立但相同的喷雾器头(Aeroneb实验室喷雾器;细雾模型，与吸气同步，在50%占空比下运行12秒)。在使用强制振荡技术进行紧密间隔呼吸力学测量的自动化序列之前，这两种试剂被用于立即输送两种不同的试剂(图1C)。

在人类中，暴露于雾化器化合物用于评估气道高反应性和哮喘。可在受试者暴露于支气管扩张剂、支气管收缩剂或其他制剂（如过敏原）之前和之后评估肺功能。这使我们能够确定支气管阻塞的可逆性或相对气道高反应性，两者都可以作为人类气道疾病的重要标志物。在我们的鼠标模型中，我们使用了类似的方法。沙丁胺醇用作支气管扩张剂，以防止暴露于乙酰甲胆碱时出现支气管收缩。试验化合物可替代支气管扩张剂或支气管收缩剂，以评估其调节气道反应的能力。

在本研究中，所有小鼠接受两个随后盐水挑战，因为这被用作用于两个喷雾器的控制。紧接在之前的控制（图1，左面板）和沙丁胺醇治疗组（图1，右图），在那里它们分别接受硫酸沙丁胺醇或其载体（盐水）的气溶胶：然后将它们在两个实验组划分雾化乙酰甲胆碱诱发支气管收缩的挑战。第二气溶胶攻击（即生理盐水或乙酰甲胆碱）结束后十五秒钟，紧密间隔的FOT测量的循环被启动。单频（快照-150; 2.5HZ）和宽带（快速素-3; 1-20.5赫兹）FOT测量交替几秒钟间隔，总共每扰动12个测量在一段约3分钟。该协议被总共重复四次用乙酰甲胆碱浓度的增加（0，10，30，100毫克/毫升）。从脚本到结束的开始时的机器上的整个实验方案的持续时间大约是每只小鼠17分钟（4分钟每个周期×4个周期12秒）。这是要注意重要的是先于每一胆碱激发时，受试者接受了新的生理盐水或沙丁胺醇硫酸盐气溶胶的挑战。这样做是为了确保增加的支气管收缩（图1C）中适当的输送到气道中，而且足够的药物暴露完成。在本研究中，在整个协议，类似于在临床环境中用于完成硫酸沙丁胺醇（0.083％）的相同浓度。 It was always administered prior to the methacholine challenge in order to prevent nebulization artifacts and delays on the bronchoconstrictor response. The efficacy of this commonly used asthma drug was assessed by comparing peak responses between subject groups for each respiratory mechanic’s parameter studied.

结果

呼吸系统阻力(R_rs)反映呼吸频率下的整体气流阻力。R_rs根据经典的单室肺模型计算，与单频FOT实验数据相吻合。它包括来自传导气道和周围气道、组织和胸壁的贡献。在目前的验证研究中，所有给予沙丁胺醇的小鼠的R_rs与在所有的乙酰甲胆碱浓度下（图2A）与对照组中的值。

图2：从hdm致敏和激发小鼠的呼吸力学参数，给药(盐实线)或沙丁胺醇(0.083%-虚线)在每一个methacholine激发前立即。结果显示为平均值±SEM，每组n=11-15只小鼠。每个参数的统计学意义显示为沙丁胺醇和生理盐水在各自挑战的比较。* * * p < 0.05, p < 0.01。

呼吸系统弹性(E_rs）量化整个呼吸系统的潮式呼吸过程中的整体刚度。它还从肺被拟合的经典单室模型的单一频率FOT实验数据计算的。

在对照组小鼠中，E_rs在我们的实验条件下，沙丁胺醇治疗显著地阻止了乙酰胆碱诱导的E_rs在过敏小鼠中（图2B）。

牛顿阻力(R_n)主要由不涉及气体交换的大型传导气道的阻力决定。该参数由恒定相位模型[24]与宽带FOT测量[10]的阻抗数据拟合而得。沙丁胺醇处理小鼠的R显著降低_n10 mg/ml和30 mg/ml乙酰甲胆碱激发时的值高于其溶媒处理对照组。在最高乙酰甲胆碱浓度下也有保护趋势（p=0.08）（图2C）。

组织阻尼(G)也是一个常数相模型[24]参数，反映了由于摩擦在组织内损失的能量量的测量。它与组织阻力密切相关，组织阻力包括对周围气道空气流动的阻力。在增加methacholine刺激后，对照组小鼠的参数G增加，在30和100 mg/ml的methacholine刺激期间，沙丁胺醇处理小鼠显著钝化(图2D)。

组织弹性(H)是组织刚度的一个指标。它是从定相模型[24]计算出来的，表示组织收缩到原始形状的能力。与对照组小鼠相比，沙丁胺醇处理小鼠的H值降低，尽管在任何methacholine处理下，两实验组之间的差异没有统计学意义(图2E)。总的来说，我们通过FOT测量的气道生理学参数的结果与那些已经发表的没有药物干预的HDM小鼠的结果相似。

讨论

虽然我们认识到小鼠过敏原挑战模型经常被用作哮喘研究的工具，但我们也承认，在这个系统中，人类哮喘的复杂性不太可能被充分建模。我们的目标是建立哮喘、气道高反应的一种特定疾病表型模型，并验证一种系统来测试化合物以减弱动物模型中的这种反应。正如Kumar和Foster[26]在一篇综述中详细讨论的那样，在小鼠哮喘模型中观察到的几个因素与人类哮喘症状非常不同。其中最值得注意的是，与人哮喘肺相比，过敏小鼠肺中血管周围和水肿性炎症的不同模式，小鼠灌洗液中嗜酸性粒细胞的数量较高(小鼠中嗜酸性粒细胞占总细胞的40-80%，而人哮喘患者灌洗液中嗜酸性粒细胞占~1-5%)，小气道闭合与平滑肌收缩无关[26]。然而，考虑到所有这些差异，人们普遍认为，支气管收缩剂刺激导致气道关闭，从而有助于在人类哮喘和过敏性气道疾病[27]小鼠模型中气道高反应性的机制。

由于与哮喘相关的最衰弱的表型是喘息和气促，这两种症状都是由支气管收缩增加引起的，因此需要快速作用的治疗药物来治疗这些哮喘性支气管痉挛。β-激动剂是治疗哮喘最常用的处方药，但其疗效较低cacy用于某些哮喘患者亚群。随着哮喘负担的不断增加，需要新的不同靶点来缓解支气管收缩，以及在临床前水平上筛选或测试它们的方法。快速作用药物，如沙丁胺醇，或治疗哮喘的新疗法之前已经在动物实验中进行了评估然而，至少在小鼠身上，这些化合物从未在支气管收缩事件中给予。我们提供了一种经验证的、自动化的体内实验方法，在该方法中，可以重复测试潜在的快速作用支气管保护药物，以推进新型哮喘治疗剂的开发。

财务报表的兴趣

在进行研究时，JM和AR受雇于SCIREQ Inc.，这是一个涉及与本出版物内容相关的主题领域的商业实体。SCIREQ是一家emka科技公司

基金

NIH向JGL授予HL111151和HL125602。

作者贡献

研究概念和设计：KJA、JM、MOD和JGL；采集、分析解释：KJA、JM、MOD、AR、JGL；起草手稿：KJA、MOD、JGL；重要技术细节手稿的关键修订：JM、AR。

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文章信息

文章类型:研究文章

引用:Addison KJ, Morse J, Robichaud A, Daines MO, Ledford JG(2017)一种新型的体内支气管扩张剂测试系统。J感染Pulm病3(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2470-3176.120

版权:©2017 Addison KJ等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

收到日期:2016年12月22日

接受日期:2017年1月30日

发表日期:2017年2月3日