摘要

为研究妊娠和妊娠期间添加或不添加植物甾醇的母亲高脂肪和能量饲粮对子代氧化状态的影响，将怀孕的C57BL/6j小鼠随机分为3组，分别为鼠粮对照组(NC)、高脂能量饲粮组(HFED)和高脂能量饲粮中添加植物甾醇组(HFEP)。一旦断奶，幸存的后代老鼠被喂食鼠粮直到10周大。在10周的后代中测定血清脂质。肝脏匀浆氧化生物标志物分析根据制造商的方案。结果表明，与鼠粮组相比，HFED组小鼠体重、血脂均显著升高。HFED组母鼠和新生鼠肝脏匀浆氧化应激明显升高。新生和成年小鼠肝脏抗氧化能力受损。早期补充植物甾醇可改善子代的异常血脂代谢，但不能改善子代的氧化损伤。

关键字

植物甾醇；母体高脂高能量饮食；胎儿发育；氧化剂；抗氧化；脂质代谢

介绍

母亲的饮食可能会影响胎儿在子宫内的发育，现在，母亲的饮食被认为是成年期慢性非传染性疾病的根源[1-3]。巴约和他的同事报告说，在胎儿期和哺乳期接触母亲垃圾食品的大鼠在出生后10周体重超重[4]。许多其他研究还表明，在怀孕和哺乳期间喂食高脂肪饮食的母亲的大鼠，其后代表现出代谢综合征的特征，如肥胖、久坐行为和血管功能障碍[1,5,6]。

高脂肪饮食的摄入会扰乱能量摄入、消耗和储存之间的平衡。它会导致肥胖增加，并损害多种代谢过程的调节，包括肥胖、胰岛素抵抗和脂质氧化[7,8].据报道，引发胰岛素抵抗发展的最初事件是高脂饮食喂养的小鼠产生活性氧（ROS）[9]这表明ROS的产生可能是触发高脂饮食诱导的代谢综合征的最初关键事件。事实证明，母亲的高脂喂养与肝脏氧化应激增加、抗氧化能力降低相关，并导致大脑氧化应激升高和morris水迷宫穿孔减少小鼠中的nce[10]。新生儿、哺乳期和成年后代是否存在同样的氧化应激趋势，这种变化是否受母体高脂肪和高能量饮食（HFED）的影响尚不清楚。植物甾醇是一组天然存在于植物中的甾体和酯类，可通过与饮食和胆汁胆固醇竞争来降低血清胆固醇浓度用于肠道吸收和增强胆固醇排泄的甾醇[11,12]。此前，我们曾报道，在幼年食用植物甾醇可能有助于减轻母体高脂肪饮食对小鼠胆固醇代谢的不利影响[13]然而，植物甾醇对母体高脂饮食引起的氧化应激的影响尚未阐明。在本研究中，我们调查了母体高脂饮食对离体发育和氧化应激的影响，并评估了孕期和哺乳期摄入植物甾醇的影响。

材料和方法

材料

植物甾醇购自中国西安蓝天生物工程有限公司，成分如表1所示。采用巴伦医疗设备有限公司(北京，中国)罗氏诊断试剂盒测定血清脂质谱。采用商品化试剂盒分析新生儿肝脏匀浆中活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量。

表1:植物甾醇的组成

动物和饮食

C57BL/6j小鼠体重18-22 g（10周龄），来自北京大学健康科学中心动物服务处。在首都医科大学实验动物中心进行治疗前，所有动物均适应活体动物饲养1周。有温度、湿度和光循环的自动控制。在整个研究过程中，温度和湿度分别为20-24°C和40%-70%，每小时至少换气15次。光照时间为8:00-20:00。允许动物自由获取食物和水随意．留宿1周后，将2只雌鼠与1只雄鼠同笼过夜，每天检查雌鼠阴道有无堵塞。雌性小鼠在确认怀孕后，随机分为3组，每组30只，处理方法如下:高脂高能量饲粮(HFED, 84%鼠粮+16%猪油脂肪+0.2%胆固醇，总能量439.68 kcal/100 g)、高脂高能量饲粮中添加植物甾醇(HFEP, 82%鼠粮+16%猪油脂肪+0.2%胆固醇+1.5%植物甾醇，84%鼠粮+16%猪油脂肪+0.2%胆固醇+1.5%植物甾醇，82%鼠粮+16%猪油脂肪+0.2%胆固醇+1.5%植物甾醇，82%鼠粮+16%猪油脂肪+0.2%胆固醇+1.5%植物甾醇)。总能量439.68千卡/100克)。这些饲料在怀孕和哺乳期间保持不变，然后幸存的后代喂食鼠粮直到10周龄。新生小鼠随机分为新生组、断奶组和10周龄组。分别于0日龄、21日龄和10周龄记录体重后，采用颈脱位法处死小鼠。然后采集肝脏并称重。相对肝重计算为肝重与体重之比。所有肝脏立即用液氮冷冻，-80°C保存，待进一步研究。

所有实验步骤均按照《实验动物护理原则》(NIH出版物No.85-23，修订1985)和首都医科大学动物研究委员会的指导方针进行。德赢vwin首页网址

生化试验

取10周龄小鼠子代全血，3000转离心10分钟，分离血清约0.4 ml。采用日本日立7180全自动生化分析仪(Hitachi 7180, Tokyo, Japan)测定血清总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。

肝脏氧化状态测量

小鼠(母鼠及子代)肝脏洗净，超声细胞粉碎，用0.9 g/L盐水、氯化钠冰匀浆。以2′，7′-二氯荧光素(DCFH)为探针，参照Bejma[14]测定匀浆中肝脏活性氧(ROS)含量。肝脏(20 mg)在80µl PBS (0.1 mM, Ph 7.0)缓冲液中彻底剁碎，用电动Potter Elveljem玻璃均质器在冰上均质。肝匀浆4℃离心(13000 r/ min, 15 min)。部分匀浆(10µl)用于测定ROS的产生。H₂O₂标准曲线(图1)根据美国圣地亚哥Cell Biolabs提供的方案制作，H₂O₂浓度范围为0 ~ 70 μ M。用Cary Eclipse荧光分光光度计在485 nm激发/530 nm发射下读取荧光。

按中国南京建城生物工程研究所(NanJing Jiancheng Bioengineering Institute, China)的标准，测定小鼠肝脏匀浆的总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和MDA含量。

统计分析

所有统计分析均采用SPSS 18.0 for Windows软件（美国伊利诺伊州芝加哥市SPSSInc）。数据采用单因素方差分析。当p<0.05时，考虑显著性。

结果

HFED和HFEP对雄性后代发育的影响

与饲料组相比，HFED组新生小鼠和哺乳小鼠的平均体重显著增加(p<0.05)，而成年后代的体重在三组间无显著差异。与高频组相比,新生儿HFEP组小鼠的体重明显降低(p < 0.05),但对于吸吮和成年老鼠,它没有明显改变了HEFP组(表2)。在新生儿阶段,所有测试雄性老鼠的肝脏相对重量没有显著改变,而HFEP组女性肝脏相对重量较其他组略有下降。在吸吮期(21日龄)，HFED组小鼠的相对肝脏重量显著增加。而在成人期(10周龄)，HFEP组的相对肝脏重量增加幅度最大(表3)。

表2:孕期和哺乳期母体高脂肪高能量饮食对小鼠后代体重的影响（g，平均值±SD）NC：周粮，正常对照组；HFED：高脂高能量饮食；HFEP：添加植物甾醇的高脂高能量饮食；0d：小鼠子代出生当天；21d：小鼠子代断奶当天；10w：小鼠子代出生10周
**表明与对照组相比有显著差异（P<0.01）
*表明与对照组相比有显著差异（P<0.05）
^A.与HFED组比较差异有统计学意义(P<0.05)

表3：妊娠期和哺乳期不同饲粮处理小鼠后代的相对肝脏重量(g/100g.BW) NC:正常对照组;HFED:高脂肪高能量饮食;HFEP:补充植物甾醇的高脂肪能量饮食;0 d:小鼠产仔日;21 d:小鼠后代断奶日;10w: 10周龄小鼠后代
**表明与对照组相比有显著差异（P<0.01）
*表明与对照组相比有显著差异（P<0.05）
^A.表明与HFED组相比存在显著差异（P<0.05）

成年后代的血清胆固醇谱

血清TC水平在早期心血管疾病的评估中具有重要作用。高脂饲料喂养的母鼠妊娠期和哺乳期血清TC和HDL-C水平显著升高(p<0.05)，而植物甾醇的添加抑制了其升高(p<0.05)。母体饲粮中血清LDL-C水平无显著变化(p<0.05)(表4)。

表4:妊娠期和哺乳期不同喂养方式对10周龄小鼠子代血脂的影响(mmol/L，均值±SD)HFED:高脂肪高能量饮食;HFEP:以植物甾醇为补充的高脂肪高能量饮食。
**表明与对照组相比有显著差异（P<0.01）
*表明与对照组相比有显著差异（P<0.05）
^A.表明与HFED组相比存在显著差异（P<0.05）

母鼠及其后代的氧化状态(图2)

新生期，HFED组肝脏SOD、总抗氧化活性(T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)活性均显著低于NC组(图2a、2b和2d)。对于MDA和GSH水平，治疗组没有差异(图2c和2e)。有趣的是，hfed处理过的小鼠肝脏匀浆中ROS水平显著升高，在其新生儿后代中也观察到类似的升高趋势(图2f)。母亲和新生儿肝脏匀浆之间的相关关系被显示(图2g)。

图1:过氧化氢标准曲线

图2:妊娠和妊娠期间母亲高脂肪饮食对新生儿、吸吮和成年小鼠氧化状态的影响。(a)和(d)新生小鼠肝脏中SOD和GSH-Px活性，HFED组明显低于鼠粮组。(b) HFED组总抗氧化能力(T-AOC)显著降低。(c) HFED组吮吸小鼠肝脏MDA含量显著低于鼠粮组。(e)与鼠粮组相比，HFED组吮吸小鼠肝脏匀浆中总谷胱甘肽水平显著升高。(f) HFED诱导大坝的肝脏匀浆中ROS水平显著升高，然后在其新生儿后代中升高。(g)物质肝匀浆ROS与新生儿肝匀浆ROS浓度的相关性。皮尔逊相关系数:r=0。602, p = 0.002。

吮吸阶段，HFED组肝脏SOD、总抗氧化活性(T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)活性逆转下降趋势，较NC组呈现上升趋势(图2a、2b、2d)。MDA水平降低(图2c);与NC组相比，HFED组GSH水平升高(图2e)。

对于10周龄的成年后代，HFED组肝脏SOD活性显著低于NC组，且添加植物甾醇对肝脏SOD活性的降低没有影响。其他氧化应激生物标志物不受母体饮食的影响。

讨论

越来越多的证据表明，富含脂肪和能量的母亲饮食会增加后代成年期胰岛素抵抗、血脂异常、肥胖和高血压的风险[15,16]。有研究表明，氧化应激可能是胎儿在成年期发生疾病的关键[17,18]。在这些研究中，评估了母亲高脂饲料对新生儿、哺乳和成年后代肝脏氧化状态的影响，并观察了在母亲饲料中补充植物甾醇的影响。结果表明，妊娠期和哺乳期的高脂饲料降低了后代的抗氧化活性。同时，我们观察到，与HFED组相比，添加植物甾醇可以改善后代的发育和血清胆固醇水平，而不升高氧化应激。

在本研究中，我们的数据与其他人的报道一致[3,5]，即HFED组成年后代血清TC和LDL-C水平显著升高。HFED组哺乳小鼠的相对肝脏重量显著增加;然而，在新生小鼠和成年小鼠中，没有观察到这种趋势。对新生儿来说，营养物质通过胎盘从母体输送到胎儿，胎盘调节胎儿[19]的营养供给。我们发现，HFED饮食对母体体重和孕期摄食量没有显著影响。相比之下，大坝[20]组血清TC、LDL-C、HDL-C、FFA和胰岛素水平显著升高。为了适应大坝的过度营养状态，脂质合成基因的转录可能受到抑制。这也许可以解释母亲饮食中相对不变的肝脏重量。

正常妊娠期间，循环中氧化应激的生物标志物包括脂质过氧化物和MDA显著升高[21]。氧化应激可能是人类妊娠相关疾病的致病因素，如复发性妊娠损失、胚胎吸收、宫内生长受限(IUGR)、先兆子痫和胎儿死亡[22]。众所周知，在成年生活中长期暴露于高脂饮食会导致氧化应激和/或肝[23]损伤。在我们的研究中，母亲高脂饮食导致了大坝肝脏中ROS水平的升高，表明氧化应激升高。在另一项研究中，它还发现，妊娠期间的高脂饮食会导致母亲氧化[20]。综上所述，这些结果表明，母亲的高脂饮食可能对妊娠诱发的疾病起着致病作用。

我们认为，母体氧化应激可能会转译到胎儿，从而影响后代的抗氧化能力。因此，我们分析了后代的肝脏氧化应激标志物和抗氧化酶活性。结果表明，新生儿和成年后代肝脏的抗氧化活性均降低，而吸吮小鼠肝脏的抗氧化活性升高。符合我们的观察,据报道,母亲怀孕期间的高频饮食消费减少胎儿肝脏SOD活性和mRNA表达的老鼠和增加的水平8-hydroxydeoxyguanisine (8-OH-DG)和4-hyroxy-2-nonenal (HNE)在非人灵长类动物的胎儿肝脏(24、25)。提示胎儿或新生儿肝脏的抗氧化活性降低。

在妊娠期和哺乳期喂食HFED饮食的母鼠所产成年后代中，尽管断奶后喂食了周粮，但负责肝脏抗氧化防御能力的基因仍受到抑制[26].在我们的研究中，我们观察到HFED组的SOD活性降低。然而，HFED组的GSH-px活性并不显著低于NC组。我们的关键发现是，我们观察到母鼠在妊娠和哺乳期喂食HFED的哺乳期小鼠肝脏的抗氧化活性增加。在出生时，幼崽由喂食HFED饮食的母鼠喂养；这些母鼠的奶可能含有高能量[27]。据报道，高脂肪和高能量饮食会增加小鼠的氧化应激[9]因此，在对高能量饮食的反应中，肝脏的抗氧化活性被诱导。这种反应的机制有待进一步研究。

众所周知，食用补充了植物甾醇的食物可能有助于降低动物模型或人类的LDL-C水平[28]。最近，研究人员发现，植物甾醇减轻了高血糖和结肠癌动物模型以及高胆固醇血症患者的氧化应激[29-31].我们认为补充植物甾醇可能会减轻母鼠和后代HFED饮食诱导的氧化损伤。结果表明，抗氧化活性在母鼠中有效，但在后代中不太好，这表明在母鼠饮食中补充植物甾醇可能不是防止损伤的好方法母鼠食用HFED饮食对后代的不良影响。

结论

综上所述，我们目前的研究表明，在妊娠期和妊娠期，饲喂HFED饲料的母鼠的新生儿、吸吮和成年后代的氧化应激是不同的。补充植物甾醇可以减轻母鼠的氧化损伤，但对后代没有作用。

的利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究由国家自然科学基金项目(No. 81273070, No. 30771802)和北京市自然科学基金项目(No.7092012)资助。

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条信息

文章类型:研究文章

引用:高丽芳，于海丽，范娟，李丽，肖锐，等。(2016)妊娠期高脂饮食和补充植物甾醇对新生儿、哺乳期和成年后代氧化状态的影响。肥胖开放获取2(2):doi http://dx.doi.org/10.16966/2380-5528.119

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出版的历史:

收到日期：2015年12月02

接受日期:2016年5月28日

发表日期:2016年5月31日