摘要

从埃及Al Menoufia省不同地方随机采集了60份新鲜本地和冷冻进口牛肉样本（各30份），通过高效液相色谱法（HPLC）和酶联免疫吸附试验（ELISA）评估其抗生素残留（土霉素“OTC”和青霉素）对于激素残留。在本研究中，本地生产的牛肉检测样品中记录的抗生素残留（土霉素或青霉素）浓度高于进口牛肉，其中5（16.67%）和3（10.00%）样品因其残留含量超过（MRL）而不合格由埃及标准化和质量组织记录；土霉素和青霉素分别为200µg/kg和50µg/kg。相比之下，进口牛肉样品中的睾酮激素残留浓度最高，其水平为5（16.67%）样品超过了FAO/WHO建议的最大残留限量。对每类牛肉（n=5）采用不同烹调方法（煮沸、烧烤和微波）结果表明，烹调方法能积极减少OTC、青霉素和睾酮的残留。获得的结果表明，降低或消除牛肉中此类抗生素和激素水平的最有效烹调方法是先烧烤，然后微波，然后煮沸。

关键字

抗生素残留；生长促进剂激素；土霉素；铅笔素

介绍

抗微生物药物可通过注射、在饲料或水中口服、局部皮肤上、乳腺内或宫内注射等方式给予动物，以控制、预防和治疗感染，并提高动物生长和饲料效率。从理论上讲，所有这些途径都可能导致牛奶、肉类和蛋类等动物源性食品中出现残留。土霉素是非洲最主要的处方抗生素，占41%的病例，其次是β-内酰胺，[2]为18%。食品中的抗生素残留与公众对抗生素耐药微生物的传播、人类过敏反应和肠道菌群失衡日益加剧的健康担忧有关。此外，它们的存在可能会影响食品生产工业的发酵过程。在一些国家，使用合成代谢剂是通过刺激蛋白质合成和改善饲料转化来增加肉类生产的一种常见做法。在这些国家，最常用的化合物是天然合成代谢剂(睾酮)和合成合成合成剂(醋酸trenbolone)。禁止在巴西,这些化合物可能由于外部市场和法规设置公共卫生风险(4、5),规定,致癌的潜在风险及其残留物和明显的人类健康风险,欧洲共同体禁止使用类固醇在畜牧业growthpromoting特工。烹调肉类的常用方法有很多;最流行的是煮、微波或烧烤。 However, grill was found to be the sole cooking method that reduced sex steroid hormone residues in meat with a level of reduction approached 31% of that found in raw non cooked meats [6]. Due to the excessive use of antibiotics in raising fattening animals for human consumption and the implementation of growth promoters in some animal farms, our study focus on the monitor of residues of such chemical compounds to figure out if these residues fall in the accepted MRLs and measuring the effect of various popular cooking method in reducing or elimination of such residues in meat. Moreover the observed findings may be helpful in confirming and selecting the ideal method for cooking so as to effectively reduce antibiotic and hormone residues in meat prior to consumption.

材料和方法

第1部分：抗生素和激素残留的测定

新鲜本地和冷冻进口巴西牛肉(大腿肌肉)随机样本60份;其中30件是从埃及Menofia省不同地区的不同超市购买的。样本是在有效期内的不同时间采集的。每一个采集的样本分别放在干净的无菌聚乙烯袋中，并在尽可能快的时间内转移到一个冰柜到实验室，以评估其中的一些抗生素和激素残留。

牛肉样品中抗生素残留的测定

采用高效液相色谱（HPLC）技术检测土霉素和青霉素残留。

土霉素[7]的测定

从样品中提取药物:在修剪外部脂肪和筋膜后，用剪刀将所有样品精细切割。将待分析的每个受检肉类样品的两克切割成非常小的碎片，然后使用Sartorius碎肉机研磨成细颗粒。然后在搅拌器中均质2分钟，然后添加0.1克柠檬酸。1毫升硝酸盐cid（30%）将4 ml甲醇和1 ml去离子水分别添加到该混合物中。将含有固体颗粒的悬浮液置于漩涡中以进行良好混合，在超声波浴中保持15 min，并在5300 rpm下离心10 min。通过0.45µ尼龙过滤器过滤后，将20µl透明溶液注入HPLC进行分析。

色谱条件：流动相为甲醇和甲酸(0.1%)，采用梯度法，流速为1.5 ml/ min, 25℃。采用Hypersil gold C18色谱柱(10µm, 100 × 4.6 mm)进行分离，流动相如图所示。采用波长为350 nm的PDA检测器进行检测。通过软件(Chromo Quest 5)自动外推曲线下面积，获得并计算样品中残留的定量。

校准曲线：通过在洗脱液中使用浓度为10、20、30、40、50和60µg/L的土霉素制备曲线。从每日制备的储备溶液制备这些标准品，并将其作为100 mg土霉素标准品进行处理，准确称量并将其置于100 ml容量瓶中。将粉末溶解在100毫升甲醇中，制成储备溶液。土霉素的检测限为0.01ppm，保留时间为3.9分钟。参考从土霉素工作溶液中获得的校准曲线计算样品中抗生素残留的浓度。为了制备工作溶液，使用甲醇作为稀释剂，将抗生素的盐酸土霉素（美国密苏里州圣路易斯市西格玛·奥尔德里奇公司）储备溶液（1mg/ml甲醇）稀释至几种浓度。

青霉素残留量的测定[8]

从样品中提取药物:准确地将5 g样品放入50 ml加盖的聚丙烯离心管中，并加入15 ml乙腈/水(15:2)混合物。4000rpm离心1分钟，样品完全均匀化。取上清液重复匀浆和离心1次。将混合上清液放入圆底烧瓶中，在37℃下蒸发乙腈。在烧瓶中应至少找到大约6毫升剩余上清液。使用磷酸盐缓冲液(pH 8.5)，上清液的总体积应达到20 ml。上清通过再生纤维素，25 mm, 45瓮注射器过滤器(安捷伦针5185-5831)过滤。实际上，将10 ml提取液装入安捷伦Sampli Q OPT 6 ml /150 mg墨盒中

净化[9]：用0.1%甲酸水溶液洗涤墨盒，然后用(pH 8.5)磷酸钾缓冲液洗涤。最后用3ml乙腈洗脱样品。用13mm, 45ml聚四氟乙烯(PTFE)注射器过滤器(安捷伦引脚518-5836)过滤样品。洗脱液在氮气下室温干燥。残液在流动相中重悬至1.0 ml。样品旋转2分钟，然后转移到一个2ml的自动进样器小瓶(安琪伦引脚5182-0864)。

固相萃取（SPE）和最终样品制备：将SPE滤筒放入真空歧管系统，SPE滤筒流出物进入溶剂捕集器。准确地说，加入25毫升甲醇、25毫升水和40毫升0.01 M氢氧化钙。对于这些步骤，流速并不重要。此外，将3 ml样品以不超过2滴的流速施加到药筒上。在此步骤中，不允许墨盒干燥。用40毫升蒸馏水和10毫升乙腈冲洗滤筒。用40 ml 2.5%乙酸（包括50%甲醇）连续进行洗脱。使用旋转蒸发器在45°C下蒸发收集的洗脱液，直至完全干燥。干燥后的残留物在3毫升流动相中重新组合。将样品混合并通过0.2µm过滤器过滤，然后注入LC系统。

HPLC固相分离青霉素:用于抗生素检测的高效液相色谱(HPLC)是德国瓦尔德波隆安捷伦科技(Agilen Technologies, Waldbronn, Dokki)动物健康研究所安捷伦1100高效液相色谱系统，配备g1311a型四元泵、254nm波长紫外检测器(g1314a型)、自动进样器(型号G1329A副ods)和Shim包(150 × 4.6 mm)柱(岛津，京都，日本)。

通过ELISA测定睾酮残留[10]试剂盒中提供的试剂和材料：（EIA-甲基睾酮2小时手动试剂盒）

样品制备：对1 g均质牛肉样品，加入1 ml 67 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)，用力摇匀5分钟。

样本提取：准确地说，5毫升叔丁基甲醚（TRME）提取后，摇动30-60分钟，以3000 rpm离心10分钟。将上清液转移到另一个试管中，用5 ml叔丁基甲醚重复提取。将乙醚相汇集，并在40°C下干燥。残留物溶解在1 ml甲醇/蒸馏水中（80/20）。将样品蒸发至60°C干燥。此外，将残留物溶解在200µl乙醇和1.8 ml稀释缓冲液中。（样品中的甲基睾酮浓度=提取物中的甲基睾酮浓度x 4）

试剂的制备

采用应用试剂盒推荐的技术。提供浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.5、1和2 ng/ml的标准溶液和空白溶液，以构建标准曲线。

第2部分:实验部分(热处理)

本研究的主要目的是研究某些常见烹饪方法对抗生素和激素残留浓度的影响。因此，5份含有低、中（约允许限值）和高浓度土霉素、青霉素和睾酮的阳性牛肉样本接受了国内使用的各种烹调方法。使用重量为10 gm、厚度为2.5 cm、芯部温度为71.5°C的样品。因此，对经证明含有土霉素、青霉素和睾酮残留物的阳性样品进行100°C煮沸30分钟、200°C烧烤15分钟和180°C微波10分钟）处理，以确定每种烹饪方法对这些严重残留物稳定性的效果。

结果和讨论

根据Feldmanet等人[11]，通过应用student t检验对获得的结果进行统计评估。

表(1)和图(1)显示，进口牛肉和本地牛肉样品中分别有10%和36.67%的土霉素残留。此外，进口牛肉的非处方肉(μ g/kg)含量为12.7 ~ 56.0 μ g/kg，平均值为35.1±2.24;本地牛肉的非处方肉(μ g/kg)含量为17.5 ~ 601.8 μ g/kg，平均值为22.5±14.96。进口牛肉与本地牛肉检验样品差异极显著(P<0.01)。根据埃及标准化与质量组织“EOSQ”第3692号，OTC肉类的MRL为200µg/kg。(表一)及(图二)宣布进口牛肉样本的OTC残留物在容许范围内可获接纳，而本地牛肉样本的16.67%则不获接纳。目前的结果在一定程度上同意与Olatoye、Ehinmowo和Mehran等[12,13]记录的三头肌样本中总TCs残留量的平均值为176.3±46.8µg/kg。Muriuki et al.[14]获得了更高的结果，他记录了肯尼亚阿蒂河样品的平均tc水平为280µg/kg。然而，Adesokan et al.[15]报道的结果较低，他们记录的肌肉中OTC残留量的平均值为16.17±5.52µg /kg。四环素类抗生素对各种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有广泛的活性，且价格低廉，因此，TCs在兽医学中被广泛用于预防和治疗多种疾病和促进牛[16]生长。OTC的残留物可能对消费者的健康构成威胁，这取决于食品的类型和残留物的数量。 The human health problems resulting from intake of sub chronic exposure level of OTC include gastrointestinal disturbances [17]. OTC residues possessed a teratogenic risk to the fetus with allergic reaction [18] and help in development of resistant pathogens for human and animals [19]

图1:本地和进口牛肉检验样本中土霉素、青霉素和睾酮浓度的平均值（µg/kg）

		进口牛肉	当地的牛肉
阳性样本	不。	3.	11
	％	10	36.67
最低限度		12.7	17．5
最大限度		56	601.8
平均值±标准偏差		35.1 ± 2.24	212.5±14.96 + +
最大残留限量/（微克/千克）		200	200
接受样品	不。	30.	25
	％	100	83.33
不合格样品	不。	0	5
	％	0	16．7

表1：根据土霉素残留量（µg/kg）（n=30），本地和进口牛肉检验样品的统计分析结果和可接受性。
++=如t检验所示，高度显著性差异（P<0.01）。

(表2)和(图1)结果显示，进口牛肉和本地牛肉检测样本中分别有26.67%和23.33%检测出青霉素残留。青霉素残留量(μ g/kg)为3.6 ~ 24.1 μ g/kg，进口牛肉为12.10±0.93 μ g/kg，本地牛肉为5.9 ~ 71.3 μ g/kg，本地牛肉为36.57±4.08 μ g/kg。进口牛肉与本地牛肉检验样品差异极显著(P<0.01)。根据“EOSQ”3692号(2008)[20],建议推广的青霉素残留在肉50µg /公斤,所以表(2)和图(2)显示,进口牛肉的研究样本是接受他们的青霉素残留在容许极限内,相比之下,10%的检查本地牛肉样本被拒绝的。当前结果按照报道的Adesokan et al .尼日利亚西南部[15]报道,每个肉标本检测出含有PEN-G平均值为11.67±2.94µ/公斤.Lower百分比报告了易卜拉欣等。[21]在尼日利亚发现积极PEN-G残留有14%的样本。值得注意的是，经检测的本地牛肉样本中含有可检测到的非处方药或PEN残留。这可能是由于这两种抗菌剂是埃及特别是非洲一般的牲畜工人最常使用的药物。这一发现与最近在南非进行的一项调查报告一致(Eagar和Van, 2012)[22]。其中TCs是第二大抗微生物药物组和PEN。G是大多数出售的非肠道注射剂型。

图2:本地及进口牛肉样本中土霉素、青霉素及睾酮残留量的可接受程度

		进口牛肉	当地的牛肉
阳性样本	不。	8	7
	％	26.67	23.33
最低限度		3.6	5．9
最大限度		24.1	71.3
均值±S。E *		12.10±0.93	36.57±4.08 + +
最大残留极限(g/kg)*		50	50
接受样品	不。	30.	27
	％	100	90
不合格样品	不。	0	3.
	％	0	10

表2：根据青霉素残留量(μ g/kg)统计分析本地牛肉和进口牛肉样品的分析结果和可接受性(n = 30)。
++= t检验显示差异极显著(P<0.01)。

(表3)和(图1)显示，在进口牛肉和本地牛肉的检测样本中，睾酮残留量分别为76.67%和73.33%。进口牛肉的睾酮残留量(g/kg)为0.014 ~ 0.605，平均值为0.133±0.008;本地牛肉的睾酮残留量(g/kg)为0.011 ~ 0.047，平均值为0.026±0.002。进口牛肉与本地牛肉检验样品差异极显著(P<0.01)。FAO/WHO(2004)[23]建议肉类中睾酮残留的最大残留限量为0.100µg/kg，由表(3)和图(2)可知，16.67%的进口牛肉样品不合格。相比之下，当地牛肉的检测样本睾酮残留量在允许的限度内是可以接受的。目前的结果与德黑兰Oveisi等人[24]的记录一致，后者揭示了牛肉睾酮的平均浓度水平为0。810 uµg /公斤。低Mahgoubet报告的结果。[25]在阿曼苏丹国记录最大肉类样品中残留的睾丸激素含量0.05µg / kg,而更高的结果报告的圣母和艾哈迈德[6]记录的平均值睾酮残留在肉为1.8602±0.1148µg /公斤。意大利从1961年开始禁止使用激素，丹麦从1963年开始禁止使用激素，德国从1977年开始禁止使用激素。比利时和希腊从未允许为增肥目的使用激素。但是，西班牙、英国、法国、荷兰等国允许在肉牛[26]中使用大部分促进生长的激素，因此进口牛肉的检验样品中存在高浓度的睾丸激素残留。 The effect of different cooking methods on the oxytetracycline, penicillin and testosterone residues in beef was shown in (Table 4) and (Figure 3) which showed that the mean concentrations of tested control samples of oxytetracycline, penicillin& testosterone residues were 283.78, 45.48and 0.32 µg/kg ,respectively , by application of different cooking methods(boiling ,grilling and microwave) the reduction percentage were 74.54%, 96.9% &77.54%; 90.5%, 98.28% & 96.08 % and 64.74 %, 92.38% & 78.52% for oxytetracycline, penicillin and testosterone residues respectively. The lower results were reported by Zeitoun and Ahmed [6] who recorded that the reduction percentage of testosterone residues were 29%, 23% and 19% for grilling, microwave and oven, respectively. Cooking time and temperature are two main factors which affect antibiotic residues in meat, where in some cooking procedures, sufficient heating temperature and time can reduce several antibacterial drug residues although it does not generally provide an additional margin of safety for consumers [27]. It is concluded that the most preferable methods of cooking for reducing antibiotic and hormone residues on meat were grilling followed by microwave and boiling .To safeguard consumers from the risk of such residues proper use of antibiotics through good diagnosis of the diseases by experienced veterinarians and creation of legislation of compulsory following the rules of withdrawal time of the antibiotic and hormone. Control of antibiotic and hormone residues by heat treatment by cooking processes that have a higher temperature and longer time should be done to inactivate antibiotic and hormone residues in meat and it is advised that meat broth should be discard in order to reduce exposure to residues as the most of antibiotic and hormone residues during boiling procedure excreted from tissue to cooking fluid.

图3：不同烹饪方法(煮沸、微波和烧烤)对牛肉中土霉素、青霉素和睾酮残留量的影响(减少%)。

		进口牛肉	当地的牛肉
阳性样本	不	23	22
	％	76.67	73.33
最低限度		0.014	0.011
最大限度		0.605	0.047
平均值±标准偏差*		0.133±0.008	0.026±0.002 + +
最大残留极限(g/kg)*		0.100	0.100
接受样品	不	25	30.
	％	83.33	100
不合格样品	不	5	0
	％	16.67	0

表3:根据睾酮残留量（µg/kg）（n=30），本地和进口牛肉检验样品的统计分析结果和可接受性。
++= t检验显示差异极显著(P<0.01)。

试验			1	2	3.	4	5	平均值±标准偏差*
控制		土霉素	48.3	198.5	256.1	314.2	601.8	283.78
		Penicllin	10.4	29.7	52.9	63.1	71.3	45.48
		睾酮	0.012	0.098	0.392	0.489	0.605	0.32
沸腾 （100°C或30分钟）	内容	土霉素	0	7．8	69.4	127.5	335.2	107.98
		Penicllin	0	0	2.2	10．6	18.9	6.34
		睾酮	0	0	0.185	0.297	0.414	0.179
	减少%	土霉素	100	96.1	72.9	59.4	44.3	74.54
		Penicllin	100	100	95.8	83.2	73.5	90.5
		睾酮	100	100	52.8	39.3	31.6	64.74
烧烤（200°C）15分钟。	内容	土霉素	0	0	0	5．3	82.6	17.58
		Penicllin	0	0	0	1.7	4.2	1.18
		睾酮	0	0	0	0.061	0.155	0.043
	减少%	土霉素	100	100	100	98.3	86.2	96.9
		Penicllin	100	100	100	97.3	94.1	98.28
		睾酮	100	100	100	87.5	74.4	92.38
微波(180°Cfor 10分钟。)	内容	土霉素	0	0	13.8	47.1	119.5	36.08
		Penicllin	0	0	0	3.8	9.6	2.68
		睾酮	0	0	0.099	0.184	0.269	0.110
	减少%	土霉素	100	100	94.6	85	80.1	77.54
		Penicllin	100	100	100	93.9	86.5	96.08
		睾酮	100	100	74.7	62.4	55.5	78.52

Table4:不同烹饪方法对牛肉中土霉素、青霉素和睾酮残留量的影响。

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文章信息

物品类型：研究文章

引用：Elbagory AM, Edris AM, Muhammad KM(2017)进口和本地牛肉中抗生素和生长促进激素残留的研究。营养食品技术开放获取3(2):doi http://dx.doi.org/10.16966/2470-6086.140

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出版的历史:

收到日期：2017年1月23日

接受日期：2017年3月13日

出版日期：2017年3月18日