在鱼油中溶解的他汀类药物:创新配方的多用途和简单组合

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研究文章

MosèSantaniello朱塞佩尼^＊

研发Sigma-Tau工业，Farmaceutiche Riunite s.p.a.， Via Pontina Km 30,400。I-00071, pomzia，罗马，意大利

*通讯作者：Giuseppe Giannini，研发Sigma-Tau工业Farmaceutiche Riunite S.p.A, Via Pontina Km 30,400。I-00071, pomzia，罗马，意大利，电话:39-069-139-3640;电子邮件:giuseppe.giannini@sigma-tau.it

摘要

血脂异常或高脂血症主要包括高甘油三酯血症和/或高胆固醇血症;由于它们的控制被认为对公共卫生有影响，这一问题现已确立。因此，在一个过于拥挤的领域中寻找降低血液中胆固醇和甘油三酯水平的适当答案，我们在这里报道了配方研究的结果，旨在联合他汀类药物和n-3多不饱和脂肪酸，克服有关溶解性和稳定性的缺点。一种新的配方已经制成，创造了一种溶剂系统，可以完全溶解他汀类药物，如阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和匹伐他汀。对于辛伐他汀，为了稳定起见，还需要用分子筛进行初步脱水。这些发现是非常重要的，可以广泛应用于所有的情况下，两种活性治疗成分的联合给药是常规需要。

关键字

鱼油;n3-PUFA;他汀类药物;稳定液配方;他汀类药物增溶;离子乳化剂

缩写

PUFA: Omega-3多不饱和脂肪酸;心血管疾病:心血管疾病;世卫组织:世界卫生组织;β-:3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA;DHA:二十二碳六烯酸;环保局:二十碳五烯酸;LC/PDA/MS:液相色谱/光电二极管阵列/质谱;HPLC:高效液相色谱;DAD:二极管阵列检测器;聚四氟乙烯过滤器:Phenex^®聚四氟乙烯^®筛选;RH：相对湿度;旅馆：国际非正式名称;LDL：低密度脂蛋白;SGF：模拟胃液;SIF：模拟肠道液

介绍

西方人群久坐不动的生活方式与高热量和高脂血症饮食的使用密切相关，是心血管疾病(CVD)的重要危险因素之一，而CVD是世界上死亡的主要原因。

西方生活方式及其传播到全世界越来越多的人,越来越担心世界卫生组织(世卫组织)最近透露,缺血性心脏病和脑血管疾病会在第一和第二位置,分别在帧排序的死亡时间从现在到2030年。幸运的是，CVD，以及2型糖尿病的发病率，癌症和其他可怕的疾病，可以通过适当的干预措施来减少危险因素的影响。血脂异常是CVD的重要危险因素，表现为血浆脂蛋白浓度升高或降低[1,2]。因此，血脂异常是一个极其重要的公共卫生问题，它不仅给个人和家庭带来巨大的成本，也给医疗保健系统带来巨大的负担。控制血液中甘油三酯和胆固醇水平是预防血脂异常最常用的方法之一[3,4]。他汀类药物是上个世纪治疗和商业上最成功的一类药物，用于降低血液中的胆固醇水平，而主要来自鱼油的多不饱和脂肪酸PUFAs (omega-3多不饱和脂肪酸)被广泛用于降低甘油三酯。

正常情况下，在高胆固醇和甘油三酯水平的患者中，医生会根据不同的病例来评估他汀类药物和不饱和脂肪酸的剂量，这就是为什么没有这些药物的固定剂量组合[5,6]。第二个原因是由于技术上的限制:他汀类药物在鱼油中通常难溶且不稳定。为了避免这些问题，人们提出了不同的技术，主要是在混合鱼油[7]之前将他汀类药物微胶囊化。

在这里，我们报告了一项研究项目的结果，该项目旨在开发一种在鱼油中制备稳定的他汀类药物液体溶液的技术。

他汀类药物

胆固醇合成代谢途径中的重要酶HMG-CoA(3-羟基-3-甲基戊二酰coa)还原酶及其抑制剂的发现，标志着在预防高胆固醇血症及相关疾病方面取得了突破性进展。到目前为止，临床证据已经充分证明了这一点。市场上的他汀类药物是完全或部分发酵衍生的(洛伐他汀、辛伐他汀和普伐他汀)或完全合成的(阿托伐他汀、鲁伐他汀、匹伐他汀和氟伐他汀)。所有的他汀类药物都是相对不稳定的，它们的降解是由氧气、湿度、酸度和温度等多种因素催化的。

本文的目的不是根据他汀类药物的吸收和生物利用度、药代动力学和代谢来分析不同的他汀类药物，而是根据他汀类药物在鱼油配方中具有不同局限性的化学结构来描述他汀类药物。他汀类药物可分为两类:A类(十烷环衍生物)和B类(氟苯基衍生物)。另一个重要的参数是内酯形式(封闭，前药)和阴离子羧酸形式(开放;(表1)。考虑到这些信息，很少有属于这两种类型的他汀类药物在鱼油溶液中的溶解度和稳定性进行了研究。

表1:目前市场上可用的他汀类药物，根据其化学结构分类。INN（国际非专利名称）和商品名。还报告了降低LDL（低密度脂蛋白或“有害胆固醇”）的典型剂量，范围为25-45%。

鱼油

海洋和淡水鱼油是-3多不饱和脂肪酸(n-3 PUFA)的主要来源，主要由DHA(二十二碳六烯酸)和EPA(二十碳五烯酸)组成，已发现以剂量依赖的方式调节脂质代谢和降低血液甘油三酯水平。证明在预防心血管事件方面的有益作用。根据一级和二级预防研究，摄入omega-3脂肪酸、鱼和鱼油可以减少所有原因的死亡和各种心血管疾病的后果，如猝死、心源性死亡和心肌梗死，证据主要支持鱼和鱼油补充剂[9]。在文献中可以找到很多例子，食品或膳食补充剂中的n-3多不饱和脂肪酸在预防和治疗多种疾病方面显示出积极的效果，但这不是本文的主题。我们鼓励感兴趣的读者查阅最近的评论，以更广泛地了解这一领域[10-12]。

鱼油中含有他汀类药物

在这里，我们报告了一项关于含n-3多不饱和脂肪酸和他汀类药物的流体配方(溶液)的研究结果;虽然他汀类药物与多不饱和脂肪酸(PUFA，鱼油)相关的协同效应已在几篇论文中有文献记载[13- 18]，但也知道某些他汀类药物对酸性环境敏感，导致其降解为内酯形式和各种异构体。例如，普伐他汀、阿托伐他汀和氟伐他汀在酸性环境中转化为内酯形式;同时，内酯形式的他汀类药物，如洛伐他汀和辛伐他汀，对碱性环境敏感，导致这种转化为酸形式。另一方面，鱼油也容易氧化，迫使使用抗氧化剂防止酸味。综上所述，将他汀类药物和鱼油结合起来是一项特别困难的任务。因此，为了将溶解性和稳定性这两个活性原理结合起来，必须克服两个临界点。

据报道有三种剂型：溶液、悬浮液和固体剂型。然而，为了保护成分免受可能的降解，大多数剂型采用至少一种成分的微胶囊技术。他汀类药物通常在鱼油中难溶，这与它们的生物利用度差有关；而在微胶囊化的配方中，观察到其生物利用度进一步降低。因此，为了克服这些限制，可能需要均匀的溶液。为了制备鱼油中的他汀类药物溶液，有必要克服其溶解性差的限制，特别是对于最新一代的st阿托伐他汀。事实上，虽然辛伐他汀在鱼油中的溶解度为11mg/ml，但阿托伐他汀（钙盐）的溶解度小于0.1mg/ml。在这两种情况下，其溶解度远远不适合获得最佳治疗剂量。需要克服的第二个缺点是稳定性：辛伐他汀在鱼油中的溶液不稳定。

因此，这项研究的目的是确定辅料和/或技术，以提高他汀类药物在鱼油中的溶解度，以及它们的稳定性。通过对一套乳化剂和共溶剂的系统研究，以磷脂酰胆碱为主要成分的纯化大豆卵磷脂得到了最佳的结果。增溶和稳定的过程很可能是由于反胶束的形成。实际上，磷脂中的疏水介质组织成反胶束，疏水链在外部，极性残基在内部。这些体系可以提高他汀类药物的溶解度。辛伐他汀比其他药物更容易溶解，主要的问题是稳定性。解决这个问题的方法是在分子筛上对溶液进行酸酐。

材料和方法

ω-3多不饱和脂肪酸（n-3 PUFA）是多不饱和脂肪酸乙酯的混合物，EPA和DHA的含量大于85%，EPA/DHA的比例在0.9和1.5之间；产品由Pronova Norway提供。本研究中使用的他汀类药物均为商用：作为钙无定形盐的阿托伐他汀和由Biocon（印度）提供的辛伐他汀由Biocon（印度）提供的作为钙无定形盐的瑞舒伐他汀；由MSN Laboratories Pvt.LTD（印度）提供的匹他伐他汀。聚氧乙烯（20）山梨醇酐单油酸酯（吐温^®80）和钠复制品购自Sigma-Aldrich;聚氧乙基甘油酮 - 硬脂酸盐（Cremophor^®RH 40）和聚乙二醇（15）羟基硬脂酸盐（溶质醇^®HS 15），由巴斯夫Italia SRL。甘油和聚乙二醇酯的混合物（Labrasol^®)，2-（2-乙氧基乙氧基）乙醇（Transcutol^®P)和单月桂酸丙二醇(月桂醇)^®90)，购自Gattefossè Italia, S.r.l(米兰，意大利)。氢化磷脂酰胆碱(Epikuron^®200sh)和脱油富卵磷脂磷脂酰胆碱(Epikuron^®200)和Lipoid GmbH提供的固体天然卵磷脂(Lipoid S PC-3)。

LC / PDA / MS

采用高效液相色谱(HPLC)、二极管阵列检测(DAD)和质谱联用仪对他汀类药物和鱼油成分进行定量分析。该液相色谱仪器包括以下模块组件:Alliance系统2695,Photodiode array Waters 2996和mass system Waters Quattro Micro (Waters USA)。

LC条件下辛伐他汀，阿托伐他汀，瑞舒伐他汀

HPLC色谱柱为Intersil^®ODS-3 (4.6 × 250 mm;以乙腈、水、三氟乙酸(70:30:0.1,v/v/v)为流动相。用于吡伐他汀、乙腈、水和三氟乙酸(30:70:0.1,v/v/v)。所用的流量为1ml/min(表2)。

ω-3多不饱和脂肪酸（n-3 PUFA）的HPLC法

HPLC柱为Waters Symmetry C-18 4.6×150 mm 5µm（Waters USA）。流动相由乙腈、甲醇、水和三氟乙酸（45:45:10:0.1，v/v/v/v）组成。使用的流量为1 ml/min。EPA和DHA的UV检测和定量在λ=215 nm下进行（图1）。

含非离子表面活性剂的配方（比较示例）

非离子型表面活性剂的亲水端不带电，这使其成为优良的油性土壤乳化剂。在本研究中，月桂醇^®90年,渐变^®80，克莫霍^®RH40, Labrasol^®，和Solutol®HS15作为非离子表面活性剂。将乳化剂溶解在n- 3pufa中，机械搅拌。然后，加入他汀类药物(即阿托伐他汀)并评价溶液的外观。所用的乳化剂都是已经在批准的药品中使用的赋形剂，并且在市场上可以买到。在某些情况下，一种助表面活性剂(如Transcutol)^®在第二步骤中加入p）以进一步增强阿托伐他汀（表3）的溶解度。

离子表面活性剂乳化剂(docusate钠- Epikuron)配方^®200)

这些表面活性剂（阳离子或阴离子）乳化剂在其极性端上具有电荷。将乳化剂直接溶解在N-3 PUFA中，并在机械搅拌下留下。然后，加入他汀类药物（即，阿托伐他汀）并评价溶液的外观（表3）。

与难溶的他汀类药物(即阿托伐他汀)，一种类似Transcutol的辅助表面活性剂^®在第二步中加入P，进一步增强溶解度，但没有达到这个目标。

溶解度测试程序

对于阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、吡伐他汀和辛伐他汀这四种他汀类药物，在鱼油中达到的最大浓度也按照另一个程序计算:将他汀类药物添加到n-3 PUFA (1 ml)中，直到沉淀形成。将混合物搅拌18小时后，用0.22 μ m聚四氟乙烯(PTFE)滤网过滤，根据上述方法进行高效液相色谱分析(图2)。结果汇总于表4。

图1:在l=215nm处分析n-3多聚不饱和脂肪酸的色谱剖面。b)第一个分离峰，对应EPA EE (EPA乙基酯)，ESMS: ES+ m/z 331.36;c)其次为DHA EE (DHA乙基酯)，用ES- ms: ES+ m/z 357.37。

表2:HPLC数据，以n- 3pufa中溶解他汀类药物的最大量进行分析。Intersil®ODS-3 (4.6 × 250 mm;以CH3 cn / 2 O (70/30 + 0.1% CF3COOH)或CH3 cn / 2 O (30/70 + 0.1% CF3COOH)溶液为洗脱液，流速为1ml/min。
^:高效液相色谱法测定辛伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀
*:高效液相色谱法测定吡伐他汀
°：结果是至少两个独立实验的方法。±SD小于10％。

表3：在10％共溶剂的存在下，他汀类药物（阿托伐他汀，罗苏伐他汀，猪伐他汀和辛伐他汀和辛伐他汀）和鱼油（n-3 pufa; 0.9g）。

稳定性试验

对于初步稳定性试验，将样品置于5、25和40ºC、60%相对湿度（RH）的气候室中。在长达六个月（第一个月、第三个月和第六个月）的时间内，对溶液的稳定性（目视检查的透明溶液）进行监测。用甲醇稀释适量的鱼油，并通过HPLC进行分析（表5）。

为了增加稳定性

为提高稳定性，在辛伐他汀溶液中加入少量(10%)己二酸和棕榈酸或柠檬酸。然而，上述酸的存在并没有增强稳定性(表6)。

用分子筛干燥鱼油溶液。分子筛(0.4 nm，珠状约2 mm)之前在150ºC真空下活化18小时，然后加入溶液中，系统在没有机械搅拌的情况下过夜。最后通过倾析得到油性溶液。稳定性试验给出了令人惊讶的结果，如表7所示。

结果与讨论

本研究的目的是制备他汀类药物在鱼油中的均匀溶液，以克服与其保留溶解度和不稳定性相关的挑战。

不同的乳化剂已经被测试，表明他汀类药物几乎不溶于鱼油，如阿托伐他汀，瑞舒伐他汀或吡伐他汀，离子乳化剂的添加，如Epikuron^®200或docusate，显著增加其溶解度，达到浓度大于20 mg/ml(形式12和13;20和21;26日和27日)。他们的混合同样有效(表格28)。这种浓度至少比用非离子表面活性剂乳化剂(Tween 80, Cremophor)配制的类似溶液大10倍^®RH40, Solutol HS 15, Labrasol等)，即使加入表面活性剂(如Transcutol)也不会改善^®P，20％;数据未示出）（表3和4）。

图2:辛伐他汀溶解度试验

对于可溶性较多的他汀类药物，如辛伐他汀，离子和非离子表面活性剂的作用也得到了验证。结果表明，不同溶剂的最大溶解度范围相同(表29- 31,33,34)(表7)^®200溶解度随离子乳化剂添加量的增加而成比例增加(见sii的例子):20%的Epikuron^®溶解度达到70 mg/ml (Form 32);对于非离子溶剂，Transcutol^®对月桂醇^®90，尽管使用了更大量的溶剂，但溶解度并未增加（表3和表4）。

从这项研究中，清楚地证明，溶解他汀类药物，高于所有那些易溶的鱼油，离子乳化剂，如Epikuron^®200毫克和docusate钠是必需的。辛伐他汀加20%艾比库龙^®极大地增加了其溶解度，达到70 mg/ml。最新一代的他汀类药物的溶解度更低，其中含有离子乳化剂的配方增加了多达2个对数单位。其溶解度：见表1对表12和表13；表2对表20和表21；表3对表26和表27（表4）。

总之，新的他汀类药物(如阿托伐他汀)在鱼油中的最大溶解度极低(<0.1 mg/ml)，而生长抑素的溶解度较高(~11 mg/ml)，但对治疗无效。在这里，我们清楚地证明了在稳定的溶液中增加所有他汀类药物的溶解度以达到治疗剂量(≥20 mg/ml)的可行性。

关于稳定性一章，针对这些新提议的配方，监测了两个主要方面：n-3多不饱和脂肪酸的降解和他汀类药物的稳定性。鱼油主要代表（>85%）通过两种n-3多不饱和脂肪酸，即EPA和DHA，如图1中的色谱图所示。在这里提出的配方中，没有一种发现鱼油降解显著（表5）。在同一个表中，含有Epikuron的他汀类药物的稳定性数据^®200（表12、20、26和31）或与二十二碳磺酸钠（表13）一起，在5℃、25℃和40℃下监测，显示长达六个月。在室温下，对于游离酸形式的他汀类药物，阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和匹他伐他汀，唯一的降解产物是封闭的内酯衍生物（10%；±3）。否则，以内酯形式存在的他汀类药物，即辛伐他汀，唯一的降解产物是打开的内酯衍生物（5%；±2）。（S.i图1）。所有在5°C下随访一个月的他汀类药物均显示出完全的稳定性。鱼油溶液中游离酸形式的他汀类药物仅产生一小部分内酯（<5%）（表12、20、26）（表5）.

用辛伐他汀进行了一个独立的研究。在这种情况下，必须克服的挑战是稳定性。辛伐他汀作为无活性内酯前药给药：假设酸性条件可以稳定内酯，柠檬酸，己二酸和棕榈酸，即使在药物制剂中常用的所有赋形剂也是如此，即使在含有市场上已经可用的辛伐他汀的固体配方中被添加到制剂中。然而，与预期的相反，在鱼油溶液中，羧酸或羟基酸的存在不增强稳定性（表6）。观察到的唯一降解产物是由内酯环的开口引起的羧酸衍生物。化学上，通过水的存在解释内酯的降解，因此从溶液中除去痕量的水可能稳定汀类蛋白。为此，我们通过加入适当的分子筛进行鱼油溶液的无水化。稳定性测试给出了令人惊讶的结果（表7）。

然后在各种温度下单独使用两种共溶剂进行稳定性研究。结果证实，无论使用的共溶剂类型，从溶液中取出痕量水足以稳定辛伐他汀（表7）。值得注意的是，唯一只有活性分子筛的鱼油溶液唯一的含量，它不足以稳定辛伐他汀，只有两个共同溶剂的组合（Epikuron^®200 + docusate钠)可确保6个月的稳定性。使用不同的表面活性剂，如Transcutol^®或Lauroglycol^®（专利文献中描述的配方；WO2006/096806），在类似物条件下得到的溶液比此处描述的溶液稳定性差（表7）。

他汀类药物在鱼油中溶解的体内稳定性并不是这项研究的目的，因为它被认为与鱼油和他汀类药物共同使用时相似。然而，在模拟生物体液(SGF，胃和SIF，肠道)中，辛伐他汀已经做了初步研究。在S.I.(模拟生物液体测试)中报道的结果表明，在鱼油中溶解的他汀类药物在两种载体中都具有与文献报道相似的稳定性。

总之，本文所报道的方法与在水溶液中溶解药物的方法是等价的:确实是醇、乙二醇、Transcutol等共溶剂^®或表面活性剂，降低液体和固体之间的表面张力的化合物，是众多可用的方法之一，并在文献中报道，以提高低水溶性药物的溶解度。在我们的案例中，试图提高他汀类药物在鱼油共溶剂中的溶解度的研究结果很差，以及乳化剂，其中一些是Epikuron^®200、二十二碳磺酸钠、吐温80、Solutol HS 15能够将溶解度提高到20%p/p。其他乳化剂如Cremophor®RH40和Labrasol的效果较差。

表4:溶解度测试：在鱼油（n-3 PUFA；0.9 g）中溶解的最大他汀类药物（阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、匹他伐他汀和辛伐他汀）（mg/ml）。
（*）表3所示的相同配方，增加他汀类药物的量，使其在溶液中达到最大浓度。
(°):结果是至少两个独立实验的平均值。±SD小于10％。

负责增强鱼油中他汀类药物溶解度的物理化学机制可能是由于前面提到的反向胶束的形成。从对各种乳化剂的分析研究，显然，表面活性剂的化学特性，特别是极性头部对他汀类药物的溶解性非常重要（主要用于新一代）（阿托伐他汀，Pitavastatin，Rosuvastatin，氟伐他汀）。然而，也用更可溶的他汀类药物观察到这种行为，例如辛伐他汀。总之，为了提高鱼油中他汀类药物的溶解性，乳化剂在与油分子的相互作用中参与其疏水组分，与他汀类药物相互作用，参与其疏水组分，以及它们的亲水组分（头部）。形成反胶束。还观察到，通过除去痕量的水，制备作为其前药（内酯形式，见Simvastatin）的他汀汀类药物的溶液特别稳定，无需混合添加剂。

表5:他汀类药物（阿托伐他汀，罗磺汀，猪伐他汀和辛伐他汀和辛伐他汀）的稳定性试验，在N-3 PUFA中溶解，在5℃下最多6个月的储存，温度高达40°C（加速储存条件）。

表6:鱼油中可溶性辛伐他汀单独或与Epikuron的稳定性试验^®或Epikuron^®和有机酸，在25和40ºC两种温度下，一个月后。
º：结果是至少两次独立实验的平均值。±SD小于10%。

表7：辛伐他汀与淫羊藿酮的长期稳定性试验^®或/和二十二碳磺酸钠，溶解于鱼油中的非脱水溶液与脱水溶液。Transcutol^®和月桂醇^®也被评估。
(º):结果是至少两个独立实验的平均值。±SD小于10％。

综上所述，实验数据证实，通过可靠的配方、均质和口服给药，使药物可开发浓度符合治疗剂量，有可能在他汀类药物和鱼油之间建立联系(图3)。这些解决方案可在短时间内获得，成本低，使该工艺特别适合于工业应用。这些制剂可能代表了医生和患者治疗高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症相关疾病的新工具，他汀类药物和n- 3pufa在标准治疗方案中已经单独规定了这些疾病。例如，在长期预防心血管疾病的患者中，与分别服用两种药物相比，服用一片药物可以提高治疗依从性。这些结果已获得专利[19,20]。

图3:目录(TOC

最后但并非最不重要的一点是，含有二十二碳磺酸钠的配方，是对抗便秘症状治疗的有效药物，可用于他汀类药物治疗的患者，其中便秘是常见的副作用[21]。

承认

作者要感谢Gilles Pain博士对手稿的帮助。

作者披露声明

作者声称自己是赞助这项研究的国际制药公司sigma-tau IFR的员工。