摘要

用于预防创伤性脑损伤的新产品的开发主要是基于机械调查。然而，需要新的和更复杂的分析，重点是分子水平来改善保护设备。最近，我们评估了成熟的蛋白质Laminin LN521，以了解动态和半静态冲击的后果，并发现层粘连蛋白结构的大量分裂和聚集。在本研究中，通过使用两种不同的机械方法，变性电泳和电子显微镜来评估用于减少撞击的聚合物材料的效果。因此，在没有和聚合物材料的动态冲击之后，结果表明，力的显着降低以及高达超过50％的平移加速度。此外，在本实验室研究中，在动态冲击后使用成熟层粘连蛋白，以发现该分子是否可以作为互补分析仪在寻找最佳保护材料时用作机械方法。结果表明，聚合物材料具有以变性电泳和电子显微镜评价的分段和聚集的能力将层粘连蛋白结构储存。因此，蛋白质可以补充今天的计算模拟和在寻找改进的保护系统到颅骨和脑组织的改进的保护系统的机械研究。本结果表明，层粘连蛋白结构可以成为一种有价值的方法，以进一步识别在分子水平上寻找改善的保护材料对体育锻炼和事故的脑组织的新结构。

介绍

在人体受伤后，政府和非政府当局的总体医疗成本是巨大的。瑞典也是如此[1,2]。虽然从全球角度估计总数有些困难，但结论是，费用在今后几十年内将大大增加。其中一个原因是人口统计学上老年人口大幅增加。今天老年人在各种体育活动中都很活跃。然而，随着年龄的增长，人体并不会保持这些活动。因此，可以预见，在年轻人和成年人中，特别是在老年人中，这将导致大脑和骨组织损伤的显著增加。因此，预防这些伤害的必要性是巨大的。这就需要在分子水平上寻找新的分析方法，以评估减少创伤性脑损伤的不同预防产品以及动态和静态影响后的后果。有许多材料单独或在各种复合结构有能力减少事故后的后果。 Of special interest is the prevention of mild, moderate and severe head injuries. So far most analyzing methods for this purpose are based on pure mechanical investigations and lately also on simulation methods. However, there is a need for more sophisticated laboratory investigations in the search for more advanced methods approaching substances on a molecular level in the human body. A potential analyzer for such purposes may be the protein laminin wide spread on a cellular level. In general, the laminin proteins are responsible for holding cells and tissues such as basement membranes together. Also, the laminins have both common and specific functions. One important common function is the interaction between receptors in plasma cell membranes close to the basement membranes. More specifically, the laminins may regulate some of the activities between cells and signaling pathways [3]. These metabolic functions may be jeopardized following traumatic brain injuries in all ages. Recently the mature protein structures of laminin were analyzed with electrophoresis and Electron Microscopy (EM) following dynamic and semi-static impacts. It was found that both impacts resulted in unfolding of the LN521 structures [4]. Thus, as a complement to existing simulation and mechanical methods laminin and other protein structures may be excellent structures to be used when analyzing the effects of composite materials for the prevention of especially traumatic brain injury.

这次调查的目的是

- 评估在动态冲击时对薄层结构的后果而无需和旨在在寻找有效产品的分子水平上开发新的分析方法以防止创伤性脑损伤和痴呆症的所有年龄段。

材料和方法

机械调查

用于动态冲击的第一个机械实验室方法以及随后对774kDa层粘连蛋白分子的分析是一个假人，由重量为5 kg的钢体组成，从60 cm高度下落，冲击速度为3.3 m/s或11。9 km/h（图1a）[5]。第二种方法是一个假人，由重量为3.9 kg的Hybrid III人头模型组成，从55 cm高度下落，撞击速度为3.1 m/s或11。2 km/h（图1b）[6,7]。通常，在寻找最佳材料以减少对头部的冲击力时，会分析许多不同的材料。在本分析中，选择了苯乙烯-丁酸橡胶，因为在这方面未考虑该橡胶。因此，对于假人钢体形状（图1a），所有10种层粘连蛋白的研究聚合物结构分析均定义为苯乙烯-丁基橡胶（SBR），硬度为Sh 60和Sh 81，并带有尖峰（图2a）。对于仿真Hybrid III人头模型（图1b），在所有其他10次分析中，所研究的聚合物结构被定义为SBR，硬度为Sh50和Sh70（图2b）。将聚合物结构置于基板和相应假人之间。碰撞后，对聚合物结构的力和平移加速度进行了分析，并与对照进行了比较。将0.2 ml的第一层粘连蛋白溶液作为对照，并在不产生任何影响的情况下进行分析。在所有10种溶液中，0.2 ml的第二层粘连蛋白溶液暴露于图1a所示的动态冲击中。如图1b所示，在所有10种溶液中，0.2 ml的第三层粘连蛋白溶液暴露于动态冲击中。动态影响后，分别用变性电泳和EM评估所有层粘连蛋白溶液。

图1:显示钢体形式(1a，左)和混合头形式(1b，右)。

图2:显示Sh 60和Sh 81有尖刺(2a，左)和Sh 50和Sh 70 (2b，右)。

变性电泳

通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析样品。在变性电泳时，将处理和未处理的层粘连蛋白样品与含有十二烷基硫酸钠（SDS）的5倍加载缓冲液混合并在65℃下加热10分钟，在4-12％（钢体形式）或14％（杂交III头部）。Tris-甘氨酸凝胶（Thermo Fisher Scientific）[8]。然后通过施加150V并跑到蓝前沿到凝胶的末端来开始电泳[9]。使用银色Quest Silver通过银染色可视化凝胶中的带^TM染色工具包（Thermo Fisher Scientific）。

电子显微镜(EM)

将1-3 μl等量的冲击样品应用于碳包覆铜栅格中，用2% (w/v)醋酸铀酰对其进行印迹和染色，30秒[10,11]。使用日本JEOL JEM-2100f透射电子显微镜(JEOL, Japan)在200 kV下对网格进行检查。使用TVIPS TemCam-F415 4k × 4k ccd相机(Tietz Video and Image Processing Systems GmbH, Gauting, Germany)采集图像，标称放大率为80,000。

结果

用钢头形式动态冲击

当评估钢体动态冲击后的十种层粘连蛋白溶液时（图1a），目前的结果中显示了其中两种。使用聚合物Sh 60，力从参考木板（图3）中的18.84 kN减小到14.76 kN或22%，而聚合物Sh 81将力减小到8.28 kN 56%。此外，与加速度为256.23 g的参考木板相比，聚合物Sh 60将加速度降低至195.37 g或平移加速度降低24%，而聚合物Sh 81将平移加速度降低至118.11 g或54%。对照木板和两个聚合物结构之间的冲击速度在3.3m/s或12km/h左右没有差异。

图3:使用钢制车身模型对聚合物Sh 60和Sh 81及其各自的力、平移加速度和冲击速度进行动态冲击的结果，并与参考木板进行比较。

变性电泳:10个经过外力处理的样品没有显示出任何层粘连蛋白的碎裂或聚集，与对照样品相比也没有任何显著差异(图4)。此外，与之前的外力处理样品相比，没有观察到主要的低分子量层粘连蛋白片段。此外，通过对比对照和力处理样品的模式，在分析中没有发现额外的波段。因此，与层粘连蛋白对照物相比，两种Sh 60和Sh 81聚合物之间似乎没有实质区别。

图4：用钢体形式泳道1和5测试的所有十种聚合物中的不同层状带是那些在上面呈现的机械动态冲击后的电泳反应的两种聚合物。

新兴市场:与负应变EM中的对照试样相比，钢头模型的动态冲击并未对层粘连蛋白试样造成任何重大的视觉变化（图5）。在没有聚合物结构的动态冲击力的层粘连蛋白样品中观察到的层粘连蛋白聚集增加[4]是罕见的。

图5:EM检查（对照）和在Laminin与钢体与上述聚合物SH 60和SH81的动态冲击后，既不显示对控制也不是两种不同硬度聚合物之间的差异。尺度条100nm。

动力冲击与混合III头形式

与钢体形式有一个纯钢表面，混合动力III头配备了一个更软的表面。从图6显示动态的影响从六个控制被定义为平均496克大约0.0045秒后(B),其次是一些来历不明的瘀伤(A)。然后SH 70显示减少的平移加速度平均296克大约0.005 s (C)后,因此加速度降低了40%。在大约0.005 s (D)后，Sh 50降低至238 G，对52%的降低反应。此外，在Sh 70时，力从最初的19,0 kN减小到11,13kN，在Sh 50时减小到9,0kn，因此有显著的减小。

图6:混合动力III头型冲击后的平移加速度(G)。A=撞击造成瘀伤，B=六次撞击造成控制，C=三次撞击造成Sh 70, D=三次撞击造成Sh 50。

变性电泳:如钢体形态冲击后的电泳中发现，与对照相比，检测到钢体形成冲击后的强蛋白分段为新的低分子量带或层状结构的聚集。而且，在测试的SH 50和SH70聚合物材料中的不同薄层带之间没有观察到差异（图7）。

图7:使用Hybrid III头测试层粘连蛋白样品的SDS页面。M巷是分子标记，在1-3巷和4-5巷分别显示了用Sh50聚合物实验得到的层粘连蛋白样品。

新兴市场:当用EM分析层粘连蛋白时，对照样品和聚合物结构似乎没有区别。聚合物材料Sh 50和Sh 70在两种聚合物层粘连结构上没有任何差异。层粘连蛋白样品上也未检测到主要聚集(图8)。

图8:层粘连蛋白与聚合物Sh 70和Sh 50的杂交头状结构动态碰撞后的电镜检查。比例尺50纳米。

讨论

目前的研究结果首次表明，通过电泳和电镜分析蛋白质，寻找更好的抗创伤性脑损伤保护材料，可能是对现有模拟和力学评估的重要补充。钢体（图3）和Hybrid III（图6）撞击的结果表明，目前的聚合物材料在撞击后为正常细胞代谢保存层粘连蛋白结构方面具有积极的结果。此外，材料的硬化、设计和尖峰类型的差异对于减少头部对冲击力的吸收非常重要。特别有趣的是，图6显示了与对照组相比的聚合物材料的清晰图像。然而，根据目前的结果，我们必须记住，不可能准确地量化层粘连蛋白结构是否存在变性。比较图3和图6所示的力学结果，很明显，无论冲击载荷如何，冲击力都会减小。此外，这里测试的较软的聚合物可能会被用来代替目前头盔中的硬外壳。此外，通过使用图3和图6所示的实验室方法，可以区分预防性较差的材料和最佳材料。因此，分析机械力和加速度，结合细胞代谢中的活性分子，如蛋白质结构，可能成为寻找最有效的材料，以防止所有年龄段的创伤性脑损伤和未来痴呆症的最终选择。65岁以上的老年人头部受伤的风险增加，主要原因是身体不平衡和跌倒。瑞典最近的一项调查表明，创伤性脑损伤大大增加了老年人患痴呆症的风险[12]。为了预防创伤性脑损伤后的老年痴呆症，在创伤性脑损伤和老年痴呆症之间找到任何基本的分母都很重要。在模拟和实验室研究中，我们发现在头部受到动态和静态冲击后，出现了蛋白质干扰，包括碎片和聚集[4]。蛋白质紊乱似乎与老年痴呆患者中观察到的蛋白质紊乱一致。除其他临床情况外，蛋白质紊乱可能导致脑组织肿胀，这是一种毁灭性的疾病，尤其是在老年人中。年轻和成年运动员也是如此。尽管有新的和改进的头部保护系统，头部受伤的人数仍然很高，令人无法接受。如本研究所示，通过在分子水平上进行评估，可促进寻找最佳头部保护系统。因此，对于创伤性脑损伤和老年痴呆症，无论年龄大小，都是一种蛋白质代谢的代谢紊乱，在某种程度上，可以通过不同的创新安全产品加以预防。所有这些针对成年人和老年人的创新都有可能在跌倒后将转移的能量吸收到头部和脑组织。因此，避免老年人受伤的最佳活动，以及在一定程度上考虑减少脑外伤后的痴呆症是为了完全预防他们，这为许多创新的安全产品打开了，包括安全系统的构建，如头带、手套和地板。此外，在所有年龄段的人群中，增加体育锻炼已经变得非常激烈，因为这可能有助于65岁以上的老年人保持警惕。因此，有必要构建新的安全产品，但也需要改进现有的预防产品，尤其是保护具有脑组织的头部免受不同严重程度的创伤性脑组织影响及其继发并发症，如细胞毒性脑组织水肿和痴呆。如今，大多数安全产品的评估都依赖于实验室领域的机械冲击。事实上，在过去的几十年里，对动态和静态冲击对头部和脑组织的后果有了新的认识。在要提到的实验室调查中，算法方法已成为世界各地实验室普遍使用的方法。事实上，算法是定义良好的指令程序，旨在改进纯机械研究。然而，当使用各种模型进行计算（如有限元法）时，数据总是取自人类数据库并包含在这些方法中。此外，这些算法通常需要结束模拟过程。这与创伤性脑损伤的继发并发症形成对比，创伤性脑损伤在头部受到撞击后持续很长时间。此外，必须强调的是，这些模型只是建立在不同假设和简化基础上的数学模型ns that cannot be implicated in advanced systems like the human brain and other body organs. Thus, there is a need for better and more advanced analyses taking into consideration the molecular aspect following an impact.

为了进一步改进对新材料和安全产品的评估，需要关注如上所述的动态和静态影响在分子水平上的干扰。在这方面，有大量的蛋白质分布在整个人类大脑中，当动态或静态的冲击足够严重时，它们应该做出反应。因此，早期的模拟方法和实验室研究表明，当影响足够严重时，蛋白质会发生碎裂和聚集[13-15]。特别感兴趣的是层粘连蛋白，它在人体中丰富，并已用于实验室研究。叠层蛋白在高等生物中属于一个至少有16种亚型的大家庭。层粘连蛋白的不同活性对基底膜有重要作用，有助于细胞外基质的结构，从而影响相关细胞的粘附、分化、迁移等行为。因此，当我们更好地了解创伤性脑损伤后的继发性并发症，如细胞毒性脑损伤、水肿和痴呆时，层粘连蛋白在临床神经科学中用于治疗继发性并发症的潜力可能在未来变得重要。在本研究中使用了两种不同的撞击假人。坚硬的钢体形式有参考木材料作为基础平台，与聚合物产品之间。相比之下，较软的Hybrid III头部形式有一个由钢和聚合物材料产品之间的平台。 The conclusion is that the polymer products caused a reducing effect regardless of dummy construction or basal platform impacting the polymer and which may have implications when it comes to develop new analyzing methods at cellular levels or molecular levels in the future. In an earlier study we showed that laboratory dynamic impacts of around 500 G resulted in fragmentation and aggregation to the laminin structure [3]. To the best of our knowledge the present study shows for the first time that polymer structures of different construction and different softness or hardness have the capacity to reduce both the force as well as the translational acceleration substantially in parallel with saving the mature laminin structure as confirmed with denatured electrophoresis and EM. These materials and others not investigated in this study may open a new insight of analyzing methodology by using laboratory technology with that of molecular substances like proteins.

结论

将模拟和机械实验室方法的算法与分子水平的分析算法相结合，不仅有可能在创伤性脑损伤和相关痴呆症的初级预防方面找到最优的安全产品。它还可能有助于更好地理解继发性并发症，如细胞毒性脑组织水肿和痴呆，以及临床神经科学中损伤的整体治疗，无论受害者的年龄何时受到影响。

作者的贡献

Hans Von Holst设计了实验并起草了稿件。HVH和DL分别负责动态实验室测试。P.P.和H.H.分析了EM的结果。R.B.K.分析了电泳的结果。所有作者都提供了反馈并修订了稿件。

相互竞争的利益

两位作者宣称没有相互竞争的经济利益。

工具书类

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文章信息

文章类型:研究文章

引用:von Holst H, Purhonen P, Lanner D, Kumar RB, Hebert H(2019)当分析物质结构以防止创伤性脑损伤时，蛋白质是新的分子标记。J Neurol Neurobiol 5(1): dx.doi.org/10.16966/2379-7150.154

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出版的历史:

收到的日期：2019年1月24日

接受日期:08年2月,2019年

发表日期:2019年2月15日(