摘要

在世界范围内，肥胖和代谢综合征的发病率在过去几十年中大幅增加，目前影响到越来越年轻的人。肾功能下降是肥胖相关的慢性疾病之一；内脏肥胖和血清血脂异常被发现是慢性肾功能不全的独立危险因素西丝。

肥胖可通过脂质介导的病理途径独立于高血压和糖尿病引发肾脏疾病。在我们之前的研究中，我们已经确定脂质诱导的代谢性肾损伤包括溶酶体稳态的破坏、溶酶体多板层体的产生、分解代谢途径的衰减、代谢途径的累积、代谢途径的改变、代谢途径的改变、代谢途径的改变以及代谢途径的改变在胆固醇和磷脂的作用下，氧化应激和线粒体损伤导致整体肾小管细胞损伤和功能障碍。

在这项研究中，我们研究了肾小管细胞摄取低密度脂蛋白的影响，发现肾小管细胞负荷低密度脂蛋白，尤其是氧化形式的低密度脂蛋白，通过增加富含胆固醇和神经酰胺的膜微区的形成，改变了质膜的组成。这反过来又影响小管细胞对表皮生长因子刺激的反应能力，包括细胞增殖率、信号激活和表皮生长因子受体的细胞膜可用性。

因此，在肾细胞中，过量摄入脂质不仅会破坏细胞内细胞器的稳态，而且会对质膜产生不利影响，从而抑制细胞信号和通讯。

关键词

脂质筏;低密度脂蛋白;胆固醇;神经酰胺;饮食;脂质;肾脏;慢性肾病;等离子体膜

介绍

世界范围内的肥胖流行已经成为心血管疾病、II型糖尿病和器官功能障碍(包括肾脏疾病)的主要原因。流行病学研究表明，肥胖，特别是内脏肥胖，使个体处于慢性肾脏疾病(CKD)的风险中[2-5]。

在以前的研究中，我们发现低密度脂蛋白（LDL）-胆固醇超载导致肾小管上皮细胞内胆固醇和磷脂的积累，尤其是在溶酶体和自噬体细胞器中，并形成大的多板层体（MLB）[6,7]，这是溶酶体贮存疾病（LSD）和磷脂病的典型特征[8,9]。除了引起溶酶体室的不稳定和功能障碍外，LDL负荷还引发线粒体损伤、自噬，最终导致肾小管损伤和肾小管吸收特性受损[7]。

膜筏是一种小型的、高度动态的甾醇和鞘脂丰富的结构域，为蛋白质相互作用和信号级联[10]的启动提供平台。因此，筏在划分细胞过程和促进细胞间通讯方面非常重要，因为筏集中了许多特定的细胞表面受体，如表皮生长因子受体(EGFR)[11,12]。

大多数胆固醇在人体血液中以低密度脂蛋白的形式运输，低密度脂蛋白以核壳结构组织。脂质核心主要包含三酰甘油、胆固醇酯（CE）和一些未酯化的游离胆固醇（FC），而外壳由磷脂（主要是磷脂酰胆碱和鞘磷脂）、大部分游离胆固醇和一份载脂蛋白B-100（ApoB-100）构成，它是LDL受体（LDLR）的主要配体[13,14]。一旦LDL与LDL受体结合，LDL就会在网格蛋白涂层的血管中迅速内化，并输送到早期内体。因此，LDLR被循环到质膜，LDL被运输通过晚期核内体到溶酶体，酸性水解酶将LDL-CE转化为游离胆固醇。因此，游离胆固醇可用于新的膜合成，并被运送到其他细胞室，如内质网(ER)和质膜[15]。

在存在活性氧的情况下，天然低密度脂蛋白（nLDL）氧化导致极性外层脱落，ApoB蛋白构象改变，并形成新的复合物，如神经酰胺、氧化甾醇、氧化磷脂和溶血磷脂。由于在LDL氧化过程中ApoB展开并产生新的免疫原性表位，氧化LDL（oxLDL）主要不是通过LDLR识别，而是通过先天免疫模式识别受体（例如Toll样受体-TLR-4和-2）和清道夫受体（例如CD36、SR-BI、LOX-1）[13,16,17]。

oxLDL水平升高与血浆高胆固醇血症相关[18-20]，并与冠状动脉疾病（CAD）和动脉粥样硬化斑块形成的风险增加相关[21-23]。

在这项研究中，我们重点研究了天然和氧化低密度脂蛋白对质膜微区（膜筏）的影响以及改变膜脂筏组成的下游效应。

在本研究中，我们发现，在肾小管上皮细胞(TEC)中，LDL颗粒的摄取，特别是被氧化时，会改变质膜脂质组成，影响细胞增殖，以及质膜上表皮生长因子(EGF)诱导的信号传导和EGF受体的可用性。这些数据表明，脂质负载改变了细胞膜的生物物理性质，从而可能使膜脂/蛋白平台的信号功能丧失。

后果

氧化低密度脂蛋白是胆固醇和神经酰胺丰富的质膜微区的主要诱导物

在之前的研究中，我们发现，给小鼠喂食高胆固醇的西式饮食会导致肾小管上皮细胞内的异位脂质沉积[6,24]。脂质组学分析显示，与对照组[6]饮食组相比，西式饮食组小鼠肾脏的游离胆固醇、脂肪酸和几种磷脂显著增加。

吸收之后，通过受体介导的内吞作用，LDL颗粒被运输到溶酶体，在溶酶体中酸水解酶开始降解LDL-CE、-甘油三酯和-磷脂。LDL溶酶体消化产生的游离胆固醇被运输到其他细胞室，包括质膜[15]因此，在第一组实验中，我们使用荧光标记的霍乱毒素B亚单位（CTB）研究了培养的TEC质膜中富含胆固醇的微结构域（脂筏）的变化，CTB选择性地结合神经节苷脂GM1，神经节苷脂GM1是脂筏的标记物[25-27]。

通过流式细胞术（FC）对胆固醇脂质筏进行测量，发现质膜胆固醇（第3天和第5天）随时间增加，尤其是在摄取oxLDL后（图1A）。

图1:nLDL/oxLDL负荷后的质膜改变。
(A)流式细胞术(FC)数据分析HK2细胞用霍乱毒素B (CTB)-FITC (FC)染色显示富含胆固醇的质膜微域。lpds处理对照组(Ctr)的平均荧光强度(MFI)减去nLDL/oxLDL处理细胞的MFI。
（B） 用FITC标记的二抗对HK2细胞表面神经酰胺结构域进行FC分析。与Ctr LPDS组相比，MFI的差异。LPDS（绿色）、nLDL（蓝色）和oxLDL（红色）处理细胞的直方图峰值。
第3天（A，B）和第5天（A）的分析。数据以平均值±SEM表示；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。每个点代表使用从一个血浆供体分离的LPDS/LDL进行的一次独立实验的平均值。

在肥胖人群组织中异位积聚的脂质种类中，神经酰胺受到了广泛关注，它与胰岛素信号的损伤和细胞内葡萄糖的处理有关[28-30]。神经酰胺是膜筏的第二个主要脂质成分[10,31]，通过棕榈酸酯和丝氨酸缩合物的从头合成或通过酸性或中性鞘磷脂酶（aSMase/nSMase）作用分解的鞘磷脂（SPM）而累积[32]。

由于nLDL和oxLDL都含有相当多的SPM和神经酰胺[13]，我们检测了nLDL和oxLDL处理后富含神经酰胺的质膜微域的存在。细胞表面神经酰胺的FC染色显示，oxLDL刺激3天后显著增加了质膜神经酰胺含量(图1B)。因此，低密度脂蛋白以其天然的和氧化的形式改变了质膜微域。

低密度脂蛋白负荷损害TEC增殖率和信号激活

脂筏/微结构域被认为是配体-受体相互作用的平台，通过提供富含受体、脂质和蛋白质效应物的微环境来激活信号[33]。

细胞周期分析显示，延长暴露于nLDL或oxLDL(5天)可抑制TEC增殖(图2A)。与对照组和nldl处理条件相比，oxLDL处理5天可消除EGF刺激引起的增殖率升高(图2B)。因此，LDL暴露5天后，EGF诱导的信号传导也受损，EGF受体和下游信号分子磷酸肌醇3-激酶(PI3K)的磷酸化率降低(图2C)。为了表明因果关系，我们使用甲基-β-环糊精(MβC)降低膜胆固醇含量。加载nLDL 5天后，MβC显著增加增殖细胞数量(图2D)。此外，在nLDL治疗过程中，m β c介导的膜胆固醇消耗增强了质膜上EGFR的可用性，通过EGFR细胞表面染色检测FC(图2E)。这些数据表明，膜上胆固醇含量过高的结构域对细胞增殖和受体启动信号有负面影响。

图2:低密度脂蛋白暴露损害细胞增殖和肾小管细胞的信号传导能力。
（A） HK2增殖细胞相对于对照组的百分比等于1；通过流式细胞术进行细胞周期分析。
（B） nLDL/oxLDL负荷后细胞对EGF的增殖反应；%增殖细胞相对于对照组（=1）。
（C） Western blot显示暴露于nLDL/oxLDL 5天后EGFR和PI3K的磷酸化率，以及在过去24小时内有无EGF刺激；β-肌动蛋白用作负荷对照。对照组的强度标准化。
（D） 用nLDL处理5天后测量的增殖细胞百分比，无论是否去除MβC依赖性膜胆固醇。从nLDL/oxLDL处理细胞的MFI中减去对照组的平均荧光强度（MFI）。
（E） 在有无MβC存在的情况下，nLDL处理5天的HK2细胞的细胞表面EGF受体染色。数据显示MFI存在差异。
(A-E)第5天测定。意味着±扫描电镜;* * * P < 0.05, P < 0.01, * * * P < 0.001。点是不同血浆供体分离低密度脂蛋白/低密度脂蛋白实验的平均值。

oxLDL的摄取触发细胞凋亡

富含神经酰胺的微结构域作为信号平台参与凋亡等过程[34]。使用膜联蛋白V染色，我们显示暴露于氧化低密度脂蛋白3天可触发TEC的凋亡（图3A）。

图3：氧化低密度脂蛋白触发细胞凋亡。
（A） 与对照组相比，膜联蛋白V-FITC+凋亡细胞百分比增加1倍。散点图显示Ctr（蓝色）和oxLDL处理（红色）的HK2细胞。
（B） 稳定表达靶向ATG5的shRNA的oxLDL处理细胞中的凋亡。与表达非靶向（NT）shRNA的细胞相比，ATG5敲除的细胞中膜联蛋白V-FITC+的百分比变化倍数。
（A，B）装载3天后进行的所有分析。数据显示为平均值±SEM；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。每个点是不同血浆供体的一个独立实验的平均值。
(C) ATG5基因在HK2细胞中稳定表达的慢病毒结构体编码ATG5表达shRNA或非靶向shRNA。

在我们之前的研究中，我们发现低密度脂蛋白负载也会触发TEC中的自噬[7]，我们使用稳定表达以ATG5为靶点的短发夹（sh）RNA的细胞来抑制细胞内自噬通量。ATG5敲除使TEC更容易受到氧化低密度脂蛋白诱导的凋亡（图3B），表明自噬是代谢超负荷期间的一种保护机制，细胞可能通过自噬来消除被破坏的溶酶体并阻止溶酶体在细胞质中的泄漏[35,36]图3C显示了与表达非靶向（NT）shRNA的细胞相比ATG5表达的下调。

讨论

我们和其他人已经证明了营养过剩与肾脏损伤、炎症和纤维化之间的因果关系，这些疾病的共同特征是CKD[6,24,37-42]。在这项研究中，我们在肾小管上皮细胞水平上展示了肾脂毒性的一个新方面，肾小管上皮在肾脏生理学中起着重要作用。

我们报告了nLDL/oxLDL暴露后TEC中的质膜胆固醇和神经酰胺含量增加，这似乎改变了EGF的增殖和信号传导。长期nLDL/oxLDL负荷降低了肾小管细胞的增殖率，并损害了它们对表皮生长因子的增殖和信号传导反应。令人惊讶的是，在治疗5天后，氧化低密度脂蛋白消除了EGF增强TEC增殖率的能力。此外，低密度脂蛋白摄取对EGF介导的细胞内信号传导产生负面影响，这可以通过EGF受体和PI3K的较低磷酸化率来评估。

在摄取和运输到溶酶体后，ldl -胆固醇酯被降解为游离胆固醇，最终被运送到细胞的其他部位，如细胞膜。随着LDL溶酶体分解后越来越多的胆固醇被运输到质膜，质膜胆固醇含量的增加可以破坏脂层组成(受体/脂质/信号蛋白)，并可能抑制EGFR的运输/转换，EGFR定位于胆固醇富集的膜结构域[12]。因此，nLDL/oxLDL负荷后，对EGF的增殖和信号转导发生改变。同样，在3T3细胞中，胆固醇水平被证明可以调节egfr介导的信号;Pike等报道，MβC去除膜胆固醇可显著增强表面EGF结合和EGFR自磷酸化[43]。因此，我们发现MβC去除细胞膜胆固醇可以增强细胞复制和EGFR在质膜上的可用性。

因此，脂质负荷的后果不仅限于质膜的生物物理特性的改变，而且可能通过取代脂筏上的聚集蛋白而扩展到细胞功能。

饱和脂肪酸和神经酰胺是LDL颗粒的成分，它们在溶酶体LDL分解后释放。神经酰胺是鞘脂代谢的中心中间体，在糖尿病和肥胖期间增加[30,44]。营养过剩时过量摄入饱和脂肪酸实际上可能导致从头通过丝氨酸棕榈酰转移酶的作用从棕榈酸生成神经酰胺[30,44]。神经酰胺主要通过抑制蛋白激酶B PKB/Akt（胰岛素途径的中心介质）促进炎症和胰岛素抵抗，从而导致肥胖相关疾病[45]。事实上，几种神经酰胺的血浆和组织水平与胰岛素抵抗相关[30]。

吞噬oxLDL后形成富含神经酰胺的raft结构域之前在巨噬细胞中已有描述[27]。富含神经酰胺的细胞膜平台可通过活性鞘磷脂酶（SPMase）的鞘磷脂/神经酰胺转化生成，已知oxLDL可促进SPMase活性[27,46,47]营养过剩时摄入过多的饱和脂肪酸也可能导致从头丝氨酸棕榈酰转移酶作用下棕榈酸生成神经酰胺[30,44]。脂肪酸和神经酰胺包含在低密度脂蛋白颗粒中，在低密度脂蛋白溶酶体分解后释放在细胞内。在应激刺激(如炎症、TNF-α和IL-1)的反应中，神经酰胺介导了许多不同的细胞通路，包括凋亡、细胞衰老、细胞增殖阻滞、细胞内运输、胰岛素抵抗和炎症[32,48-51]。

在管状细胞中，大多数氧化的LDL可引起细胞凋亡。考虑到只有oxLDL可以提高神经酰胺质膜水平，以及神经酰胺平台在细胞凋亡中的作用，我们有理由假设两者之间存在因果关系。在内皮细胞中，oxLDL来源的中性脂类，如氧甾醇，被发现通过膜鞘磷脂酶激活[52]产生神经酰胺，负责oxLDL诱导凋亡的活性。在我们之前的研究中，我们发现低密度脂蛋白暴露于小管上皮细胞可诱导溶酶体磷脂积累，并由于溶酶体超载未消化的脂质[7]而引发溶酶体破坏。内溶酶体内容物释放到细胞质中是细胞凋亡和早期自噬的触发器[8,35,53]。

综上所述，质膜脂质含量的改变可能通过置换通常位于胆固醇筏膜结构域内或与之相连的受体或信号效应或蛋白质而破坏信号传导，从而损害细胞通讯和对修复过程中基本生长因子的反应。这可能与事实上，肥胖和代谢综合征是肾移植受者中移植物丢失和肾功能不良的危险因素[54-56]。

方法

低密度脂蛋白的分离和氧化低密度脂蛋白的生成

在[7]的补充信息中提供了LDL分离和氧化的详细描述。简单地说，通过kbr -密度梯度超离心(UC)连续步骤(转子70Ti, Beckman)从健康供体300-400 ml血浆中分离出LDL颗粒。按此计算加入溴化钾KBr gr=体积血浆ml × 0.019，第一次UC (58000 rpm 22h 4°C)后，丢弃含有极低密度和中密度脂蛋白(VLDL, IDL)的顶部馏分。加入KBr: KBr gr=体积ml × 0.066;第二次UC (58000 rpm 22h 4°C)后，收获LDL的上部分。剩余血浆再离心2次(48000 rpm 48h 4°C)，分离脂蛋白缺陷血清(底相LPDS)。LDL和LPDS均在3l PBS/EDTA中透析(使用Servapor透析管)3次(每次2h)，之后在3l PBS(每次3 × 2h)中透析。

氧化低密度脂蛋白₄使用：低密度脂蛋白组分以1mg蛋白质/ml的浓度与含有5µM CuSO的3l PBS进行透析₄在4°C下透析36小时。随后，针对PBS/EDTA和PBS对oxLDL进行透析[7,57]。

根据健康血糖(60-100 mg/dl)、血脂水平(胆固醇60-200 mg/dl、高密度脂蛋白HDL 35-55 mg/dl、LDL 30-150 mg/dl、脂蛋白A <30 mg/dl、甘油三酯20-200 mg/dl)、体重指数(BMI<25)、ApoE3/E3基因型和年龄(<45岁)选择健康血浆供体;每位供体均获得如上所述[7]所述的书面知情同意。德国雷根斯堡大学伦理委员会批准了所有程序。

细胞培养及化验程序

如前所述培养HK2肾小管上皮细胞[7]；在体外检测持续3或5天：细胞在Dulbecco的改良Eagle培养基DMEM（Gibco）中培养，该培养基含有脂蛋白缺乏血清（LPDS，对照组）或5µg/ml nLDL或oxLDL[7]。培养基每2天更换一次。在5天实验的最后24小时内进行EGF（20 ng/ml，研发系统）刺激。甲基-β-环糊精（5 mM，Sigma-Aldrich）用于在5天的持续实验中，在第2天和第4天消耗膜胆固醇30分钟。

基因沉默

通过在8µg/ml聚布伦（Sigma-Aldrich）存在下用含有shRNA的慢病毒颗粒转导24小时来产生稳定的敲除细胞；用10µg/ml嘌呤霉素（Sigma-Aldrich）选择转导细胞转导48小时后。通过使用GENIUS DNA转染试剂（Westburg）以6:15:20µG/DNA比率将pMD2.G/VSVG（Addgene 12259）、pPAX2（Addgene 12260）和慢病毒pLKO.1 shRNA载体（Addgene 10878）转染HEK293T细胞产生慢病毒颗粒。为了抑制自噬，pLKO.1载体（Addgene 10878）使用含有靶向人类（h）ATG5（TRCN0000150940）的shRNA插入物。

染色用于流式细胞术分析

在FACSCanto II（BD Biosciences）上对质膜胆固醇、神经酰胺、EGFR、磷脂酰丝氨酸和核DNA进行流式细胞术染色；使用FlowJo软件（TreeStar）进行数据分析。用FITC标记的霍乱毒素B亚单位（2.5µg/ml，SigmaAldrich）对细胞表面富含胆固醇的区域进行染色，结合脂筏中存在的GM1神经节苷脂[25-27]。用小鼠单克隆抗体抗神经酰胺IgM（1:20，克隆MID 15B4，Alexis）对质膜神经酰胺进行染色，然后用山羊抗小鼠IgM Alexa Fluor 488结合物（Invitrogen分子探针）对细胞表面EGFR表达进行检测（细胞信号技术）随后进行Alexa Fluor 488共轭抗兔IgG染色（体外分子探针）。对于凋亡细胞的测量，Annexin V结合缓冲液中表面磷脂酰丝氨酸的Annexin V染色（BD Pharmingen™ 通过在含有10µg/ml碘化丙啶（Invitrogen）和250µg/ml核糖核酸酶a（Macherey-Nagel）的PBS溶液中染色DNA，在过夜乙醇固定后评估细胞周期分析。

基因表达分析

用Trizol试剂(Invitrogen)提取细胞总RNA。利用oligo-dT引物将RNA转化为cDNA。SYBR GreenSensiMix (Bioline)用于LightCycler®480系统(Roche)上的实时定量PCR (QPCR)。SYBR绿染强度采用线性回归分析，基因表达向管家基因TATA-box binding protein (TBP)归一化。每个基因的寡核苷酸引物序列(5 '→3 ')为:

TBP正向CAGGAGACAGAGTGAAAC反向GGAAATATTCGGCTCATAGACT，ATG5正向GTTTGTCCTTCTGCTATTAGTCC反向TCAGATTCACATCT。

统计数字

采用单因素方差分析和Dunnett检验或用于两组比较的Mann-Whitney U检验进行统计分析；P<0.05被认为是显著的。数据以平均值的平均值和标准误差（SEM）表示.在点图中，每个点代表使用从一名血浆供体分离的LPDS/LDL进行的一次独立实验的平均值。

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文章信息

物品类型：研究文章

引用：OrsóE，Florquin S，Schmitz G，Leemans JC，Rampanelli E（2018）肾小管上皮细胞摄取氧化低密度脂蛋白引起质膜微结构域组成和信号传导的改变。Int J肾病衰竭4（4）：dx.doi.org/10.16966/2380-5498.163

版权：©2018 OrsóE等人。这是一篇根据知识共享署名许可证条款发行的开放获取文章，允许在任何媒体中不受限制地使用、发行和复制，前提是原创作者和来源均已获得授权。

出版历史：

收到日期:2018年9月11日

接受日期：2018年10月02

出版日期：2018年10月9日