摘要

含有光疗染料的纳米颗粒（NPs）氯e6（Ce6）已在多个光动力疗法（PDT）研究中进行了探索。然而，与其他含染料的NPs相比，关于其PDT功效的研究很少。此处制备了含有Ce6的聚丙烯酰胺纳米粒（PAAm NPs），并将其PDT功效与先前报道的亚甲基蓝（MB）进行了比较含有PAAmNPs。研究发现，对于相同的NP剂量和光子剂量，Ce6 NPs在杀死癌细胞方面的效力要高出一个数量级。

关键词

照片动态疗法;纳米粒子;氯e6巨蟹座

介绍

在美国，癌症是导致死亡的主要原因，治疗主要局限于非选择性方法，如化疗、放射治疗和外科手术[1]这导致了人们对研究选择性治疗方法以提高生存率和总体生活质量的广泛兴趣。使用靶向纳米颗粒是一种长期存在的方法[1-3]。

水凝胶NPs已被证明在癌症治疗中可完成多种任务，如成像[4]、可见组织描绘[5]、化学药物的选择性积累[6,7]、光动力疗法（PDT）[8-10]、光热疗法（PTT）[11]和传感[12]。NP介导的PDT因其双重选择性而备受关注（细胞靶向NPs以及激光聚焦照射）和低肿瘤抗性。

PDT是基于细胞毒性活性氧(ROS)，由染料(光敏剂)在有氧存在的光照明下激发产生。因此，PDT需要光、染料和氧气来产生细胞毒性作用。当包含在经过表面修饰的NPs(多肽、抗体、小分子等)中，使其在摄取方面具有癌细胞特异性时，可通过选择性积累实现对癌细胞的良好选择性治疗[1,13]。

已经使用了能够有效PDT的许多光敏剂，例如Photofrin，亚甲基蓝和氯e6。氯e6（ce6）已被用于癌症和心脏病的光动力学治疗[14-18]。在这里，我们研究CE6和亚甲基蓝（MB）的相对疗效，当嵌入水凝胶中时，即聚丙烯酰胺NPS。以前报告的MB NPS用于比较[19]。各种细胞系可用于这些实验。我们选择了Hela细胞，因为它们代表了最强大的细胞系;杀死它们需要达到巨大的伤害/压力。这有助于说明良好的PDT功效，表明即使这些非常强大的细胞被杀死。

方法

材料

Ce6来源于Frontier Scientific。所有其他化学品均来源于Sigma-Aldrich。丙烯酰胺（AAm）、氨基丙基甲基丙烯酰胺（APMA）、3-（丙烯酰氧基）-2-羟丙基甲基丙烯酸酯（AHM）、琥珀酸二辛酯磺酸钠盐（AOT）、Brij 30、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺（EDC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）二甲基亚砜（DMSO）、磷酸盐缓冲液（PBS，0.01M）、过硫酸铵（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、磷酸盐缓冲液（PBS）。

氯-Ce6水凝胶纳米微粒的制备

将1.07 g AOT、2.2 mL Brij 30和30 mL己烷混合在100 mL圆底烧瓶中。制备28 mg APMA、368 mg AAm、52.6µL AHM、40 mg EDC、60 mg NHS、15 mg Ce6 100µL DMSO和930µL PBS的水相，并将其添加到圆底烧瓶中。以500 RPM搅拌烧瓶中的内容物2小时。然后使用长颈针与混合物接触15分钟，用氩气冲洗内含物。然后继续氩气流动，但不再与混合物接触。在100µL水中逐滴添加15 mg APS至烧瓶，以引发聚合。逐滴添加100µL TEMED，并允许反应在氩气下持续2小时。然后去除氩气，并将烧瓶中的内容物暴露于氧气中，以猝灭聚合。使用10×150 mL乙醇和5×150 mL微孔水在amicon池（300 kDa膜）中旋转蒸发己烷并清洗残余内容物。使用0.45µm聚醚磺酸盐过滤器过滤分散在微孔水中的最终产物，并冷冻干燥以获得固体产物。样品储存在冰箱中，直到需要。

单线态氧测试

用单重态氧感应绿(SOSG)测试活性氧的产生。取1 mg/mL样品(2 mL PBS)， 10µL 0.5 mM SOSG，置于甲醇中，在662 nm下照射5 min。在504/525 nm Ex/Em下测定光照前后SOSG的荧光。

尺寸分析

透射电子显微照片(tem)是在密歇根大学的显微镜和图像分析实验室拍摄的。样品通过溶剂真空蒸发沉积在网格上，随后用醋酸铀酰染色。

采用动态光散射法(DLS, Delsa纳米C粒子分析仪)对NPs坯料(无染料)进行了合成和表征。由于光谱干扰，DLS未用于有源NPs。

UV / vis.

使用Shimadzu UV-1601 UV可见分光光度计收集吸收光谱。

细胞培养

96孔培养板每孔（n=16）接种2000个HeLa细胞，其中含有200µL细胞培养基。给予具有光毒性和暗毒性的培养板0和200µg/mL的NP剂量；0µg/mL为对照组，定义了100%的存活率。通过MTT分析，在平板阅读器中通过比色法测定细胞存活率[13]。简而言之，用不含血清（100µL）和20µL 5 mg/mL MTT试剂的无色培养基替换细胞培养基，并培养4小时。然后小心移除培养基，并使用100µL二甲基亚砜溶解福尔马赞晶体。

光毒性

使用LED阵列（625 nm±20 nm，35.2 mW）照亮96孔板6 min。

后果

结果显示在表1和图表（1-7）中。

讨论

CE6是适度疏水的，所以倾向于盐酸溶液中骨料。UV / Vis吸收光谱显示在〜662nm的显性峰，在单体形式中的CE6特性（图1）[15]。还检测到668nm处的强荧光，单体CE6的典型位置（图2）[15]。这表明NP适当地保护CE6免受聚合。使用61,000和662nm峰的消光系数估计载荷为每毫克NP为〜23-24 nmol CE6。

图1：作为制备的CE6 NPS的吸收光谱。浓度=在PBS中= 1mg / ml。

图2：Ce6水凝胶NP激发（蓝色）/发射（红色），在PBS中浓度为0.1 mg/mL。使用668 nm荧光拍摄激发光谱。

采用SOSG作为布尔测试，确定Ce6偶联封装后是否保持了ROS生成能力。SOSG对单重态氧的检测具有高度选择性，表现为荧光信号的增强。(图3)显示了Ce6 NPs照射后强烈而明确的荧光增强，证实了Ce6产生ROS的能力的保存。

图3：SOSG荧光增强试验。在~668 nm处的峰是由Ce6荧光引起的。

含有Ce6 NPs的96孔细胞板显示出良好的生物相容性；约89%的细胞在黑暗中培养24小时后存活（图4）。TEMs显示脱水NPs为~17 nm（图6），与研究的~14 nm MB NPs大小相似[19]。NPs空白（无染料）这些空白纳米颗粒的直径约为68 nm，是生物相容性纳米颗粒的典型尺寸（图6）[19]。

图4：CE6 NP暗毒性板的MTT测定结果。细胞以200μg/ ml的剂量为89％可行。

图5：CE6 NP光毒性板的MTT测定结果含HeLa细胞。在200μg/ mL CE6 NPS的剂量为6分钟的光照照射后，细胞在6分钟后可行58％。照明时间= 6分钟，35.2 MW LED阵列（625 nm±20 nm）。

图6：脱水CE6水凝胶NPS的TEM图象。

图7：水合Ce6 NP空白的DLS分析。平均直径=68 nm，PDI=0.204。

用LED光源照射6分钟后，光毒性板仅显示58%的存活率（图5）。我们指出，已知所用的NPs将通过内吞作用进入细胞，在24小时内出现饱和[20]。再加上SOSG试验（图2），这种明暗板之间生存能力的巨大差异归因于PDT对细胞的杀伤作用。

先前使用相同光源和剂量的MB NPs的研究结果为70%的存活率(表1)[19]。然而，MB NPs在光照的光谱范围内，在625 nm(峰值光照波长)左右，具有更强的吸收性。具体来说，这些MB NPs的OD=0.5，而Ce6的OD=0.2。因此,Ce6 NPs显示细胞杀伤率高于MB NPs,同时大大减少吸收(表1)。这表明对于这个系统,如果Ce6 NPs被使用峰值波长的吸收(662海里),他们会约一个数量级比报道MB NPs更有效。

核动力源	重量百分比染料 装载	nmol染料/ mg NP加载	透射电镜（纳米）	NP OD@ 〜625 nm.	6分钟PDT 可行性
Ce6	1．40	23.4	17.	0.2	58%
兆字节	0．63	13．1	14.	0.5	70％

表1：Ce6和MB核动力源的比较数据[19]。OD=光源峰值波长处的光密度，NP浓度=1 mg/mL。
注：两种光敏剂使用相同的光源和配置。

与MB水凝胶NPs相比，Ce6水凝胶NPs唯一观察到的缺点是，随着Ce6负载量的增加，NP的亲水性总体降低。未来的Ce6工作应侧重于增加其纳米平台的亲水性，以便在动物和最终的hum应用中实现适当浓度的NPs一个模型。

结论

结果表明，与先前使用的MB纳米颗粒相比，制备的Ce6水凝胶纳米颗粒具有良好的生物相容性，并且在杀死癌细胞方面显示出更大的功效。这些信息对于选择含有纳米颗粒的最有效的PDT光敏剂是有用的，这将在即将进行的动物模型研究中得到证实。

致谢

我们感谢美国国家卫生研究院（NIH）R01CA186769（RK）的支持。

工具书类

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文章信息

物品类型：研究文章

引用：Hopkins T，Ukani R，Kopelman R（2016）含氯e6纳米颗粒的细胞内光动力活性。国际纳米医学杂志纳米堡2（4）：内政部http://dx.doi.org/10.16966/2470-3206.119

版权：©2016 Hopkins T，等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版历史记录：

收到日期:2016年11月03

接受日期：2016年11月14日

出版日期：2016年11月17日