摘要

包封结构在食品、制药和化妆品工业中用于药物传递和控释目的。在本研究中，利用玉米醇溶蛋白/壳聚糖双层结构来封装维生素C (VC)。首先用三聚磷酸钠(STPP)交联剂壳聚糖(CS)包埋VC。然后加入玉米醇溶蛋白包覆在vc包覆的CS纳米颗粒上。vc封装的玉米醇溶蛋白/CS微球球度良好，粒径在720 ~ 1100 nm之间。在室温下贮藏10天后，VC的氧化率仅为5%。只CS的纳米粒子相比,双层结构对制动释放VC有更好的性能在模拟胃液体(山东,pH值1.2)和实现控制释放在模拟肠道流体(SIF, pH值7.4),这提供了一个方法,进一步利用人体营养。

关键字

维生素C;壳聚糖;玉米蛋白;封装;控制释放

介绍

维生素C(抗坏血酸，VC)是一种弱糖酸，是人体必需的营养物质，已被证实与人和动物的许多生理过程有关[1,2]。它是人体组织中最重要的抗氧化剂之一，具有多种生物学功能，如增强免疫系统[3]，抑制致癌微生物，防止自由基损伤[4]。此外，VC的这些功能可能与其降低癌症发病率的潜力相关[5,2]。然而，由于缺乏l - gulonol内酯氧化酶[6]，VC在人体中无法合成。每天需要从外源性来源摄取VC，以保证人体正常的生理过程。在维生素c补充中遇到的挑战来自于维生素c在人体正常食品加工和食物摄入过程中的不稳定性。VC溶于水，对氧、光和热非常敏感。在中性或碱性条件下容易发生分解。为了克服这些问题，延长VC的保质期，增强其在人体的有效吸收，研究了微胶囊喷雾干燥、喷雾冷却、脂质体等不同技术和配方。例如，VC被封装在脂质体中，其保质期比VC在游离溶液[8]中的保质期长。 In recent years, gum arabic was used as shell material to encapsulate VC by spray drying and the result showed that the encapsulated VC was as stable as the crystallized VC under normal conditions [9]. Later, VC-loaded microcapsules were formed by different methods, such as melt dispersion, solvent evaporation, and thermal phase separation. Those formed capsules could successfully prevent VC from color change, improve its taste, and decrease its release rate [10].

微胶囊化是将固体、液体或气体成分装入微胶囊的过程，这样可以将核心物质与周围环境隔离，以增强稳定性并延缓蒸发。它还有助于治疗成分在人体内的可控释放[11,12]。近年来，该技术在食品和制药工业中受到重视。广泛的涂层材料已经被开发出来。例如，壳聚糖，一种低毒的亲水多糖，已经被证明在三聚磷酸钠(STPP)的帮助下用于VC的微胶囊口服，三聚磷酸钠是一种无毒的交联剂，具有快速胶凝能力[13]。然而，在磷酸盐缓冲盐水中观察到vc负载CS纳米颗粒的快速释放特性[13-15]。因此，提出了玉米醇溶蛋白在CS表面的二次涂层，以更好地保护VC。

玉米醇溶蛋白是储存在玉米胚乳中的一种脯胺蛋白，由于其良好的生物相容性和生物利用度，在食品和制药工业中得到了广泛的应用。玉米醇溶蛋白可以自组装形成生物基膜、疏水表面和封装，在食品包装、电子器件和口服增强[16]方面具有潜在的应用前景。玉米醇溶蛋白是一种两亲性蛋白，可溶于75%乙醇水溶液[17]。经溶剂蒸发后，可自组装形成微球。研究证明，在蒸发诱导自组装(EISA)过程中发生了从α-螺旋到β-薄片的构象转变，而EISA是一种用于促进纳米结构自组织的技术[18,17]。EISA是一个涉及二元或三级溶剂的过程。随着其中一种溶剂的优先蒸发，溶液的极性发生变化，从而驱动溶质的自组装。由于具有自组装能力，玉米醇溶蛋白被广泛研究用于包封生物活性化合物，如精油[19]、亚麻油[20]、维生素D3[21]、α-生育酚[22]、柠檬醛和石灰[23]。与其他壁材相比，玉米醇溶蛋白包衣大大提高了胶囊的控释功能，包括缓释和预防胃液的释放。然而，芯材的选择和输送颗粒的大小仍然是其广泛应用的限制。

玉米醇溶蛋白包封的核心材料通常是疏水或两亲性的。这与EISA过程中玉米醇溶蛋白在这些材料周围聚集的内在趋势有关。玉米醇溶蛋白在核心材料周围聚集后，可触发自组装球的形成。但对于肝素[24]、5-氟尿嘧啶[25]、pDNA[26]等高度亲水性物质，则不太适用。上述非疏水微囊化玉米醇溶蛋白微/纳米颗粒的直接制备虽有实验报道，但产品的形貌不理想，不可避免地影响了包封效率和药物传递。此外，在这些微/纳米胶囊化的研究中，广泛采用凝聚法获得更小的尺寸。微/纳米颗粒是通过玉米醇溶蛋白的脱溶，通过突然加入水溶液，同时进行有力的均质或搅拌。但指出了高能法[22]的缺点，即可能造成胶囊中不稳定成分的损失。

本研究的目的是利用壳聚糖和玉米醇溶蛋白制备VC的双层包封。采用SEM对颗粒形貌进行表征，ZETASIZER测量了包覆体的粒径和粒径分布。采用高效液相色谱(HPLC)和电喷雾质谱(ESI-MS)测定胶囊中VC的含量，考察胶囊VC的稳定性。并进行体外胃肠道研究，研究玉米醇溶蛋白-CS包封VC的释放谱，并与单纯CS包封的VC进行比较。

材料和方法

材料

VC (l -抗坏血酸，纯度99.7%)和三聚磷酸钠(STPP)购自天津大茂化工有限公司(中国天津)。脱乙酰度为80%、分子量为65 kDa的壳聚糖(CS)、胃蛋白酶(来自猪胃粘膜)和胰酶(来自猪胰腺)从Sigma-Aldrich Chemical Co. Ltd. (St. Louis, MO)获得。Zein从Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(东京，日本)获得。乙醇(96% v/v)来自广东光华科技有限公司(中国广州)。其他试剂均为分析级。所有的化学品都按收到的情况使用。

vc包覆CS纳米颗粒的制备

CS (2.0 mg/ml)溶于1% (w/v)乙酸溶液中，连续搅拌20 min，得到均匀溶液。将VC水溶液(1.0 mg/ml)缓慢加入CS乙酸溶液中，室温下1000rpm搅拌30min。将0.5 mg/ml的STPP溶液滴加到上述混合溶液中，1000 rpm搅拌30 min，形成vc包覆CS纳米颗粒悬浮液。溶液容器始终用铝箔覆盖，以避免VC降解。超离心(2.18 × 10)得到vc包覆的CS纳米颗粒⁴g)和冷冻干燥。

vc胶囊玉米醇溶蛋白/CS微球的制备

为制备vc胶囊化玉米醇溶蛋白/玉米醇溶蛋白微球，在制备的vc胶囊化玉米醇溶蛋白纳米颗粒悬浮液中加入一定量的乙醇，制成乙醇:水70:30 (v/v)的强醇溶液。然后分别滴加1、1.5、2、2.5、3 ml玉米醇溶蛋白溶液(10 mg/ml溶于70%乙醇-水)，连续搅拌。混合溶液以1000转/分搅拌30分钟，倒在蒸发盘上。在室温(25℃)下，通过EISA获得vc封装的玉米醇溶蛋白/ CS微球粉末。制备的样品保存在4°C，待进一步分析。

粒度评定及形态观察

用Malvern ZETASIZER 3000HSA (Malvern Instrument, London, England)测定vc封装的CS纳米颗粒的粒径。通过扫描电子显微镜(SEM)对vc包覆玉米醇溶蛋白/CS微球的粒径进行了测定。采用Image J软件对所选vc胶囊玉米醇溶蛋白/CS微球的SEM图像进行统计处理。

将样品颗粒重悬于去离子水中，室温下在铝箔上晾干过夜。箔片被切成小片粘在碳带上。然后用爱德华兹S150B溅射镀膜器对整个胶带进行镀金(300Å)，以帮助提高样品表面的导电性。扫描电镜图像由日本东京的JEOL JSM-6490扫描电镜获得。在一定分辨率的显微镜下，在随机区域内测量了微球的大小。在每个样品中随机选取6个区域获取平均直径，并用Image j对数据进行处理，并使用SEM分析vc封装玉米醇溶蛋白/CS微球的形貌。

封装效率

通过测定CS纳米颗粒悬浮液离心得到的上清中游离VC的含量，并与固体质量比计算得到的VC总含量进行比较，分析VC纳米颗粒的包封效率。计算VC加载效率(LE)。采用反相高效液相色谱法测定VC的释放量，紫外检测波长为245 nm[13]。采用ODS色谱柱(LiChrospher RP-18 5u, 250 × 4.6 mm)进行分离。流动相为甲醇，流速为0.5 ml/min。用公式1和2计算药物EE和LE:

$ $ EE \ = {{{rm \{总}}\,rm {VC}} {\ \, - rm{自由}}{\ \ {\ rm {VC}}} \ / {{\ rm总}{}\,{\ rm {VC}}}} \乘以100 ............( 1) $ $

$ $ LE \ = {{{rm \{质量}}\,rm的{}}{\ \,rm {VC}} {\ \, {\ rm在}{}\,rm{粒子}}{\ \,{\ rm{(毫克)}}}\ / {{\ rm{质量}}\,rm的{}}{\ \,rm{粒子}}{\ \,{\ rm {(g )}}}}............( 2) $ $

谱分析

用ESI-MS检测玉米醇溶蛋白/CS微球中VC的存在和稳定性。先将制备好的vc包覆玉米醇溶蛋白/CS微球(制备后10天，室温25℃保存)悬浮在去离子水中。然后在4℃下，10000 g离心15分钟，弃上清液，去除微球表面残留的VC。将留在底部的微球重悬于200µL甲醇:水80:20 (v/v)中，超声5 min，离心1 min，沉淀固体粉末残渣。上清液直接用负电离模式下的ESI-MS分析。

在模拟胃肠液中进行释放试验

VC胶囊在模拟胃液(SGF, pH1.2，含胃蛋白酶)和模拟肠液(SIF, pH7.4，含胰酶)中，在恒定37℃下连续搅拌释放试验。10 mg微球粉悬浮于5 ml SGF/SIF透析膜袋中，分子量10 kDa切断。然后将透析膜袋置于不含胃蛋白酶/胰黄素的100 ml SGF/SIF中。整个系统保持在恒定的37°C，并持续搅拌。在选定的时间间隔内，收集透析膜袋外的1ml溶液，并向释放系统补充1ml新鲜溶液。从释放体系中取1ml溶液，首先通过0.45 μL Acrodisc滤器过滤，去除悬浮蛋白聚集物，用反相高效液相色谱法直接测定VC的释放量。HPLC条件与第2.5节中描述的相同。

统计分析

所有实验均为3个重复，数据以均数±标准差(SD)表示。采用方差分析(ANOVA)与土耳其检验分析组间的差异。检验的显著性水平为0.05。

结果与讨论

粒径和形态

不同颗粒的平均直径列于表1，所选微球的SEM图像如图1所示。在制备条件下，vc包覆的CS纳米颗粒直径约为240 nm。玉米醇溶蛋白的进一步包埋增大了粒径。CS具有与STPP等多胺凝胶形成微球的能力，这一过程被称为离子致凝胶。在稀酸性溶液(1%乙酸，pH = 2.8)中，CS (pKa = 6.3)被质子化，其氨基葡萄糖单元转化为r - nhh_3.＋.然后加入反负离子STPP，可快速与CS形成分子间交联，并以纳米颗粒的形式沉淀。Alishsahi和[13]等人通过将VC与CS-STPP混合来研究VC的包封。vc包覆玉米醇溶蛋白/玉米醇溶蛋白微球的形成可以用玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白在溶剂蒸发过程中的不同行为来解释。CS凝胶在乙醇溶液中的溶解度和弹性很大程度上取决于溶液的极性。证据表明，当乙醇浓度大于50%时，CS凝胶的溶解度几乎为零[27]。认为玉米醇溶蛋白和CS凝胶在溶剂蒸发过程中发生了对比相变。玉米醇溶蛋白自组装成规则的球形，而壳聚糖凝胶在其较差的溶解状态下仍保持弹性。在凝胶弹性降低之前，壳聚糖被凝固后的醇溶蛋白壳包裹在较低的乙醇溶液中。这样VC就可以很好地封装在粒子内部。

玉米醇溶蛋白/CS微球的粒径与玉米醇溶蛋白浓度不呈线性关系。玉米醇溶蛋白与CS的质量比为2:1时粒径最小(720 nm)。SEM图像(图1)也显示，玉米醇溶蛋白/CS质量比为1.5:1、2:1和2.5:1的微球具有较好的球形完整性。玉米醇溶蛋白/玉米酸盐比例低和高时，颗粒变形趋势相似。当玉米醇溶蛋白浓度较低(玉米醇溶蛋白/玉米醇溶蛋白质量比<1.5:1)时，颗粒融合在一起形成大团聚体。这是因为玉米醇溶蛋白的含量不足以在CS-STPP纳米颗粒上形成完全覆盖的外壳，当溶剂极性增大时，半包覆的颗粒会被疏水相互作用吸引，这也解释了颗粒尺寸分布更宽的原因。随着玉米醇溶蛋白浓度的增加，颗粒的球形度增大，且粒径分布均匀。这是因为在每个CS-STPP纳米颗粒上提供了足够的聚合物来形成壳结构。而当玉米醇溶蛋白与CS的质量比达到3:1时，则达到了成膜阈值。分散球形是由于玉米醇溶蛋白在CS纳米粒子周围的融合和溶液基质中过量的玉米醇溶蛋白[17]所致。 It indicated that the particles, which showed the most balanced tendency of particle merging and film extension, had the smallest particle size and largest particle density.

表1:不同颗粒的平均粒径

图1:不同质量比(a) 0.5:1， (b) 1:1， (c) 1.5:1， (d) 2:1， (e) 2.5:1， (f) 3:1的vc包埋玉米醇溶蛋白/纤维素微球的SEM图像。

图2:vc封装玉米醇溶蛋白/CS微球的负离子ESI-MS谱图。

玉米醇溶蛋白/CS微球负载VC的稳定性

vc封装的玉米醇溶蛋白/玉米醇溶蛋白微球(玉米醇溶蛋白/玉米醇溶蛋白质量比为2:1)在室温下储存10天后，用ESI-MS对样品进行检测，光谱如图2所示。ESIMS光谱中有一个主要峰对应VC (m/ z175)，表明VC是样品的主要化学成分。除主峰外，还检测到一个与抗坏血酸氧化形成的脱氢抗坏血酸对应的小峰(m/ z173)，其强度约为VC峰的5%。串联质谱分析(MS/ MS)进一步证实了m/ z173处的峰的鉴定(图3)。因此稳定性测试表明，经过10天的储存后，至少95%的VC被很好地保护了不被氧化。在ESI-MS测试中，VC氧化生成的5%脱氢抗坏血酸也有可能产生。以上结果表明，我们的封装结构对内部的VC进行了很好的保护。

不同地层对在体外发布的风险

以释放介质中检测到的VC与被封装VC的质量比计算微球中VC的释放率。VC的封装量可以通过添加VC的量乘以EE来计算。根据2.5节计算，每克微球EE和LE分别为51.9%和51.2 mg VC。图4显示了体外释放的风险从CS纳米颗粒(0.87±0.12%含水率)和玉米蛋白/ CS微球(用玉米蛋白/ CS质量比2:1)在山东37℃420分钟快速破裂的VC CS纳米颗粒在第一个60分钟,大约有17%的VC被释放。然后释放率下降到0和20%的最终累计金额达到300分钟。相比之下,释放率低得多的玉米蛋白/ CS微球在前240分钟,只有约5%的风险被筛选了微球的释放率增加。此外，在420 min时，CS纳米颗粒释放VC的总量接近26%，是玉米醇溶蛋白/CS微球的2倍以上。释放速率的变化可以用释放机理来解释。VC的阴离子反离子与CS[14]的氨基之间的离子相互作用驱动VC包覆CS纳米颗粒的形成。VC分子均匀分布在形成的纳米颗粒中。因此，对于VC封装的CS纳米颗粒，初始快速释放归因于VC通过交联聚合物基体扩散到粒子表面[28]。 And the gradually decreased rate in the later stage was mainly attributed to the degradation of CS, which cost more time. Furthermore, in acidic environment, the CS and STPP were strongly associated and thus prevented the matrix from degradation. On the other hand, for VC-encapsulated zein/CS microspheres, owing to the well-sealed zein shell, the slow degradation of zein played a principal role and thus an extremely low releasing rate was observed in the first 60 min. The later increased release rate of VC from zein/CS microspheres could be attributed to the change of release mechanism. A considerable extent degradation of zein shell was achieved after four hours of digestion and the CS core was exposed. Since then, the diffusion of VC molecules began to appear, presenting a trend of increased release.

图3:负离子ESI-MS/MS谱为m/ z173离子

图4:VC包埋CS纳米粒和VC包埋玉米醇溶蛋白/CS微球对VC的体外释放曲线

玉米醇溶蛋白/CS微球在不同模拟流体中的VC释放

分别在SGF和SIF中研究玉米醇溶蛋白/CS微球对VC的累积释放。发布概要文件如图5所示。SIF在前10分钟出现VC的爆发性释放，释放量为20%。之后，释放率逐渐下降，最终占总释放的65%，远高于SGF中总释放的26%。不同消化酶对玉米醇溶蛋白的释放有显著差异。Hutrado et al.[29]研究表明，胃液中的胃蛋白酶只能消化α-玉米醇溶蛋白，而肠中的胰酶可以同时消化α-玉米醇溶蛋白和α-玉米醇溶蛋白二聚体，从而加快玉米醇溶蛋白球的分解。由图5可知，外玉米醇溶蛋白涂层在10 min内被消化，VC从暴露的CS颗粒表面迅速洗脱。然而，由于胃蛋白酶消化玉米醇溶蛋白的能力有限，SGF早期的释放速率相对较低。此外，由于pH值较高，CS纳米粒子内部的静电相互作用减弱，也影响了SIF整体释放速率的提高。玉米醇溶蛋白和CS的侵蚀均导致VC在肠内的洗脱水平升高。

图5:VC包埋玉米醇溶蛋白/ CS微球在SGF和SIF中的体外释放曲线

结论

VC被玉米醇溶蛋白和CS双层结构包裹。研究了玉米醇溶蛋白与玉米醇溶蛋白的配比对双层包封的形成和优化，并用SEM对其结构进行表征。ESI-MS结果表明，玉米醇溶蛋白和壳聚糖成功地包囊保护了VC。采用模拟胃肠道液体进行控释研究。通过在凝胶化VC胶囊CS纳米颗粒中添加额外的玉米醇溶蛋白壳，对VC进行双重包埋，成功地保护了药物的降解，延缓了药物在胃中的释放，促进了药物在肠中的释放。结果表明，这种双层包封方法具有应用于其他极性药物控释的潜力。

确认

国家自然科学基金(项目编号:51303153);香港理工大学(项目编号:1- zva9,5 - zdaj, G-UC07, G-YK99)资助。关键词:岩石力学，数值模拟，数值模拟感谢香港理工大学材料研究中心的帮助。

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条信息

文章类型:研究文章

引用:关键词:玉米醇溶蛋白/壳聚糖双层结构，维生素C，稳定性，控释国际纳米医学纳米外科2(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2470-3206.109

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出版的历史:

收到日期:2016年1月20日

接受日期:2016年1月23日

发表日期:2016年1月28日