摘要

摘要目的:fms相关酪氨酸激酶的重要作用(FLT3)在造血系统和免疫系统的发展中的作用。研究表明FLT3突变在急性髓系白血病（AML）发病机制中起关键作用。FLT3-内部串联复制（（FLT3-ITD））作为小儿急性髓系白血病的重要预后指标。但急性淋巴母细胞白血病(ALL)尚不清楚，目前有关ALL的资料很少。研究调查FLT3土耳其儿童急性白血病的突变非常少。也FLT3-D835儿童白血病的突变状态还没有得到很好的研究。因此，本研究的目的是进行筛选和分析FLT3土耳其儿童急性白血病患者的突变。

材料与方法:研究人群包括27例儿科患者（FLT3-ITD）183例患儿中FLT3-D835突变患者被诊断为急性白血病。（FLT3-ITD）采用实时聚合酶链反应(PCR)方法荧光HRM (High Resolution Melting)分析进行突变筛选。FLT3-D835采用限制性片段长度多态性(RFLP)法检测变异。

结果：我们发现（FLT3-ITD）33.3%的研究组(n=27)发生突变。FLT3-D835筛查显示7.6%的患者携带杂合子基因型。统计分析表明FLT3-D835杂合子突变与诊断和危险人群相关。但是没有发现同样的相关性（FLT3-ITD）突变的样品。我们也发现之间没有相关性FLT3患者的突变和临床特征。

结论:我们观察到FLT3与之前的研究相比，土耳其儿童急性白血病患者的突变。我们的结果表明……的重要性FLT3突变是小儿急性白血病患者预后和诊断的重要标志。

关键词

儿童急性白血病;（FLT3-ITD）；FLT3-D835酪氨酸激酶

缩写:

AML:急性髓系白血病;ALL:急性淋巴母细胞白血病;HRM:高分辨率熔化;PCR:聚合酶链反应;RFLP:限制性片段长度多态性

介绍

与fms相关的酪氨酸激酶(FLT3)是一种受体酪氨酸激酶，对造血祖细胞的增殖、存活和分化具有重要作用[1,2]。FLT3是III类酪氨酸激酶受体之一，由胞外5个免疫球蛋白样结构域、胞内近膜结构域、2个激酶插入结构域和一个c端尾[3]组成。FLT3基因位于13号染色体(13q12)，有24个外显子[4]。高表达的FLT3在急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)和慢性髓系白血病(CML)的原始危象[5]中均有表现。Rosnet等[6]也表明FLT3在AML和B-ALL病例中，在白血病母细胞上表达。两类FLT3白血病中已经描述了突变:FLT3内部串联复制(（FLT3-ITD）)和酪氨酸激酶结构域(TKD)突变。的JM域内存在一个串联重复序列FLT3由第14和15外显子编码FLT3包括第二酪氨酸激酶结构域特别是密码子D835的突变。所有这些突变都引起氨基酸序列的变化，并引起构成性激活FLT3激酶活性[7]。（FLT3-ITD）儿科AML的突变患病率为11-33％，并鉴定为差的结果的显着独立预后因素[8-12]。（FLT3-ITD）等位基因比(突变-野生型比大于0.4)也被发现是小儿AML[13]复发的重要预后因素。有人建议（FLT3-ITD）在AML的诊断和治疗[9]的管理中，应考虑并将检测作为常规检查。其他类型的FLT3突变的频率较低（FLT3-ITD）急性白血病患者的突变。很少有研究调查FLT3突变的土耳其儿童白血病患者[14,15]。因此在我们的研究中，我们的目标是筛选（FLT3-ITD）通过HRM和PCR分析TKD突变，寻找可能的分子白血病遗传标记。

材料和方法

病人样本

研究人群为27例（FLT3-ITD）183例患者中FLT3-D835突变患者年龄在1至15岁之间，因诊断为急性白血病而被土耳其安卡拉Losante儿童血液肿瘤医院收治。血样被采集到含EDTA的试管中，并使用MagNA纯自动DNA分离仪从外周血白细胞中提取DNA（德国曼海姆罗氏诊断公司）。在研究之前，从患者父母处收集知情同意书。

确定FLT3突变

对于（FLT3-ITD）基因突变:（FLT3-ITD）利用实时荧光定量PCR (Genes-4uFLT3-ToolsetTM Roche Diagnostics, Gmbh, Manheim, Germany)使用基于基因型谱的荧光HRM分析。选择阴性对照作为基线，绘制不同的图。因此，所有其他样品的荧光图相对于该样品。分析荧光信号，以显著差异作为突变[16]的指标。

对于FLT3-D835基因突变:采用PCR方法进行基因扩增。中使用的引物FLT3-D835诱变结果如下:正向引物:5 ' -CCG CCA GGA ACG TGC TTG-3 ';反引物:5 ' -GCA GCC TCA CAT TGC CCC -3 '。中使用的引物FLT3-D835突变的设计如Moreno等人[17]所述。密码子835编码了一个天门冬氨酸氨基酸，为限制性内切酶EcoRV提供了一个识别位点;因此，突变体可以被检测到通过丧失该酶限制性位点。

然后用适当的限制性内切酶(EcoRV通过测序仪（Beckman Coulter CEQ 2000 XL DNA分析系统，美国）对不同的谱带进行测序。

统计分析

采用社会科学统计软件包(SPSS) 20版软件进行统计分析。之间的相关性FLT3采用单因素方差分析(One way ANOVA test)对突变和诊断或风险组进行分析。采用Mann-Whitney检验确定两者之间的相关性FLT3突变和患者的临床和实验室特征。P值小于0.05为有统计学意义。

结果

对27例确诊为急性白血病的儿童进行了白血病筛查研究（FLT3-ITD）突变。使用荧光HRM分析进行筛选（图1）。图1显示了对（FLT3-ITD）突变。

图1:用于FLT-ITD突变的HRM测定

27名儿童的详细临床化验资料见表1。我们确定（FLT3-ITD）9例(33.3%)发生突变。27例患者中有1例(3.7%)同时携带两种病毒（FLT3-ITD）突变和FLT3-D835杂合子表型（FLT3-ITD）阳性患者按诊断分为:AML (n=5);b (n = 3);前b (n = 1)。ITD阳性患者的中位年龄为8岁(范围:2-13)，而ITD阴性患者的中位年龄为5.25岁(范围:1.2-10)。男性患者比例均高于女性患者（FLT3-ITD）阳性（男性：66.6%；女性：33.3%）和（FLT3-ITD）负(男:61.1%;女:38.8%)样品。中位白细胞计数(WBC)（FLT3-ITD）阳性患者为12600 × 10⁹l^－1而在（FLT3-ITD）阴性患者为12150 × 109 L-1。中位血红蛋白(Hb)水平（FLT3-ITD）阳性患者为9.3 g dL^－1而在（FLT3-ITD）阴性患者为8.3 g dL^－1．中位血小板(PLT)（FLT3-ITD）阳性例数75000×10⁹l^－1而在（FLT3-ITD）阴性患者为26000 × 10⁹l^－1．中位骨髓爆炸（FLT3-ITD）阳性患者占98%（FLT3-ITD）阴性患者为100%。CD34中值（FLT3-ITD）阳性患者占10%（FLT3-ITD）阴性患者占35%。患者的诊断分布及临床特征总结见表2。

特征	（FLT3-ITD）积极的病人	（FLT3-ITD）负病人
没有病人	9	18
诊断不。（%）
AML	5 (55.5)	4 (22.2)
前b	1 (11.1)	8 (44.4)
b	3 (33.3)	2 (11.1)
所有	0	2 (11.1)
JMML	0	1 (5.5)
所有	0	1 (5.5)
年龄中位数	8 (2 - 13)	5.25 (1.2 -10)
性,没有。（%）
男性	6 (66.6)	11 (61.1)
女	3 (33.3)	7 (38.8)
中位数白细胞计数(×109l－1）	12600	12150
中位Hb (g dL－1）	9．3	8.3
平均PLT（×109l－1）	75000	26000
BM爆炸中值（%）	98	One hundred.
中位数CD34 (%)	10	35
T(9、22)
积极的	1	3.
负	8	15

表格1：包括27例患者的临床特征和突变状态FLT3基因突变筛查

表2:包括27例患者的临床特征和突变状态FLT3突变筛选WBC:白细胞;Hb:血红蛋白;PLT:血小板;BM:骨明天;WT:野生型;人力资源:高风险;圣:标准风险;MR:中度风险，NA:不可用。

筛选FLT3-D835对183名被诊断为急性淋巴细胞白血病或髓系白血病的儿童进行了突变。RFLP方法用于该筛查（图2）。实验结果表明，183名儿童中有14名（7.6%）携带杂合子基因型。对杂合子患者的基因测序显示杂合子“C/a”变异发生在c.32705。14名杂合子患者中有9名（64.2%）被诊断为B-ALL前病变。14名杂合子患者中有2名（14.2%）被诊断为B-ALL前病变。根据他们对其余杂合子患者（14名中有3名）的诊断，分布为T-ALL、ALL和JMML。

图2:a)PCR扩增的FLT3-D835地区。b)用于检测的扩增片段的消化产物FLT3-D835突变。

实验结果表明，两者之间存在显著相关FLT3-D835杂合子突变和诊断(p=0.003)以及危险人群(p=0.045)。两者之间没有相关性（FLT3-ITD）突变和诊断或危险群体。我们探讨了两者之间存在相关性的可能性FLT3突变与患者的临床特征(年龄、WBC、PLT、Hb、CD34和BM blast)无相关性。

讨论

的意义FLT3在正常的淋巴组织中，造血干/祖细胞的功能已为人所知。因此FLT3突变在白血病的发病机制中起着关键作用。（FLT3-ITD）突变是成人AML中最常见的突变之一，约20-27%的患者发生突变[9,18-21]。在小儿急性髓系白血病患者中（FLT3-ITD）突变较成人患者[20]低(5.3-22.2%)。没有太多的研究来调查FLT3-D835儿童急性白血病患者的突变。Liang等人[22]调查FLT3-D835在儿童AML患者中发现突变，该突变的发生率为3.3%。Nasiri等人研究[23]FLT3-D835在100名儿童急性白血病患者中发现突变，AML和ALL患者中发现该突变的频率分别为3.7%和1.3%。在沙特儿童ALL患者和塞尔维亚儿童AML患者中进行的研究显示FLT3-D835突变率分别为2.1%和9.5%[24,25]。据我们所知，只有两项研究被调查过FLT3土耳其儿童急性白血病患者的突变[14,15]。Ozbek等人[14]报道FLT3- ITD突变率为4%，并观察到FLT3-D835点突变杂合酶仅为1名患者（2.0％）。Karabacak等。[15]在所有患者中发现FLT3-ITD突变7.5％，在AML患者中22.5％。他们没有识别FLT3 /跆拳道在他们的病人身上发生突变在研究中，我们发现（FLT3-ITD）在55.5%的AML诊断患者和22.2%的ALL诊断患者中存在突变。FLT3-D835杂合度为7.6%。因此，我们的结果显示更高（FLT3-ITD）和FLT3-D835突变频率比ozbek等。[14]和Karabacak等人。ozbek等人旁边。[14]使用PCR方法筛选（FLT3-ITD）突变。但我们更喜欢用人力资源管理分析来识别（FLT3-ITD）突变。与PCR[26]方法相比，HRM分析法灵敏度更高。我们的高（FLT3-ITD）突变率可能与我们的敏感分析方法有关。此外，我们的研究结果与Ozbek和Karabacak的研究相比有差异和显著性，不仅包括AML患者，还包括ALL患者，我们观察到7.6%FLT3-D835杂合子在我们的白血病组。

我们研究小组的一位患者表示（FLT3-ITD）突变和FLT3-D835点突变杂合在一起。该患者为8岁女童，诊断为B-ALL，属于高危人群。她有12000 (× 10)⁹l^－1)白细胞计数，10.5 (g dL^－1) Hb, 115000 (× 10⁹l^－1) PLT计数，18% BM, 8% CD34。细胞遗传学检测显示她明天的骨骼样本中有8号三体她在28岁时首次进入缓解期^th她接受化疗的那天。但18个月后，她被诊断为复发。报道的双突变病例很少[14,17,27]。这些研究是针对AML患者进行的。在报道的研究中，携带双突变的患者在治疗期间或[17]复发后死亡。据我们所知，这是第一个双引号FLT3突变，8三体和所有。旁边FLT3突变，8三体可能与该患者预后差[28]有关。因此,双FLT3与AML患者一样，ALL突变可能与不良预后和复发有关。

在我们的研究中，我们发现FLT3-D835杂合子突变和诊断(p=0.003)以及危险人群(p=0.045)。但在两者之间没有发现类似的相关性（FLT3-ITD）突变和诊断或危险群体。

Ozbek等[14]报道两者之间无相关性FLT3研究组AML患者基因突变、年龄、性别、白细胞计数、母细胞率或FAB分型。Karabacak等人[15]的结论是，实验室结果与FLT3 / ITDALL和AML患者均呈阳性。但是他们发现了FLT3 / ITD积极向上，年龄增长。我们没有发现两者之间的相关性FLT3我们研究中患者的突变和临床特征（年龄、白细胞、血小板、血红蛋白、CD34和骨髓母细胞）与Özbek和Karabacak的研究相似。但一些研究发现，白细胞计数高和骨髓母细胞比例高与糖尿病呈正相关（FLT3-ITD）积极的样品(9,23)。

我们的统计分析显示FLT3-D835杂合子突变和诊断(p=0.003)以及危险人群(p=0.045)。这个结果表明FLT3-D835突变可作为ALL的预后指标，对诊断有帮助。众所周知（FLT3-ITD）突变是急性白血病预后不良的标志物，但我们并没有发现两者之间有类似的相关性（FLT3-ITD）突变和诊断或风险组。这一结果可能是由于我们的小型混合研究组。

细胞遗传学预后因素在临床应用中更受青睐。但有必要加强对突变状态等分子因素的分析和临床应用Flt3, mll, npm1, cepa特别是在核型正常的情况下。

我们的研究是为数不多的分析FLT3土耳其儿童急性白血病患者的突变状态。它还指出了FLT3-D835所有患者的预后均发生突变。

的利益冲突

提交人声明他们没有利益冲突，包括与所包括的主题或材料有关的具体的财务利益，关系和/或附属关系。

参考

1. Lyman SD（1995）生物科学FLT3配体和受体。国际血液杂志62:63-73[Ref。］
2. 小D (2006)FLT3突变:生物学和治疗。血液学Am Soc Hematol教育计划2006:178-184。［Ref。］
3. Agnès F, Shamoon B, Dina C, Rosnet O, Birnbaum D, et al.(1994)人类下游部分的基因组结构FLT3基因：编码III亚类受体酪氨酸激酶（RTK）基因的外显子/内含子结构保守。基因145:283-288[Ref。］
4. Abu-Duhier FM, Goodeve AC, Wilson GA, Care RS, Peake IR, et al.(2001)人类基因组结构FLT3:突变分析的含义。Br J Haematol 113: 1076-1077。［Ref。］
5. Carow CE, Levenstein M, Kaufmann SH, Chen J, Amin S, et al.(1996)造血生长因子受体的表达FLT3(STK-1/ Flk2)在人白血病中的作用。血87:1089 - 1096。［Ref。］
6. [j] .中国生物医学工程学报，1998,16 (4):441 - 446FLT3 / FLK2受体酪氨酸激酶在正常和恶性造血细胞表面表达。白血病10:238 - 248。［Ref。］
7. 唐纳德·斯莫尔(2008)FLT3用于治疗白血病。血清素45:S17-S21。［Ref。］
8. Meshinchi S, Woods WG, Stirewalt DL, Sweetser DA, Buckley JD, et al.(2001)患病率和预后意义FLT3小儿急性髓系白血病的内串联复制。血97:89 - 94。［Ref。］
9. Kottaridis PD, Gale RE, Frew ME, Harrison G, Langabeer SE等(2001)FLT3急性髓系白血病(AML)患者的内部串联重复增加了重要的预后信息到细胞遗传学危险组和第一个化疗周期的反应:对来自英国医学研究委员会AML 10和12试验的854例患者的分析。血98:1752 - 1759。［Ref。］
10. Zwaan CM, Meshinchi S, Radich JP, Veerman AJ, Huismans DR，等(2003)FLT3234例急性髓系白血病患儿的内串联重复:预后意义和细胞耐药关系血102:2387 - 2394。［Ref。］
11. Kondo M, Horibe K, Takahashi Y, Matsumoto K, Fukuda M, et al.(1999)内串联复制的预后价值FLT3儿童急性髓细胞白血病的基因。儿科肿瘤33:525-529[Ref。］
12. Liu Y Y, Tang J, Wakamatsu P, Xue H, Chen J, et al.(2014)高分辨率熔化曲线分析是一种快速、经济的儿童急性髓系白血病突变分析方法。前小儿科2:96。［Ref。］
13. Meshinchi S, Alonzo TA, Stirewalt DL, Zwaan M, Zimmerman M, et al. (2006)FLT3儿童AML基因突变。血108:3654 - 3661。［Ref。］
14. Coşkunpınar E、Anak S、Ağaoğlu L、Unüvar A、Devecioğlu O等（2012年）染色体畸变和染色体畸变分析FLT3儿童急性髓系白血病患者的基因突变Turk J Haematol 29: 225-235。［Ref。］
15. Karabacak BH, Erbey F, Bayram I, Yilmaz S, Acipayam C, et al.(2010)儿童急性白血病中fms样酪氨酸激酶3突变及其与预后的关系。asia Pac J Cancer Prev 11,923 -927。［Ref。］
16. Tan AY, Westerman DA, Carney DA, Seymour JF, Juneja S, et al. (2008) NPM1外显子12突变的检测FLT3- 正常核型急性髓白血病高分辨率熔化分析的内部串联重复。J hematol oncol 1：10。[Ref。］
17. Moreno I, Martín G, Bolufer P, Barragán E, Rueda E，等FLT3急性髓系白血病的内部串联复制和D835突变Haematologica 88: 19到24。［Ref。］
18. Abu Duhier FM、Goodeve AC、Wilson GA、Gari MA、Peak IR等（2000年）FLT3成人急性髓系白血病的内部串联重复突变定义了一个高危组。《血液学杂志》111:190-195。[Ref。］
19. (1)基于遗传算法的人工神经网络分析FLT3979例急性骨髓性白血病患者中-激活突变:与FAB亚型的关系及预后不良亚群的鉴定血99:4326 - 4335。［Ref。］
20. Levis M, Small D (2003)FLT3它在白血病中很重要。白血病17:1738 - 1752。［Ref。］
21. Al-Husseinawi EK(2014)探测（FLT3-ITD）2家伊拉克医院的25名急性淋巴细胞白血病患者的突变频率儿科血液醇Oncol 36: e207-e211。［Ref。］
22. 梁德昌，施力，洪英杰，杨国平，陈淑，等。（2003）FLT3-TKD儿童急性髓系白血病的突变。白血病。17:883 - 886。［Ref。］
23. Nasiri N, Shaikhy M, Zaker F, Hosseini S, Moosavi SA, et al.(2014)检测和生物学特性FLT3急性白血病儿童的基因突变。伊朗医学院学报17:258-261[Ref。］
24. Elyamany G, Awad M, Fadalla K, Albalawi M, Al Shahrani M，等FLT3沙特阿拉伯急性髓系白血病患者的突变。Adv Hematol 2014: 141360。［Ref。］
25. Krstovski N、Tosic N、Janic D、Dokmanovic L、Kuzmanovic M等（2010）癌症发病率FLT3和核磷蛋白基因突变在儿童急性髓系白血病中的作用:塞尔维亚的经验和文献综述。地中海急救27:640-645。［Ref。］
26. 谭爱，王树清，Nyvold CG, Carney DA, Wei A，等(2012)快速检测FLT3急性髓系白血病患者外显子20酪氨酸激酶结构域突变的高分辨率熔化分析白血病53:1225-1229。［Ref。］
27. [王磊，林东，张旭，陈胜，王明，等。(2005)基于遗传算法分析。FLT3中国急性白血病患者体内串联复制与D835突变Leuk Res 29: 1393-1398。［Ref。］
28. Ankathil R, Stephen J, Vasudevan DM, Kusumakumary P, Pillai GR, et al.(1992)核型分析在儿童急性淋巴细胞白血病中的预后意义。红色素10:339-344。［Ref。］

在此下载临时PDF

条信息

文章类型:研究文章

引用:Akin DF，Mumcouglu M，Oner DA，Ozturk M，Ezer U，et al.（2016）土耳其儿童急性白血病患者FLT3基因突变（FLT3 Itd和D835）的筛查。J Mol Med临床应用1（1）：doihttp://dx.doi.org/10.16966/2575-0305.104

版权:©2016 Akin DF等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

收到日期：2016年8月31日

接受日期:2016年10月17日

发表日期:2016年10月21日