
图1:Metal-phosphole复合物(C1 - 6).
撒母耳Alfonso-Bueno1,2彼得·泰勒2Izaskun Urdanibia2威廉·卡斯特罗3 *约迈拉·奥特罗3 *
1洛斯安第斯大学,Ciencias学院,学部Química, Mérida,委内瑞拉*通讯作者:Otero Y, Centro de Química, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, 1020-A,加拉加斯,委内瑞拉电话:+ 58 212 5041637;电子邮件:yotero@ivic.gob.ve;yomaira@gmail.com
卡斯特罗W,炫酷德QUIMICA,研究所Venezolano科学调查德Científicas,1020-A,加拉加斯,委内瑞拉,电话:+ 58 212 5041642;电子邮件:wcastro@ivic.gob.ve;wcastro10@gmail.com
众所周知,Au(I)配合物由于其强大的抗增殖能力和高效力和特异性抑制硫氧还蛋白还原酶(TrxR),具有潜在的抗癌潜力。金(I)膦配合物作为抗癌药物已显示出巨大的潜力,但由于其高毒性和对癌细胞缺乏选择性,其疗效一直受到限制。有效抗癌药物的设计是一个复杂的博弈过程,因此研究新型抗癌配合物是十分必要的。在本工作中,我们合成了Au(I)-磷孔配合物(C1C2,及3.),利用不同的π共轭磷孔衍生物如:2,5-二(2-吡啶基)-1-苯基磷孔(L1), 1、2、5-triphenylphosphole (L2)和2,5-双(2-噻吩基)-1- phenylphosphole(L3.),并通过波谱滴定、黏度、分布系数、电泳、肿瘤细胞系抑制等方法评价其与DNA作为抗癌药物主要作用靶点的相互作用。我们观察到Au(I)-磷孔配合物(C1-3.)可能由于DNA螺旋中的弯曲或扭结,导致DNA的相对粘度比游离磷酰衍生物降低。电泳和光谱滴定结果表明,所有化合物通过较弱的相互作用(非共价)与CT-DNA结合。此外,我们发现化合物C1和C2对细胞生长和活力无影响,而C3.抑制人乳腺癌(MCF7)和人前列腺癌(PC3)癌细胞体外生长,浓度低于30µM,以这种方式证实了与DNA相互作用的研究和细胞毒活性之间的关系。
Au-Phosphole情结;π共轭Phospholes;DNA;硫氧还蛋白;细胞毒性
金属配合物在癌症的发展和治疗方面都获得了相当大的兴趣。例如,铂化合物已在目前的癌症[1]中得到很好的证实。顺铂是目前应用最广泛的靶向DNA的金属基抗肿瘤药物之一。尽管它在几种类型的癌症的治疗中是活跃的,但副作用限制了它的潜在疗效[2,3]。因此,有相当大的需要发展新的金属药物和治疗替代品。在新型非铂类药物中,特别是金配合物因其对肿瘤细胞生长具有较强的抑制作用,表现出独特的生物学和药用特性而备受关注[4,5]。特别是Au(I)膦配合物在抗癌方面表现出巨大的潜力,但由于其高毒性和对癌细胞[6]缺乏选择性,其疗效受到限制。
在另一方面中,提供phospholes的配位模式和反应模式[7]宽的通用性。他们的过渡金属配合物的结构多样性已经由磷环的σ,π,和混合的结合模式[8,9]到坐标金属的能力促进。磷杂环络合物在等不同的催化,有机发光二极管,和的WOLED非线性光学[8,10-17]字段被使用。通过配位到金属中心的亲核磷原子的修饰允许基于磷杂-π共轭系统[14,18]的电子特性的微调(HOMO和LUMO能级,有效共轭长度,等)。这是在药物无机化学重要,因为它允许所述生物活性(增加的亲和性和/或减少的副作用)针对特定目标,如DNA或人二硫化物还原酶这种络合物的,这可能使这些化合物有希望的候选化疗的调制应用[1,4,19]。
金(I) -和铂(II) -磷孔配合物(C1 - 5,图1)表明是有效的硫氧还蛋白还原酶(TrxR)抑制剂,金(I)配合物是最好的GR(谷胱甘肽还原酶)抑制剂。它们的抑制特性与DNA的高亲和力相辅相成,导致对胶质母细胞瘤细胞的毒性[20]。配合物[Au{1-苯基-2,5-双]对人类GR的抑制作用(2-吡啶基)膦酰基}Cl](C1)与许多细胞过程有关,如抗氧化防御、氧化还原平衡、各种蛋白质的调节和核苷酸代谢[21,22]。
图1:Metal-phosphole复合物(C1 - 6).
最近,我们对[Cu{1- phenyl-2,5-bis(2-thienyl)phosphole}的生物活性进行了评价。2Cl](C)6.)与小牛胸腺(CT) DNA的结合、分布系数、与TrxR的相互作用及其细胞抑制和细胞毒活性,特别是对PC3前列腺抑制肿瘤细胞株的作用。我们发现与DNA的非共价相互作用,与CT-DNA的弱相互作用,TrxR系统似乎不是作用的目标。此外,我们还研究了化合物C的亲脂性6.,发现它可能更有效地穿透细胞膜比配体或顺铂,该化合物对肿瘤细胞系[23]的抑制作用很小。
设计一种有效的抗癌药物不仅要考虑药物固有的抑制特性,还要考虑药物的传递量、剂量和停留时间在活的有机体内因此,金属的选择和配体的设计被认为是构建高效金属基药物的重要前提。考虑到这些因素,扩展Au(I)-磷孔配合物的研究可能是富有成效的。因此,我们研究了不同Au(I)-磷孔配合物(C1-3,图1),以及它们对癌细胞系的抗增殖作用。
除非另有说明,否则所有反应均采用标准Schlenk技术在氩气气氛下进行。溶剂之前采用标准技术干燥和蒸馏[24]。
1-苯基-2,5-二(2-吡啶)磷孔(L1), 1、2、5-triphenylphosphole (L2)和1-苯基-2,5-二(2-thienyl)磷孔(L3.)与四氢呋喃溶液(40ml)对应的八ta-1,7-二炔(0.83 mmol)和Cp2ZrCl2(0.24 g, 0.83 mmol)在-78℃下滴加1.6 M的正己烷溶液n正丁基锂(1.06毫升,1.7毫摩尔)。将反应混合物温热至室温并搅拌12小时。向该混合物中加入溶液中,在-78℃下,新鲜蒸馏PhPBr2(0.250 g, 0.91 mmol)。将溶液加热至室温,搅拌18 h,在惰性气氛下在碱性氧化铝上过滤,去除挥发性物质在真空内.用刚蒸馏的戊烷(10 mL)洗涤产品,得到固体[14,25]。
[Au{1-苯基-2,5-二(2-吡啶基)磷孔}Cl] (C1),(非盟{1,2,5-triphenylphosphole} Cl) (C2)和[金{1- phenyl2,5双(2-噻吩基)磷杂} CL](C3.)-A溶液[AuCl(THT) (0.175 g, 0.55 mmol)和相应的磷孔(0.55 mmol)在CH2Cl2(20 mL)在氩气下室温搅拌1h。然后在真空下将挥发性物质全部去除。残渣用戊烷(3 × 10 mL)洗涤,在40°C真空下干燥[26,27]。
粘度测量-所有实验均使用奥斯特瓦尔德粘度计在25°C水浴中进行。所有样品中的DNA浓度(65μM,小牛胸腺DNA在5 mM Tris–HCl、50 mM NaCl和pH 7.54中)保持恒定,同时[化合物]和[DNA]之间的摩尔比保持不变将溶液中化合物的浓度从0增加到67.5μM。测量了四次平均流动时间。数据表示为(η/η0.)1/3相对于比[化合物] / [DNA],其中η和η0.子是DNA的在所述化合物的存在和不存在的特定的粘度,分别。η和η的值0.由η=t - t年代和η0.=t0.–t年代式中,t为观察到的dna化合物流动时间,t年代是DMSO缓冲液(使用10% DMSO)的流动时间和to只有DNA的流动时间DNA的相对粘度由η/η计算0.[28],使用溴化乙锭作为经典插层控制。
电泳-对于DNA电泳分析,将10μL pBR322质粒样品(20μg/mL)与化合物L结合1-3和C1-3(化合物/DNA的摩尔比(Ri) 1-4), 37℃孵育18 h。然后反应是淬火的氯化钠(1米)给最后一个氯浓度为0.2 M .每个样本(5毫升)运行(40分钟。100 V) 0.7%的琼脂糖凝胶与此种1 x (Tris-HCl 0.45米,0.45米的硼酸,10毫米EDTA)和溴化乙锭染色[29]。然后用透射器观察波段,并使用Cool Snap HQ2 (BIO-RAD)相机、Universal HOOD III型号[30]相机捕捉图像。
分光光度法滴定-Absorption滴定实验通过叶绿体DNA溶液的逐步添加进行(1.38毫米,在5mM的Tris-HCl,pH值7.54和50mM NaCl的缓冲液),以在每个DMSO化合物(0.4μM)的溶液中,记录UV-可见光谱每次添加后。天然的DNA吸收,通过加入相同量的CT-DNA的空白单元格中减去。的结合亲和力(KB)是根据以下等式[31]从分光光度数据中计算。
\[\压裂{{(DNA)}} {{{\ varepsilon _a} - {\ varepsilon _f}}} = \压裂{{(DNA)}} {{{\ varepsilon _0} - {\ varepsilon _f}}} + \压裂{1}{{Kb ({\ varepsilon _0} - {\ varepsilon _f})}} \]
其中,[DNA]是DNA的碱基对的浓度,ε一个是给定DNA浓度下观察到的吸收带的消光系数(对应于obs/[化合物]、εf是溶液中游离化合物的消光系数,εb为化合物与DNA完全结合时的消光系数。[DNA]/[ε .一个- - - - - -εf与[DNA]相比,[ε]有一个斜率一个- - - - - -εf, Y轴截距为1/Kb[ε .]b- - - - - -εf].Kb是斜率与截距的比值。
分布系数(D-用搅拌瓶法测定水/正辛醇分布系数[32,33]。制备了各化合物在正辛醇饱和水中2 ~ 50 μM范围内的紫外-可见(UV-vis)校准曲线。5毫升正辛醇和5毫升水的混合物(Tris-HCl 5毫米;氯化钠50 mM;加入待分析样品后,在室温下搅拌30分钟。一旦达到平衡,就将有机相和水相分离,并使用正辛醇来测定各相中化合物的浓度。实验是重复进行的。分布常数Log P由Log P=Log[化合物在正辛醇中]/化合物在水中][34]计算得到。
生长抑制和细胞毒性-使用五种人类和一种小鼠肿瘤细胞系。MCF7(人类乳腺癌)、PC-3(人类前列腺癌)、A459(人类肺癌)、HeLa(人类宫颈癌)、HT-29(人类结肠癌)和4T1(小鼠乳腺癌)细胞(美国ATCC美国型培养物收集中心)在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养,添加10%的热灭活胎牛(Gibco,BRL,USA)和青霉素(100单位/mL)/链霉素(100μg/mL),HT-29细胞还含有0.45%的葡萄糖该试验用于评估化合物对六种肿瘤细胞系的生长和生存能力的影响[35]。该分析基于带负电的磺基霍达明与细胞内碱性氨基酸的结合,从而能够估计细胞质量。将每种药物溶解在二甲基亚砜中,然后在七种不同浓度(0.1-30μM)下进行一式三份的分析,在3个独立实验中。包括内部控制孔,以确保使用的最高浓度的DMSO不会影响细胞。该浓度诱导50%的生长抑制(GI50)总生长抑制(TGI)和50%细胞毒性(LC50)在48小时潜伏期后,由邻近数据点线性插值计算。
粘度测量-为了建立化合物/DNA相互作用的模式,我们进行了黏度实验,因为它经常被用作澄清DNA生物分子和感兴趣的化合物之间相互作用的最不模糊和最简单的方法[36,37]。DNA黏度的变化与DNA长度的变化明确相关,并且对药物插入或非插入结合[38]非常敏感。例如,溴化乙啶,一种著名的DNA插层剂,由于插层[39]所产生的DNA双螺旋的延长,增加了DNA的相对比粘度。在这里,我们观察到DNA的相对粘度在磷孔衍生物(L1-3)(图2)获得的结果EtBr相比,表明DNA弯曲或缺陷,或没有强相互作用与DNA,这种行为已经证明了类似的化合物,这是由于规模和和non-planarity phosphole分子,防止它被插入DNA。另外,Au(I)-磷孔配合物(C1-3)显示了类似的行为,导致DNA的相对粘度略有下降(图2),这种行为是合理的,因为金属中心与磷孔的配位不会对配体的结构产生显著变化,也不会插入大分子。因此,我们认为配合物(C1-3)并没有显著改变DNA的三维结构,正如铂(II), Au (III)和Ag (I)的配合物所发现的那样,它们没有插入相互作用[40-42]。然而,这并不意味着它们可以与DNA有另一种类型的相互作用。
图2:25℃时,化合物浓度的增加对CT-DNA相对粘度的影响。相对粘度(η/η0.)1/3vs(复合)/ (DNA)。
电泳用pBR322 DNA - 凝胶电泳实验用化合物L1-3和C 1-3进行。琼脂糖凝胶电泳是一种快速和灵敏的方法,其示出了改变pBR322中的DNA迁移率当与化合物这种分子相互作用。该质粒具有两个天然形式,超螺旋(I型)和圆形(表格Io)的。药物相互作用可以切割质粒,产生切口(形式II)或线性形式(形式III),并且在极端情况下,产生的碎片。这些裂解事件改变琼脂糖凝胶电泳迁移曲线。过渡金属配合物已经被报道抑制DNA修复酶[43,44]。图3显示了质粒具有以不同摩尔比(RI)的化合物孵育后的迁移。在添加的游离磷杂环配体并没有导致在圆形和超螺旋形式的变化,所以不存在与DNA中的[45,46]很少或没有相互作用,而与C1-3在复合物中,观察到与圆形相对应的条带降解(Ri=4),这可归因于与DNA螺旋的相互作用[47]。当将这些结果与参考药物顺铂的结果进行比较时,C1-3复合物和DNA是明显的。
图3:显示pBR322 DNA裂解的琼脂糖凝胶在37°C孵育18h,不同浓度的化合物。第1道Ri=1,第2道Ri=2,第3道Ri=3,第4道Ri=4,其中Ri=[化合物]/[DNA]摩尔比。
分光光度法滴定-插层药物与DNA螺旋的结合已通过吸收光谱滴定作为添加DNA的函数进行了经典表征[42]。因此,确定DNA与药物之间是否存在任何相互作用的简单方法是检查化合物的带移[48]。由于芳香族发色团与DNA碱基对之间存在强烈的堆叠作用,通过插层作用与DNA结合的复合物通常会导致低色性和深色性[42]。化合物C的吸收光谱3.在存在DNA的情况下,如图4所示。一般来说,所有化合物的吸收谱带都会随着DNA浓度的增加而受到影响,并有向低致变色的趋势,这表明化合物通过较弱的相互作用(非共价)与CT-DNA结合。此外,Kb值(表1)表明,只有复合物C1与大分子的结合作用值较高[49,50]。
图4:[Au{1-phenyl-2,5-bis(2- thienyl)phosphole}Cl] (C3.与CT-DNA)。
复合 | 吸光度(±1海里) | Δλ(±1海里) | Kbx104.(M)-1) | Hyprochromism(%) |
L1 | 369 | 21 | 3.70±0,58岁 | 39±3 |
C1. | 390 | 11.94±0,97 | 11±2 | |
L2 | 369 | 0. | 2.46±0,58岁 | 23±2 |
C2. | 369 | 78年2.81±0 | 17±2 | |
L3 | 432 | 23 | 67年1.47±0 | 23±2 |
C3. | 455 | 1.62±0,47 | 20±1 |
表1:从DNA与化合物L相互作用的光谱滴定中获得的数据1-3和C1-3.
分布系数影响候选药物生物分布的一个重要物理化学性质是其亲脂性。在分子水平上,它提供了关于影响药物通过脂质结构运输的分子间和分子内力量的信息。因此,高亲脂性有利于药物通过细胞膜[51]的转运。更多的正对数P值对应更多的亲脂复合物,而更多的负对数P值对应更多的亲水复合物。此外,金属配合物对耐顺铂的人类癌细胞的细胞毒活性强烈依赖于其亲脂性[52]。我们发现所有化合物都是亲脂性的,即L3.(1.32)>C3.(1.30) > C1(1.29)>C2=L2(1.00)>L1(0.82)。此外,它们明显比顺铂(-2.21)、卡铂(-2.30)或奥沙利铂(-1.65)更亲脂,而顺铂具有抗肿瘤活性[52,53]。所有化合物的亲脂性均在最佳范围内(logp0.5 - 3.5),口服时应能从肠腔充分吸收进入血流[54]。以往对亲脂抗癌复合物的研究表明,它们可能通过穿透脂质膜发挥毒性,导致膜结构破坏,从而发挥细胞毒性作用[55-58]。
生长抑制和细胞毒性-这些化合物在代表不同来源肿瘤(前列腺、乳腺、肺、宫颈和结肠)的六个细胞系上进行了测试除了小鼠乳腺肿瘤细胞系外,我们还使用了SRB分析法,它比更常见的四氮唑分析法具有优势,因为它区分了细胞抑制效应(细胞增殖减少)和细胞毒性效应(活细胞数量减少).顺铂和transplatin(0.1-30µM)作为对照药物包括在内3.在15.1µM(GI50)和28.5µM(TGI)浓度下抑制MCF7细胞生长,在17µM以下对PC3细胞的总生长抑制,以及在28.7µM浓度下对后者细胞的细胞毒性作用。在表面上,C3.对PC3前列腺细胞系显示一定程度的“特异性”。然而,必须记住,抗癌药物通常只是“特异性的”,因为它们主要作用于细胞分裂。肿瘤细胞的分裂速度比正常细胞快,而PC3细胞在我们手中的分裂速度特别高,这也许可以解释我们获得的结果。C1和C2对细胞的生长或活力没有影响,但C1对PC3和HT29细胞生长的影响(GI50分别为26.4和17.5µM)。虽然对DNA的亲脂性和亲和力是药物作用的重要因素,但还有其他因素,如与靶以外的其他分子的相互作用、溶解度、细胞内运输等,可能解释了C的不同活性1和C3.尽管它们的P值相似,C的亲和力更高1在试管中测量的DNA。
MCF7 | 生物 | A549 | 海拉 | HT29 | 4 t1 | |||||||||||||
化合物 | GI50 | TGI | LC50 | GI50 | TGI | LC50 | GI50 | TGI | LC50 | GI50 | TGI | LC50 | GI50 | TGI | LC50 | GI50 | TGI | LC50 |
C1. | > 30 | > 30 | > 30 | 26.4 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | 17.5 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 |
C2. | > 30 | > 30 | > 30 | 24日,3 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 |
C3. | 15.1 | 28.5 | > 30 | 13.3 | 16.4 | 28.7 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 |
顺铂 | 0.2 | > 30 | > 30 | 0.7 | 20.9 | > 30 | 2.4 | 6.5 | 20.5 | 2.4 | 7.6 | 20. | 3.8 | 8.7 | 19.2 | 2.0 | 6.3 | 9.8 |
Transplatin | > 30 | > 30 | > 30 | 0,20 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 | > 30 |
表2:化合物对六种肿瘤细胞系的细胞抑制和细胞毒作用。在化合物存在下孵育48小时后,用硫代达明B显色法测定细胞活力。MCF7人乳腺癌,PC-3人前列腺癌,A459人肺癌,HeLa人宫颈癌,HT-29人结肠癌,4T1人小鼠乳腺癌,GI50 - 50%生长抑制,TGI -总生长抑制,LC50 - 50%细胞毒性。浓度在µM中表达。
Phosphole衍生品(左1-3)及其金(I)配合物(C1-3)这些化合物的合成是为了评估它们与DNA的相互作用以及抗癌药物的主要作用靶点。一般来说,我们发现,所有复合物的DNA相对粘度都可能由于DNA螺旋中的弯曲或扭结而降低。所有化合物都表现出弱相互作用(非共价)与DNA结合,裂解质粒pBR322的环状结构,并与生物分子弱相互作用1和C2对细胞生长和活力无影响,而C3.体外抑制人乳腺癌(MCF7)和人前列腺癌(PC3)癌细胞的生长。虽然亲油性和亲和力的DNA是药物作用的贡献者,还有其他,如与其他分子的相互作用除了目标,溶解度,细胞内的运输和其他可能占不同的活动的C1和C3细胞系,尽管他们相似的P值和C的高亲和力1在试管中测量的DNA。
我们感谢“Fondo Nacional de Ciencia Tecnología e Innovación de Venezuela”获得的财政支持(第5号项目)。贝聿铭2012 - 1054)。我们还要感谢来自Medicina Experimental, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas的Mercedes Fernández对电泳研究的帮助。
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文章类型:研究文章
引用:Alfonso Bueno S,Taylor P,Urdanibia I,Castro W,Otero Y(2018)研究金(I)-磷络合物与DNA的相互作用及其与生物活性的关系。医学化学药物杂志Des 1(1):dx.doi.org/10.16966/2578-9589.107
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