摘要

作品简介:新的植物DING蛋白(全长38kda p38SJ和27kda p27SJ)具有磷酸酶活性，并调节HIV-1基因的转录。此前，我们证实了DING通过去磷酸化和失活CTD RNA聚合酶II来调控HIV-1基因的转录，CTD RNA聚合酶II是HIV-1长末端重复序列(LTR)的主要延长因子。由于HIV-1的转录受多种病毒和细胞因子的控制，包括NF-κB的p65/p50亚基，我们假设除了RNA聚合酶II (RNAPII)的C-terminal Domain (CTD)外，DING磷酸酶也可以影响p65 NF-κB的磷酸化和活性。抑制HIV-1基因转录，抑制HIV-1感染。

方法:在这里，我们描述了DING蛋白抑制HIV-1感染和p65/p50 NF-κB磷酸化，通过ELISA和northern-blot检测、western-blot检测、细胞分离和启动子-报告细胞分析，使用pTet-on诱导系统。

结果:通过p24 ELISA和northern blot检测，发现DING蛋白对HIV-1和HIV-LTR RNA表达有较强的抑制作用。western blot和细胞分馏结果显示，在ding表达的细胞中，p65 NF-κB的低磷酸化水平增加。p65/p50的细胞核和细胞质均受DING磷酸酶的影响，但在DING存在的情况下，p65 NF-κB在细胞质中积累更多，表明DING影响了NF-κB的活化和核导入。在表达ding的细胞中，p65细胞核的大部分发生去磷酸化。启动子报告基因实验表明，通过ding介导的NF-κB p65去磷酸化和失调，抑制了其与HIV-1 LTR的结合，抑制了p65介导的LTR转录激活。对受DING影响的LTR区域的定位显示，NF-κB和CTD RNA聚合酶II结合位点都是重要的，这些细胞因子的协同性被DING降低。此外，对DING-p38SJ中影响LTR转录的区域进行了定位，发现磷酸酯结合区域对该抑制活性至关重要。

结论:我们已经证明了DING磷酸酶对HIV-1感染、p65 NF-κB磷酸化、我们的研究表明，DING调控HIV-1 LTR表达的一种可能机制可能是通过阻止转录因子NF-κB p65的磷酸化和转位到细胞核，并与HIV-1 LTR结合，从而导致NF-κB p65的失调。一种可能有助于DING p38SJ作为抗病毒药物的作用。重要的是，DING不仅在p65 NF-κB增加的情况下抑制HIV-1 LTR基因的转录，而且还抑制HIV-1感染。DING蛋白改善了已知抗逆转录病毒药物替诺福韦(Tenofovir, TFV)和恩曲他滨(FTS)对HIV-1的抑制作用，因为在与这些药物联合使用时;DNG与这些药物联合使用时，对HIV-1的抑制显著高于对照或未使用丁胺磷的病例。因此，我们的数据支持使用神经保护的DING蛋白作为新型抗病毒治疗药物，通过干扰NF-κB的功能来抑制HIV-1 LTR转录。

关键字

丁;hiv - 1;答;p65;p50;NF -κB

介绍

DING蛋白(p27SJ和p38SJ)是植物磷酸酶，从植物中分离得到贯叶连翘[1,2]。这些丁蛋白涉及神经保护[3,4]，细胞增殖[5,6]，抑制HIV-1 [1,2,7]。Ding P27SJ和P38SJ属于具有保守的DingG N末端区域的蛋白质的丁系。丁蛋白与动物，植物和原核生物分离，有些被称为磷酸酶或磷酸盐结合蛋白[8]。真核丁蛋白对HIV-1 LTR转录的作用已被密集地研究[9-17]。最近，确定来自系统源性不同物种的丁蛋白共享类似的序列和结构同源性，抑制HIV-1 LTR转录[18]。在先前的研究中，我们表明，通过抑制丝裂原激活的蛋白激酶ERK1 / 2磷酸化，DING P27SJ抑制其基质的磷酸化，STAT3 [5,6]。结果表明，在人类的HIV-1感染期间激活了控制促炎基因表达的NF-κB[19-22]。在PMA存在下，HIV-1 TAT蛋白也可以通过阻断抑制剂IκB-α阻遏物与NFκB复合物的结合来激活NF-κB[23]。此外，TAT蛋白可以与白细胞介素-6（IL-6）RNA结合，或与CAAT增强剂结合蛋白β（C-EBPβ）转录因子相互作用，以增加IL-6基因的表达[24]。 HIV Tat can interact with p65 NF-κB and increase its DNA-binding and transcriptional activity. Interaction of Tat with p65 and IκB-α can lead to NF-κB activation, and this mechanism can contribute to the dysregulation of the cellular response by HIV-1. The transcription of inflammatory response genes is regulated by NF-κB [25]. The NF-κB transcription factors include several proteins that contain Rel Homology Domain (RHD), such as RelA/p65, c-Rel, RelB, p50 and p52. RHD domain in 300-amino acid length is important for for homo- or hetero- dimerization, also for DNA-binding of NF-κB [26,27]. Dimerization is important for the transcriptional activity of NF-κB. Importantly, C-terminal transcriptional activation domains are present in p65 NF-κB [28]. When NF-κB associates with its inhibitors (IκB), this association affects its DNA-binding ability [29,30]. To activate NF-κB, IκB serine amino acids should be phosphorylated by the activated IκB Kinase (IKK). This causes the protein ubiquitination and degradation, and subsequent release and translocation of the functional NF-κB complex to the nucleus [31,32]. The most abundant NF-κB inhibitor is IκB-α [33-35]. I-κB is phosphorylated by IKK at serine residues, Ser32 and Ser36 [36,37]. The NF-κB activity can be further increased by PKA phosphorylation [38], or by PKCζ [39] and by IKKα [40]. NF-κB activation was shown in HIV-1-infected macrophages, monocytes, CD4 T lymphocytes and microglia [41]. Active NF-κB upregulates the expression of its responsive genes that include pro-inflammatory chemokines and cytokines [41]. Investigating the mechanisms of NF-κB or Tat inhibition could provide further insights into AIDS pathogenesis and treatment [42]. Viral HIV-1 Tat protein that interacts with the viral RNA and cellular factors can control viral replication [43-46]. To activate transcription, Tat usually binds to RNA stem-loop structures, including the HIV-1 transactivation-responsive element within the viral LTR. It alsointeracts with somecellular transcriptionfactors. Tat can be released from infected cells and bind to integrins to dysregulate the cell signaling [49], or to chemokine receptors [50,51]. Tat increases the p65 transcriptional activity and modulates other proteins that regulate NF-κB signaling. When Tat binds to IκB-α, it is translocated to the nucleus [52,53]. It is important to uncover mechanisms of the NF-κB suppression during HIV-1 infection, and to discover new agents that can efficiently inactivate NF-κB and HIV-1 transcription. Previously we demonstrated that DING p27SJ/p38SJ can suppress HIV-1 gene transcription through its interaction with HIV-1 Tat [1,7]. Further, we showed that DING p27SJ and p38SJ exhibit phosphatase activity [5]. Thus, here we investigated the possibility that DING proteins p27SJ and p38SJ can act通过p65 NFκB转录激活子的去磷酸化。在本研究中，我们报道了DING蛋白可以通过直接低磷酸化p65抑制细胞中的HIV-1感染和NF-κB复合物的激活，并下调LTR基因的转录活性。

材料和方法

外周血单个核细胞(PBMC)感染HIV-1

经Ficoll-Hypaque分离后，从泛白涂层制备纯化的PBMC，并在含有10% (v/v)胎牛血清(FBS)(含人重组IL-2 (20iu /ml))的改良RPMI培养基中维持，随后用植物血凝素(PHA;5μg / ml;(Sigma)。PBMC感染HIV-1 JRFL株。每10株加50 ng含p24的病毒原液⁶细胞。细胞与病毒原液在少量无血清培养基中37°C孵育2小时。用PBS洗涤细胞两次，然后加入新鲜培养基。在感染前，用DING表达质粒转染细胞或用50或250 ng的DING p38SJ处理细胞。每3天收集2 μl裂解液。同时，在HIV-1感染后6天制备对照未感染细胞或65℃加热灭活的HIV-1感染细胞10分钟。收集细胞和上清液，用ELISA、MTT和毒性试验进行分析，如下所述。如上所述，用嗜单核细胞/巨噬细胞SF162 HIV-1株感染PBMC细胞，并用裂解液进行p24酶联免疫吸附试验(p24感染效率约为200 ng/ml)。

U97首先用DING p38SJ表达质粒转染细胞，然后在转染24h后感染SF-162 HIV-1株，并在感染后第5天进行分析T细胞于感染后第7天进行分析。单核细胞和U1细胞被SF-162感染(相应的约300 pg/ml和15,000 pg的p24)。

用抗逆转录病毒药物治疗人胎儿小胶质细胞

将小胶质细胞置于60 mm培养皿(20万细胞)中，转染DING p38SJ、DING p27SJ或pCDNA6对照质粒。转染48小时后，细胞感染HIV-1 SF162株(0.25 pg的p24/细胞)4小时。加入更多培养基过夜孵育。次日PBS冲洗细胞三次，加入新鲜培养基，单独或联合替诺福韦(TFV)和恩曲他滨(FTC)抗病毒药物10 μM孵育。56小时后，重复处理，然后收获上清液并加入新鲜培养基，根据制造商的方案(Advanced Bioscience Laboratories, Rockville, MD)进行p24 ELISA。

p24 ELISA

大约1 × 10⁶PBMC感染HIV-1 JF-RL或SF-162株。感染后6 - 7天，收集上清，使用p24 ELISA试剂盒(Advanced Bioscience Laboratories, Rockville, MD)对是否存在HIV-1 p24进行ELISA分析。在450nm比色法测定样品中Gag-p24的浓度。在3个重复中测量HIV1 p24的浓度。数据由HIV1 p24标准曲线计算并归一化样品稀释。数值用图表表示(均值±标准差，n=9)。每次感染至少重复3次，每个样本3个重复。

细胞培养

western-blot研究在强力霉素作用下表达DING p27SJ的U-87 MG诱导细胞系。高效转染的U-87 MG胶质母细胞瘤星形细胞瘤细胞购自美国型培养收集(ATCC, Manassas, VA)。细胞在含有10%胎牛血清(Life Technologies, Inc.)、100单位/ml青霉素和10 μg/ml链霉素的DMEM中培养，温度为37℃。根据pTetOn系统(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)，即我们之前描述的[1]，在U-87 MG中创建了DING-p27SJ诱导细胞系。1 mg/ml多西环素(Dox)处理细胞48 h后，可诱导细胞的ing - p27sj表达。

质粒

通过PCR扩增HIV-LTR(-476/+66)，并将其连接到HIV-LTR上HindIII-KpnI位点pGL3载体(Promega Corp.， Madison, WI)[1]。克隆了CFP-tat质粒BamHI-EcoRI tat片段从CMV-tat进入BglII-EcoRIpECFP-C1质粒[1]。我们通过DNA测序验证了质粒的序列。寡核苷酸由Oligos Etc (Wilsonville OR)制造。

全长DING p38SJ cDNA的克隆

利用RT-PCR技术，从已知的DING p27SJ序列和假单胞菌DING基因的反向引物中设计正引物，克隆出DING p38SJ。将2个片段(1-788和788-1179)合并，获得编码38kda DING p38SJ(364个氨基酸，GenBank #: AAW57408.2)的全长cDNA。将DING p38SJ cDNA克隆到pcDNA6表达载体(Invitrogen)[2]中。

转染

根据制造商的建议，Lipofectamine 2000用于瞬态转染实验，使用的是U-87 MG细胞。简而言之，2 × 10⁵用0.5 μg的hiv - ltr -荧光素酶报告质粒，加入或不加入1 μg的DING-p38SJ及其缺失突变体CFP-Tat或pECFP-p65转染60 mm板细胞。实验用启动子、pCMV或pECFP-C1质粒进行控制，以使每个样本中的DNA数量相等。在转染后36小时收集细胞提取物，在转染后36小时收集细胞提取物用于荧光素酶检测。样品分为3个重复。

RNA制备

从U-87 MG细胞或原代小胶质细胞中分离RNA，用DING p27SJ转染并感染HIV-1，使用RNAqueous®总RNA分离试剂盒(Ambion, Austin, TX, USA)。1 μg RNA用逆转录酶(Roche Molecular Biochemicals, IN)生成cDNA。采用28个PCR循环进行cDNA扩增TaqDNA聚合酶。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中进行DNA凝胶电泳。

rt - pcr

在RT-PCR检测中，一步RT-PCR系统(SuperScript III with Platinum .Taq， Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA，美国)。采用针对p65基因的引物，采用三步循环法扩增p65 cDNA: 1) 55℃预变性30分钟;2) PCR扩增15秒、94℃变性、60℃退火30秒、68℃延伸1分钟共40个循环;3)最后在68°C下延长5分钟。PCR产物、0.8 kb和0.2 kb DNA在1.5%琼脂糖凝胶中进行DNA凝胶电泳。

北部污点分析

从原代小胶质细胞中分离10µg总RNA，用1.2%、0.4%甲醛、1 × morpholinepro磺酸(Mops)的琼脂糖凝胶电泳分析。如前所述，RNA转移到Hybond-N尼龙膜(Amersham, Piscataway, NJ)[7,54]。为了检测HIV-1 LTR和DING p27SJ rna，将膜与[32P]标记的LTR DNA探针或DING p27SJ探针(800 bp)杂交。为了检测GAPDH RNA，我们用pcr扩增和[32P]标记的GAPDH RNA(一种用作内部控制片段的管家基因)来检测过滤器。使用随机引物DNA标记试剂盒(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)制备放射性标记DNA探针。使用MicroSpin™G-50色谱柱(Amersham)去除未合并的放射性核苷酸。内控基因为管家基因GAPDH。

细胞处理和转染

如上所述，对于转染试验，2 × 10⁵细胞在6 ×孔板中培养24小时。p65 NF-κB刺激后，在Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)处理(10 nM) 2小时之前，将细胞置于FBS游离培养基中2小时。

蛋白质提取物的制备

用冷PBS洗涤细胞并在裂解缓冲液中孵育，制备细胞裂解液(Sigma)。4°C离心5分钟后，去除细胞碎片，用Laemmli样品缓冲液在95°C下加热50 mg蛋白裂解液10分钟，然后用10% SDS-PAGE分离。

细胞核和细胞质的提取

使用NE-PER试剂盒(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)进行细胞分离，分离细胞核和细胞质蛋白组分。在含蛋白酶抑制剂鸡尾酒的NE‐PER裂解缓冲液中裂解细胞(Halt;皮尔斯生物技术)。采用Bradford assay (Bio-Rad)测定蛋白浓度，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAAG)电泳(SDS-PAGE)(4%-20%梯度凝胶;Bio-Rad)。

免疫印迹分析

蛋白样品以40 mAmps转移到支持的硝化纤维素膜上。详细的程序已在[1]之前描述过。为了可视化蛋白质，使用了增强化学发光检测系统，ECL+ (GE Healthcare, Piscataway NJ)。图1-4所示的Grb2水平和图5所示的Grb2和Lamin A作为凝胶加载的对照。

抗体

Anti-DING p27SJ和anti-p38SJ兔多克隆抗体由Lampire Biological Laboratories, Inc (Pipersville, PA)生产并购买。Anti-p65 (F-6)、Grb2和Lamin A抗体来自Santa Cruz biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA)。CFP-Tat (Living Colors)抗体来自BD Biosciences Clontech。使用Living Colors单克隆抗体(BD Biosciences Clontech)确认yfp融合蛋白的表达。AntiMyc-tag单克隆抗体来源于Invitrogen公司。

荧光素酶报告实验

U-87 MG诱导细胞在无或无表达Tat、p65 NF-κB质粒的情况下转染ltr -荧光素酶构建的细胞，然后与多西环素孵育24小时，观察DING p27SJ的表达。根据制造商的建议，使用双glotm荧光素酶分析系统(Promega)对每个反应等量进行荧光素酶活性检测。所有报告测定对每个样品至少进行3次重复。相对荧光素酶单位转化为折叠活性，并以图形显示。发光记录在Turner Designs Luminometer TD-20/20 (Promega)上。使用Excel软件进行数据分析。

Methylthiazoletetrazolium (MTT)测定

对于MTT细胞增殖实验，我们使用小胶质细胞和MTT试剂盒(Roche, Basel, Switzerland)。细胞被镀在96孔板上，每3个重复，以15000个细胞/孔的密度分3组。用DING p27SJ转染细胞。转染24 h后，在终浓度为0.5 mg/ml的孔中加入10 μl MTT (5 mg/ml)孵育4 h，加入100 μl的增溶液终止反应。具有活性线粒体的活细胞将四唑环裂解成可见的深蓝色福马赞反应产物，在570 nm和650 nm的参比波长下用酶标仪测定。每个样本的相对细胞活力(%对照)是由转染细胞的平均吸光度与未转染细胞或用空载体转染细胞的平均吸光度之比确定的。

的CellTiter-Glo^™发光细胞活力测定

这种检测需要ATP，一种荧光素酶反应的辅助因子，作为代谢活性细胞的指标。由于荧光素酶反应需要ATP，因此产生的发光与ATP含量成正比，这是细胞代谢活动的一个指标。为了进行实验，加入CellTiter-Glo™试剂(Promega, Madison, WI, USA)，其体积相当于培养液的数量。混合2分钟和孵育10分钟后，用平板读数特纳设计发光仪TD-20/20 (Promega)测量发射的发光。使用Excel软件进行数据分析。

统计分析

统计分析使用SPSS (IBM公司，2017年发布)，IBM SPSS Statistics for Windows, Version 25.0。Armonk, NY)， EXCEL和ImageJ。在相关的情况下，使用学生t检验与Bonferroni校正进行多重比较。p<0.05为差异有统计学意义。数据导出到Microsoft EXCEL进行进一步统计分析。

p值的计算基于学生对每个对照组中的每个样本的三重复值(归一化到内部控制)的t检验，以及三重复实验中的2-3个测试组的比较。使用的p值计算是基于参数的，不配对的，两样本等方差，双尾分布-一种在科学文献中广泛接受的方法。两组在每个两两比较必须包含至少3个样本为软件计算p值的比较。

结果

本研究旨在通过DIV-1抑制通过DIV-1抑制和DIV-1，P65的灭活来解开HIV-1抑制的机制，P65强制转移到细胞质，并抑制与HIV-1 LTR的p65结合。首先，我们研究了Ding是否抑制细胞中HIV-1感染。

DING p27SJ和DING p38SJ抑制HIV-1感染

调查如果丁蛋白质抑制hiv - 1复制在几个人类细胞类型,综合使用PBMC感染进行了化验,U937(只有少数人之一仍然表达了许多喜欢的单核细胞特征行),初级小胶质细胞、t细胞,单核细胞,和U1 promonocytic细胞两个感染hiv - 1菌株,JR-FL和SF-162(图1)。在HIV1感染前，首次用全长DING p38SJ转染U937和t细胞。在感染后的第5天或第7天，在U937和t细胞中，DING对HIV-1感染均有强烈的抑制作用，这由HIV-p24水平证实(图1A)。当使用生物相关浓度的DING p38SJ孵育时，我们发现在单核细胞和单核前(U1)细胞中对HIV-1复制有类似的抑制作用。用50 ng/ml的DING蛋白处理细胞，对U1的抑制率高达50%，而用200 ng/ml处理细胞，对U1的抑制率高达80%，对单核细胞的抑制率高达50%，如图1B所示。在两种浓度的DING蛋白处理的PBMC中，也观察到DING p38SJ对HIV-1的抑制(图1C)。图1C的下面板显示了两次独立重复实验的结果。DING p27SJ也能抑制小胶质细胞中的HIV-1 SF-162株(图1D)。与仅转染空质粒的细胞相比，转染DING的原代小胶质细胞中HIV-LTR RNA表达被抑制，northern blot检测(图1D，左图)和密度测定(右上图)显示，显示高达70%的LTR抑制。

图1:DING抑制HIV-1感染和复制。
ELISA检测DING p38SJ和DING p27SJ对U937、t细胞(A)、单核细胞(B)和PBMC (C)中HIV-1的抑制作用。在两个独立的实验中，用嗜单核细胞/巨噬细胞SF162 HIV-1菌株感染PBMC细胞，并在三个重复中测量HIV-1 p24浓度，从HIV-1 p24标准曲线中插值并校正样品稀释。数值用图表表示(均值±标准差，n=3)

图1:DING抑制HIV-1感染和复制。
(D)DING对小胶质细胞HIV-1感染的抑制作用。通过northern blot分析显示，DING p27SJ在人胎儿小胶质细胞中抑制HIV-1 SF-162(左图)。用DING p27SJ质粒转染人原代小胶质细胞，然后感染HIV-1 SF162株。5天后，制备HIV-1感染细胞的总RNA，并使用来自HIV-1基因组、DING p27SJ和管家GAPDH(左图)的DNA探针进行northern blot分析。在变性甲醛琼脂糖凝胶上分离总RNA，与标记的LTR、DING p27SJ和GAPDH探针杂交。下面的面板显示了RNA制备的完整性。标记了18S和28S rna在凝胶中的位置。DING p27SJ对p65 NF-κB基因转录和延伸的影响(右下图)。质粒的示意图，携带p65基因，在CMV启动子的控制下与yfp基因在框架内融合，用于转录延伸研究。RT-PCR扩增所用引物的位点指定为两个扩增子的位置。 Inhibitory effect of DING on p65 and YFP transcription/elongation was studied in RT-PCR assays for two amplicons. The image of the ethidium bromide-stained gel was inverted using Adobe Photoshop for clarity of presentation. The longer is transcript (compare lane 3 with lane 1) and the further is a primer from transcription initiation start, the stronger is inhibitory effect of DING on elongation of the transcript (compare lanes 4 and 3, with 2 and 1). Bottom panel demonstrates a graphical representation of the elongation assay as bars (bottom panel). Level of yfp-p65 RNA expression and integrity and accuracy of RNA loading was examined by agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining of RNA gel for RNA samples from cells without (lanes 1 to 4) or with DING (lanes 5 to 8), transfected with p65 and Tat in various combinations. The image of the gel was inverted using Adobe Photoshop for clarity of presentation.

图1:DING抑制HIV-1感染和复制。
(E)细胞活力检测显示p27SJ在原代培养的小胶质细胞中增殖/毒性，转染CMV-p27SJ或对照空载体pCDNA6。48小时后，收集细胞，用细胞活力GLO法(上)和MTT法(下)检测。结果表明，通过GLO和MTT检测，DING p27SJ的表达对小胶质细胞原代培养的活力无明显影响。数据收集自3个独立实验的3个重复样本。误差条代表标准差。(F)转染DING p38SJ或载体pCDNA-C1的人胎儿小胶质细胞HIV-1 p24 ELISA。转染48小时后，用HIV-1 SF162株(0.25 pg的p24/cell)感染细胞4小时，然后加入培养基过夜孵育，然后单独或联合10 mM替诺福韦(TFV)和恩曲他滨(FTC)抗病毒药物治疗。56小时后，重复治疗，进行p24酶联免疫吸附试验。hiv - 1的水平p24(1)从116 pg / ml下降到39.11 pg / ml的丁p38SJ(2),而这两种药物治疗p24水平降至30.66 pg / ml(3)。治疗的细胞和丁这两种药物导致的p24水平明显降低30.66 pg / ml 16.51 pg / ml (4),提示联合用药可有效抑制HIV-1。 Data were collected from 3 independent experiments with triplicates for each sample. Error bars are for SD.

因此，DING抑制HIV-1的复制和LTR基因的表达/转录。为了证明DING是否能同时抑制LTR激活因子p65-NF-κB的表达，我们进行了转录延伸实验。

DING p27SJ对p65基因转录和延伸的影响。

采用RT-PCR方法研究了DING对p65 NF-κB转录/延伸的抑制作用(图1D，右下角)。在CMV启动子控制下，p65基因与yfp基因在框架内融合，用于转录延伸研究的质粒示意图如图所示。规定了拉伸试验中使用的底漆。凝胶中显示的条带定量显示，DING p27SJ的抑制作用与反向引物的位置有关，最靠近的(p65-1)有轻微的抑制作用(12%)，较远的(p65-2)有较强的抑制作用(75%)。数字显示在图表上。我们推测DING p27SJ也可以抑制YFP-p65的转录伸长。延伸实验结果表明，转录产物越长(比较3号线和1号线)，转录起始起始处的引物越长，DING对转录产物延伸的抑制作用越强(比较4号线和3号线，2和1)。RNA装载的完整性和准确性在RNA凝胶中得到了证明，来自带有(5至8巷)或没有DING(1至4巷)的细胞，用不同组合的p65和Tat转染RNA样本。重要的是，DING蛋白对细胞没有任何毒性作用，细胞活力GLO和MTT检测证实(图1E)，这表明其有潜力开发成一种安全的抑制HIV-1的治疗药物。进一步，我们比较了DING与两种已知的抗病毒药物替诺福韦(Tenofovir, TFV)和恩曲他滨(FTC)对HIV-1的抑制作用，发现两种药物与DING蛋白联合使用时都能更有效地抑制HIV-1复制(图1F)。 The level of HIV-1 p24 dropped from 116 pg/ml (bar 1) to 39.11 pg/ml in the presence of DING p38SJ (bar 2), while a treatment with both drugs dropped p24 level to 30.66 pg/ ml (bar 3). Treatment of cells with DING and both drugs lead to a significant decrease of p24 level from 30.66 pg/ml to 16.51 pg/ml (bar 4), suggesting an efficient suppression of HIV-1 by combinatory drug use. Data were collected from 3 independent experiments with triplicates for each sample. Error bars are for SD.

接下来，我们研究了p65 NF-κB转录因子的转录后修饰和磷酸化是否可以被DING磷酸酶抑制。

DING p27SJ抑制p65磷酸化。

为了研究p65 NF-κB的磷酸化是否受DING p27SJ的磷酸酶活性的影响，我们使用了一种在多西环素处理下表达DING的诱导细胞系，DING p27SJ诱导细胞。首先用p65和Tat表达质粒单独或联合转染细胞。然后用强力霉素或未用强力霉素处理细胞，诱导DING p27SJ表达，并收集细胞裂解液进行western blot分析。在无Tat或Tat存在的情况下，研究了在dox诱导的DING p27SJ细胞中，DING蛋白对内源性或外源性p65 NF-κB功能的影响。如图2A所示，DING蛋白的共表达影响了外源性p65 NF-κB蛋白的表达水平(对比图1A lanes 3和7)。通过HIV-1 Tat蛋白的共表达，可以缓解DING介导的p65 NF-κB表达的阻滞(图2A, lanes 4和8)。而内生p65 NF -κB的表达不受丁或答蛋白质的存在(图2,车道5 & 6)。相比之下,endo和外生的磷酸化p65 NF -κB蛋白被叮的存在和无法获救的乙(图2中,车道5 - 8)。western blot的结果通过密度测定法得到证实(图2B)， western-blot检测使用多克隆抗p65抗体证实了p65在细胞中的表达(图2C, lane 2)。Grb2蛋白(图2C，底图)作为凝胶加载对照。每个面板的底部都显示了条带的密度测量。实验重复2次，每次计算3次。误差棒显示本实验SD结果明确提示DING蛋白阻断了p65 NF-κB的磷酸化，使其在生物学上失活。

图2:DING p27SJ抑制p65磷酸化。
(一)Western blot分析多西环素(Dox+， lanes 5-8)和不含DING p27SJ (Dox-， lanes 1-4)诱导的DING p27SJ表达细胞提取物。为了检测Tat和/或DING p27SJ表达细胞中p65的磷酸化情况，我们将外源Tat或p65 NF-κB表达质粒转染或不转染DING p27SJ诱导细胞。使用超磷酸化或总p65 NF-κB(图1-3)、Tat和DING p27SJ(图4)的抗体对细胞提取物进行western blot。显示不同暴露时间的blot图像(图2-3)。Grb2作为加载控制。
(B)通过密度仪分析外源性和内源性p65的高磷酸化和低磷酸化水平，以%表示。误差条显示三个读数的SD。实验重复2次。
(C)Western blot分析Dox处理或未处理的细胞提取物诱导DING p27SJ。通过western-blot检测p27SJ细胞内源性p65 NF-κB和DING蛋白表达。Grb2作为装载控制。图表上的误差条显示了三个读数的标准差。

DING p27SJ存在下NF-κB p50的去磷酸化

图1的印迹用于抗p50抗体的再印迹。表达DING蛋白的提取物的Western-blot数据显示，DING对NF-κB异源二聚体中p65伴侣p50具有类似的抑制作用(图3,5-8列，上图)。箭头表示p50的低磷酸化形式。我们发现，在DING表达的细胞中，p50和p65的磷酸化受到了类似的抑制，而在DING p27SJ表达的细胞中，p50的磷酸化程度更低。

图3:DING p27SJ对NF-κB p50去磷酸化的影响。
表达DING p27SJ的提取物的Western-blot分析显示，NFκB异源二聚体中p50、p65伴侣的去磷酸化模式相似(lanes 5-8，上图)。Grb2作为加载控件(底部面板)。双箭头(顶部面板)显示p50高度磷酸化和低磷酸化。下图显示了低磷酸化p50的密度测定。误差条代表三个读数的标准差。

DING使NF-κB复合体失活是I-κB独立的

NF-κB二聚体的p50/p65亚基与I-κBα蛋白复合物在细胞质中分离，当细胞激活时，p50/p65 NF-κB从复合物中分离。为了确定p65 NF-κB的下调是否受其与I-κBα的关联影响，我们对DING p27SJ细胞暴露于多西环素和Tat共表达后p50/p65 NF-κB的表达和磷酸化进行了western blot分析。western blot检测结果显示，各系统中IκB蛋白水平一致，这些数据表明，在有DING蛋白表达的细胞中，p65/p50 NF-κB的去磷酸化和失活并不依赖于I-κBα，磷酸化NF-κB蛋白水平的降低与DING蛋白的表达呈正相关(图4，第4和8列，上图)。虽然-κBα表示上级的p65 NF -κB(图4中,车道3、4和7、8),它是由丁稳定和逆转Tat-associated I -ακB抑制(图4中,通道2和6)。此外,一个额外的脱去磷酸的形式我κB只发现在DING-expressing细胞转染答和p65,而去磷酸化的IκB在Dox-细胞中未见(图4,lanes 4和8)。

图4:DING p27SJ对NF-κB复合体的去磷酸化是I-κB独立的。
Western blot检测表明，在DING表达细胞中，p65/p50 NF-κB的去磷酸化和失活与i κ b α无关，NF-κB水平的剧烈变化(2^nd和3^{理查德·道金斯}图)不受I-κBα表达的影响(图4和图8)。NF-κB p65的变化与DING的表达有关。当p65存在时，I-κBα表达水平更高(第3、4和7、8条线)，而DING更稳定，并逆转tat相关的I-κBα抑制(第2和6条线)。上图显示I-κBα水平。第二幅图显示p65(包括外源性YFP-p65或内源性p65)和Tat水平。第三个面板显示了作为加载控制的Grb2水平。箭头指向高磷酸化和低磷酸化的p65。下图显示强力霉素诱导的p27SJ。误差条表示3个读数的标准差。

DING干扰NF-κB核转运

随后，我们观察了在强力霉素或未处理的情况下，DING-p27SJ细胞中p50/p65 NF-κB二聚体的区隔化。在激活DING蛋白表达后，将细胞分成细胞核和细胞质区隔并进行western blot分析。细胞分馏实验表明，DING-p27SJ的存在影响了p65/p50 NF-κB从细胞质向细胞核的转运。我们观察到，在DING p27sj表达的细胞中，p50 NF-κB蛋白(图5A, 1 - 4 lanes与5 - 8相比)和p65 NF-κB蛋白(lanes 3和4相比于7和8)在细胞质中的积累要远远高于核。未表达DING蛋白的细胞(Dox- cells)的胞质和细胞核部分显示Tat独立于p65 NF-κ b蛋白的核转位，这表明在DING表达细胞中，HIV-1可能与DING的功能相矛盾(图5A, lanes 9-16)。在表达DING p27sj的细胞的细胞核中，去磷酸化的p65更强烈地被检测到(将7和8巷与15和16巷进行比较，上图)。p65 NF-κB抑制剂，I-κBα，在DING p27sj阳性细胞的细胞质中积累更多(比较lanes 3,4和lanes 11,12)。有趣的是，结果表明，核中的I-κBα诱导NF-κB从核[55]转位到细胞质。I-κB通过将NF-kappa B以非活性形式保留在细胞质中，紧密调节其转录活性。我们的数据表明，在DING表达的细胞中，I-κB的核表达可导致p65失活和转位到细胞质中，并且在DING对NF-κB的影响中起次要作用。

接下来，我们研究了除了DING p27SJ外，全长DING p38SJ是否也会对p65从细胞质转位到细胞核产生类似的干扰作用，以及PMA刺激NF-κB是否会出现这种影响。

图5:DING干扰NF-κB转运。
(一)DING 27SJ阻断p65 NF-κB向细胞核的转运。通过细胞分裂和western-blot实验验证了DING p27SJ对p65/p50从细胞质转位到细胞核的影响。板1和2显示细胞质多核p65积累丁(阿霉素+)细胞(通道1到4与5 - 8)。面板5显示了类似的强烈的细胞质的本地化p50(通道1到4与5 - 8)。p65 overexpressing细胞(车道3和4和7和8)和乙overexpressing细胞(面板3,在DING p27sj表达细胞(1-8)中，车道2和4与车道6和8相比较。在Dox-细胞中，这种作用并不剧烈(通道9-16)。在表达DING p27sj的细胞的细胞核中，去磷酸化的p65更强烈地被检测到(将7和8巷与15和16巷进行比较，上图)。图4显示p65抑制剂IκBα在DING p27sj阳性细胞的细胞质中有更多的积累(对比lanes 3、4和lanes 11、12)，尽管在细胞核中也有。图6展示了细胞质Grb2(1-4线和9-12线)和核层蛋白A(5-8线和13-16线)片段的加载控制。
(B)DING p38SJ对pma诱导的NF-κB p65活化及其入核的影响Western blot检测转染全长DING p38SJ并经PMA诱导的细胞的细胞质和细胞核裂解物。在DING p38sj表达的细胞中，p65的细胞质积累增加(lanes 3和4与lanes 1和2相比)。在缺乏DING蛋白的细胞核中发现更多的pma诱导的p65。误差条代表3个独立读数的标准差。

DING p38SJ对pma诱导的NFκB p65活化及其入核的影响

在转染了DING p38SJ并被PMA诱导的细胞的细胞质和细胞核裂解液中进行细胞分馏，发现在DING p38SJ表达的细胞中，p65的细胞质积累更多(图5B, 3和4巷，与1和2巷相比)。pmained p65在仅用空载体转染的对照细胞的细胞核中检测更强烈(图5B，对比第6巷和第8巷，上图)。因此，当PMA诱导p65转位进入细胞核时，DING蛋白逆转PMA对p65的作用，使得更多的p65留在细胞质中。

DING p38SJ需要NF-κB和RPII来抑制LTR

我们使用启动子-报告荧光素酶技术鉴定了HIV-LTR基因的ding响应区域，使用LTR缺失突变体包含C/EBPβ(-118/-104)、NF-κB、RNA Pol II和TAR结合域。使用LTR-荧光素酶报告质粒和DING p38SJ表达细胞研究了DING p38SJ磷酸酶对HIV-1 LTR及其缺失突变体转录活性的影响(图6A)。在本实验中，缺失Tat结合位点(TAR区域，+22/+54)和RPII(+23)但仍包含NF-κB p65(-104/-80)的LTR缺失突变体(-117/+3)的转录活性仅被抑制40倍，而缺失NF-κB(-84/+66缺失突变体)的启动子活性被强烈抑制1000倍。部分NF-κ b缺失(-94/+66)可抑制LTR活性6倍(第1列)。在DING p38SJ存在时，包含NF-κ b结合位点的每种情况下，LTR活性分别受到300倍和200倍的抑制(第3列，raw 1-3)。对于部分缺失NF-κ b位点(-94/+66)或完全缺失NF-κ b位点(-82/+66)的LTR突变体，DING p38SJ的抑制分别为20倍和6倍(列3，原始4-5)。当RPII和焦油地区都删除,但NFκB在场(-117 / + 3),有大约5倍LTR抑制丁p38SJ(第2列,生6)。我们认为丁p38SJ抑制hiv - 1的转录活动的LTR包含绑定网站细胞转录激活物p65 NF -κB和RPII,以及病毒HIV-1 Tat结合位点(TAR)。由此可见，DING p38SJ对HIV-1 LTR转录具有较强的抑制作用。

图6:(A) DING同时需要NF-κB和RPII来抑制LTR。
DING通过NF-κB(-103/-80)、RPII结合域和TAR区域抑制LTR转录，在启动子/报告基因的转录中观察到。HIV-1 LTR缺失突变体分别在NF-κB(-103/-80)、C/EBPβ(-118/-104)、RPII(+23)和TAR(+22/+54)区域进行转录检测。使用U-87MG细胞中构建的HIV-1 LTR荧光素酶报告基因检测DING p38SJ对HIV-1 LTR启动子活性的影响。上图展示了HIV-1 LTR结构及其序列内病毒和细胞转录因子的重要结合域的示意图:LTR缺失突变体(-117/+3)，同时缺失Tat结合位点(TAR)和RPII，但仍包括NF-κB p65(-104/-80)、NF-κB缺失(-84/+66)、部分缺失NF-κB位点(-94/+66)或完全缺失NF-κB位点(-82/+66)。下图为荧光素酶检测中DING对HIV-LTR缺失突变体的影响。LTR转录的抑制呈折叠状。每一列的数字归一化到列1顶部原始的对照(1倍，或100%)，即没有DING p38SJ的HIV-LTR基因全长。第1列显示LTR突变体的Fold suppression, SD(第2列)。第3列显示DING对LTR的抑制，SD(第4列)。p值显示在第5列。
(B)DING p38SJ的n端含有磷酸结合域，对于抑制p65相关的LTR转录激活具有重要作用。DING p38SJ缺失突变体的示意图(上)。使用不同的DING p38SJ缺失突变体，通过启动子/报告子法研究了DING p38SJ对NF-κB相关LTR激活的影响(下)。LTR转录的抑制呈折叠状。每一列的数字都归一化到控制(1倍，或100%)。错误条显示SD。实验重复3次，样本相同。

我们的结果表明，在启动子报告基因检测中，DING通过NF-κB、RPII结合位点和TAR区域抑制LTR转录(图6A)。

DING p38SJ内含有磷酸盐结合域的n端区域对于抑制p65相关的LTR转录激活非常重要

在表达p38SJ缺失突变体的细胞中，通过启动子/报告基因检测，研究了DING p38SJ及其缺失突变体对NF-κB和LTR激活的影响(图6B)。全长DING p38SJ和DING缺失突变体的示意图如图6B(上图)所示。数字(折叠激活)如图6B所示。利用DING缺失突变体进行启动子报告基因分析的结果表明，DING p38SJ的n端含有磷酸盐结合域，对p65相关的LTR转录激活具有重要的抑制作用。

讨论和结论

DING抑制HIV-1和p65 NF-κB磷酸化是控制HIV-1感染和HIVLTR转录激活的重要事件。2006年首次克隆出DING p27SJ, 2011年克隆出DING p38SJ全长贯叶连翘(基因库:AAW57408.1)[1, 2]。DING p27SJ蛋白是DING蛋白家族的成员，具有4个保守的n端DINGG序列。DING蛋白还含有磷酸结合结构域，部分与碱性磷酸酶有关。DING蛋白在包括病毒感染[8]在内的人类疾病中起着非常重要的作用。

我们在这里证明了DING p27SJ和DING p38SJ对NF-κB的p65亚基(内源性和外源性表达)的抑制作用。其机制似乎是NF-κB的去磷酸化，并参与核细胞质易位。重要的是，p65辅助因子，p50也被DING去磷酸化。这一结果与之前发表的数据一致，表明在1G5细胞中，经外源人类DING蛋白[56]处理后，p65-和p50-NF-κ b的磷酸化形式被耗尽。目前的研究提供了额外的信息，表明DING p27SJ使NF-κB复合体失活的机制是I-κB独立的。我们的数据显示，NF-κB水平的急剧变化不是受到I-κBα表达的影响，而是受到DING蛋白的存在的影响。有趣的是，我们发现I-κBα也在细胞核中，这一结果与Laín de Lera T等人之前发表的数据一致，他们证明了I-κBα在人外周血T淋巴细胞[57]的细胞核中表达。目前的模型解释了I-κBα的抑制能力是通过在细胞质中保留Rel/NF-κB蛋白介导的。

此外，在细胞核中也发现I-κBα， I-κBα的核部分比胞质I-κBα[57]更稳定。有趣的是，核I-κBα并不能抑制NF-κB与DNA的结合。此外，I-κB以活性形式存在于静息和pma激活的人PBL的核中，并不能抑制NF-κB与DNA[57]的结合。此外，核中I-κBα的存在可导致NF-κB从核转位到细胞质[55]。I-κBα，通过在细胞质中以非活性的形式定位，可以调节NF-κB的转录活性，但如果在细胞核中表达，它可以破坏NF-κB/DNA结合，甚至使NF-κB转位回细胞质。因此，抑制NF-κB /DNA结合和I-κBα的核输出是控制NF-κB依赖基因表达的重要机制之一。

在DING表达的细胞中，p65和p50 NF-κB形式在细胞质中积累较多，而I-κBα在细胞核中积累较多，这可能是抑制NF-κB p65亚基的机制之一。此外，DING蛋白影响pma诱导的NF-κB p65的活化及其转位入核。同样，在表达ding的细胞中观察到更多的p65的胞质积累。我们认为，由于细胞核中没有足够数量的该蛋白启动HIV-LTR基因的转录，因此，通过ding介导的p65/p50 NF-κB核易位的干扰可以解释抑制HIV-1 LTR激活的现象。有趣的是，延伸实验结果表明，转录起始起始处的引物越长，DING对p65转录延伸的抑制作用越强。我们发现，DING需要NF-κB和RPII结合域来抑制LTR。有趣的是，DING的n端区域包含一个磷酸盐结合域，对于抑制p65相关的LTR转录激活非常重要。综上所述，DING蛋白具有磷酸酶活性，抑制p65 NF-κB的磷酸化、核转位和活化，并强烈抑制HIV-1的复制。最近发表的数据表明，NF-κB因子在SARSCOV-2、MERS、SARS-COV-1等病毒的发病机制中发挥重要作用[58,59]。因此，使用DING蛋白作为治疗手段不仅可以抑制HIV-1，还可以抑制其他病毒，如SARS-COV-2。 In the absence of current specific treatments for COVID-19, the DING based therapeutic strategies can be developed to treat these diseases as an alternative to the vaccine prevention to end the epidemic.

确认

我们要感谢Shriners医院儿科研究中心和神经科学部门的成员，Dr. Loriann Mullen, Aureen Baksh的支持和深刻的讨论。我们感谢卡迈勒·卡利利博士(天普大学神经科学系)对启动研究的支持。我们还要感谢Yuri Popov博士(亚美尼亚埃里温州立大学生物系)为我们实验室分离p38SJ蛋白提供了起始材料，以及Mikael Elias博士(明尼苏达大学生物技术研究所生物化学、分子生物学和生物物理系)提供了宝贵的建议。这项工作得到了美国国立卫生研究院(NIH) Shohreh Amini博士和宾夕法尼亚州国务院(项目10:420491-04400-02)Nune Darbinian博士的资助。

的利益冲突

两位作者宣称没有相互竞争的经济利益。

参考文献

1. Darbinian-Sarkissian N, Darbinyan A, Otte J, Radhakrishnan S, Sawaya BE, et al.(2006)第27页^SJ它是圣约翰草中的一种新型蛋白质，可以抑制HIV-1基因的表达。基因13:288-295。［Ref。］
2. Darbinian N, Gomberg R, Mullen L, Garcia S, White MK, et al. (2011) DING磷酸酶抑制HIV-1转录伸长。J Cell Biochem 112: 225-232。［Ref。］
3. Amini S, Merabova N, Khalili K, Darbinian N (2009) p38^SJ，一种新的丁格蛋白保护神经元细胞免受酒精诱导的损伤和死亡。J Cell physiology 221: 499-504。［Ref。］
4. Darbinian N, Khalili K, Amini S (2014) pDING对HIV-1 Tat反应的神经保护活性。中国生物医学工程杂志。［Ref。］
5. Darbinian N, Czernik M, Darbinyan A, Elias M, Chabriere E, et al. (2009) p27磷酸酶活性的证据^SJ以及它对细胞周期的影响。细胞生物学杂志107:400-407。［Ref。］
6. Bookland MJ, Darbinian N, Weaver M, Amini S, Khalili K (2012) DING蛋白对恶性胶质母细胞瘤的生长抑制作用。J Neurooncol 107: 247-256。［Ref。］
7. Darbinian N, Popov Y, Khalili K, Amini S(2008)通过p27SJ抑制HIV-1表达的双向蛋白转导系统的建立。抗病毒研究79:136-141。［Ref。］
8. Berna A, Bernier F, Chabriere E, Perera T, Scott K (2008) DING蛋白;原核磷酸盐结合蛋白超家族的新成员，延伸到真核生物界。Int J Biochem Cell Biol 40: 170-175。［Ref。］
9. Collombet JM, Elias M, Gotthard G, Four E, Renault F, et al.(2010)真核DING蛋白是内源性的:小鼠组织的免疫组织学研究。PLoS One 5: e9099。［Ref。］
10. Berna A, Bernier F, Chabriere E, Elias M, Scott K, et al.(2009)丧钟为谁而鸣?DING蛋白在健康和疾病中的作用。中国生物医学工程学报22(6):591 - 598。［Ref。］
11. Diemer H, Elias M, Renault F, Rochu D, Contreras-Martel C, et al.(2008)串联使用x射线晶体学和质谱从头计算获得人类38-kDa载脂蛋白HPBP的完整和准确的氨基酸序列。蛋白质71:1708 - 1720。［Ref。］
12. Elias M, Liebschner D, Gotthard G, Chabriere E (2011) DING蛋白家族的结构观察和从头测序。J同步辐射18:45-49。［Ref。］
13. Lesner A, Shilpi R, Ivanova A, Gawinowicz MA, Lesniak J, et al.(2009)人类DING蛋白家族新成员X-DING-CD4的鉴定，由HIV-1耐药CD4(+) T细胞分泌，具有抗病毒活性。中国生物化学学报(英文版)。［Ref。］
14. Cherrier T, Elias M, Jeudy A, Gotthard G, Le Douce V, et al.(2011)人磷酸盐结合蛋白抑制HIV-1基因转录和复制。病毒J 8: 352。［Ref。］
15. Renault F, Chabriere E, Andrieu JP, Dublet B, Masson P, et al.(2006)利用羟基磷灰石层析技术串联纯化人血浆中两种hdl相关的伙伴蛋白:对氧磷酶(PON1)和磷酸盐结合蛋白(HPBP)。生物医学生命科学836:15-21。［Ref。］
16. Morales R, Berna A, Carpentier P, Contreras-Martel C, Renault F, et al.(2007)人类载脂蛋白的发现和晶体结构。安制药Fr 65: 98-107。［Ref。］
17. Liebschner D, Elias M, Moniot S, Fournier B, Scott K, et al.(2009)通过亚埃x射线晶体学揭示DING蛋白的磷酸盐结合模式。J Am Chem Soc 131: 7879-7886。［Ref。］
18. Sachdeva R, Darbinian N, Khalili K, Amini S, Gonzalez D, et al.(2013)来自不同物种的DING蛋白具有高度的序列和结构同源性，以及HIV-1 LTR启动子的阻断转录。PLoS One 8: e69623。［Ref。］
19. (2009) NF-kappaB激活HIV-1的结构基础——一个与HIV-1 LTR结合的p50: RelA的高阶复合物。中华分子生物学杂志393:98-112。［Ref。］
20. 邓磊，曾强，王敏，程安，贾锐，等。(2018)NF-κB活性的抑制:一种病毒免疫逃避机制。病毒10:409。［Ref。］
21. Rice AP (2017) HIV-1 Tat蛋白:HIV-1治疗策略的作用机制和靶点。Curr Pharm Des 23: 4098-4102。［Ref。］
22. (2002) NF-κB信号通路:通往马德里的许多道路。细胞111:615 - 619。［Ref。］
23. fuume G, Vecchio E, De Laurentiis A, Trimboli F, Palmieri C, et al. (2012) Human immunodeficiency virus-1 Tat通过与IκB-α和p65的物理作用激活NF-κB。核酸Res 40: 3548- 3562。［Ref。］
24. Ambrosino C, Ruocco MR, Chen X, Mallardo M, Baudi F，等(1997)HIV-1 Tat通过与IL6 leader RNA结合和与CAAT增强结合蛋白beta (NF-IL6)转录因子相互作用诱导il -6基因的表达。中国生物化学(英文版):14883-14892。［Ref。］
25. Ghosh S, Hayden MS(2008)炎症中NF-kappaB的新调节因子。Nat Rev Immunol 8,837 -848。［Ref。］
26. Christian F, Smith EL, Carmody RJ (2016) NF-κB亚基的磷酸化调控。细胞。5:12。［Ref。］
27. Wang M, Yang W, Chen Y, Wang J, Tan J, et al. (2018) cell RelB与Tat交互作用并增强HIV-1表达。Retrovirology 15: 65。［Ref。］
28. Vallabhapurapu S，Karin M（2009）免疫系统中NFKappab转录因子的调节和功能。Annu Rev Immunol 27：693-733。［Ref。］
29. 李强(2002)NF-kappaB在免疫系统中的调节作用。Nat Rev Immunol 2:725 -734。［Ref。］
30. (2014) IκB分子对tat介导的HIV-1 LTR转激活的不同作用。病毒学216:284-287。［Ref。］
31. Hu Y Y, Baud V, Delhase M, Zhang P, Deerinck T, et al.(1999)缺乏IκB激酶IKKalpha亚基的小鼠形态发生异常但IKK激活完整。科学284:316 - 320。［Ref。］
32. Häcker H, Karin M (2006) IKK及IKK相关激酶的调控与功能。Sci STKE 17: re13。［Ref。］
33. Haskill S, Beg AA, Tompkins SM, Morris JS, Yurochko AD, et al.(1991)黏附单核细胞中诱导的一种即时早期基因的特性，该基因编码I kappa b样活性。细胞65:1281 - 1289。［Ref。］
34. Sun SC, Ganchi PA, Ballard DW, Greene WC (1993) NF-kappa B控制抑制剂I kappa B α的表达:诱导自调节途径的证据。科学259:1912 - 1915。［Ref。］
35. Hoffmann A, Levchenko A, Scott ML, Baltimore D (2002) IkappaBNF- kappaB信号模块:时间控制和选择性基因激活。科学298:1241 - 1245。［Ref。］
36. Brown K, Gerstberger S, Carlson L, Franzoso G, Siebenlist U(1995)通过位点特异性的信号诱导磷酸化调控I kappa b - α蛋白水解。科学267:1485 - 1488。［Ref。］
37. Li Q, Van Antwerp D, Mercurio F, Lee KF, Verma IM(1999)缺乏IκB激酶2基因的小鼠严重肝变性。科学284:321 - 325。［Ref。］
38. Zhong H, Voll RE, Ghosh S (1998) PKA对NF-kappa B p65的磷酸化通过促进与共激活因子CBP/p300的新型二价相互作用来刺激转录活性。Mol Cel 1:661 - 671。［Ref。］
39. Duran A, diaze - meco MT, Moscat J (2003) zeta PKC介导的RelA Ser311磷酸化在NF-kappaB转录激活中的重要作用。Embo j 22: 3910-3918。［Ref。］
40. O’mahony AM, Montano M, Van Beneden K, Chen LF, Greene WC(2004)人类t细胞淋巴细胞病毒1型诱导生物活性NF-kappaB需要IkappaB激酶1介导的RelA/p65磷酸化。J Biol Chem 279: 18137-18145。［Ref。］
41. Hiscott J, Kwon H, Genin P(2001)恶意收购:NF-kappaB通路的病毒侵占。J clinj Invest 107: 143-151。［Ref。］
42. Jin H, Li D, Lin MH, Li L, Harrich D(2020)基于纹身的辅助治疗HIV-1功能治愈。病毒12:415。［Ref。］
43. (2003)一种新型RNA聚合酶II c -末端结构域磷酸酶在丝氨酸5中优先去磷酸化。J Biol Chem 278: 26078-26085。［Ref。］
44. 斯托维尔·丹(2006)《HIV分子》。［Ref。］
45. panano S, Carloni P (2005) HIV-1 Tat变异的比较分析。蛋白58:638 - 643。［Ref。］
46. Chapman RD, Heidemann M, Albert TK, Mailhammer R, Flatley A, et al.(2007)转录RNA聚合酶II在CTD残基丝氨酸-7位点磷酸化。科学318:1780 - 1782。［Ref。］
47. Berkhout B, Silverman RH, Jeang KT (1989) Tat反式通过新生RNA靶标激活人类免疫缺陷病毒。细胞59:273 - 282。［Ref。］
48. 陈志强，陈志强(2005)HIV-1 TAR RNA:病毒与宿主分子相互作用的靶标。Curr HIV Res 3: 61-71。［Ref。］
49. Barillari G, Sgadari C, Fiorelli V, Samaniego F, Colombini S, et al.(1999)人类免疫缺陷病毒- 1型Tat蛋白通过与α5β1和αvβ3整合素结合并动员隔离的碱性成纤维细胞生长因子来促进血管细胞的生长和运动。血94:663 - 672。［Ref。］
50. Demarchi F, d’adda di Fagagna F, Falaschi A, Giacca M(1996)人类免疫缺陷病毒1型Tat蛋白激活转录因子NF-kappaB。J病毒70:4427-4437。［Ref。］
51. Buonaguro L, Buonaguro FM, Giraldo G, Ensoli B(1994)人类免疫缺陷病毒1型Tat蛋白通过tar样结构转激活肿瘤坏死因子基因表达。J病毒68:2677-2682。［Ref。］
52. Puca A, fuume G, Palmieri C, Trimboli F, Olimpico F, et al. (2007) IkappaB-alpha通过促进HIV-1 Tat转激活子的核输出来抑制其转录活性。J Biol Chem 282: 37146-37157。［Ref。］
53. Vitagliano L, fuume G, Scognamiglio PL, Doti N, Cannavo R, et al. (2011) i κ b - α /HIV-1 Tat相互作用的结构和功能研究。Biochimie 93: 1592 - 1600。［Ref。］
54. Ausubel F, Brent R, Kingston R, Moore D, Seidman JG等(1989)分子生物学的当前协议。约翰·威利父子公司，纽约，美国。［Ref。］
55. Arenzana-Seisdedos F, Turpin P, Rodriguez M, Thomas D, Hay RT, et al. (1997) I kappa B α的核定位促进NF-kappa B从核到细胞质的主动运输。中国细胞科学(英文版)［Ref。］
56. 人类X-DING-CD4通过新的旁分泌样信号介导对HIV-1感染的耐药性。二月j 282: 937-950。［Ref。］
57. Laín de Lera T, Folgueira L, Martín AG, Dargemont C, Pedraza MA, et al. (1999) ikappab在人外周血T淋巴细胞细胞核中的表达。致癌基因18:1581 - 1588。［Ref。］
58. Mahase E (2020) COVID-19:正在研究哪些治疗方法?BMJ 368: m1252。［Ref。］
59. 郭艳荣，陈庆东，洪忠思，唐元阳，陈守登，等。(2020)2019冠状病毒病(COVID-19)疫情来源、传播及临床治疗进展。Mil Med Res 7:11。［Ref。］

在此下载临时PDF

条信息

文章类型:研究文章

引用:Darbinian N, Darbinyan A, Merabova N, Gomberg R, Chabriere E, et al. (2020) DING蛋白通过抑制NF-κB p65磷酸化来抑制HIV-1基因的转录。J HIV艾滋病6(1):dx.doi.org/10.16966/2380-5536.175

版权:©2020 Darbinian N，等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

收到日期:2020年7月31日

接受日期:2020年8月28日

发表日期:2020年8月31日,