摘要

在动物模型中，人体组织纤溶酶原激活物信号肽(tPA-SP)与多种蛋白质的连接增强了抗体和细胞免疫反应的诱导。在此，作为提高HIV-1疫苗免疫原性的持续努力的一部分，我们试图确定添加优化的tPA-SP是否能提高表达HIV-1蛋白组高度保守区域的hiv - conv蛋白的疫苗诱导的T细胞的数量和功能。以质粒DNA、非复制型猿(黑猩猩)腺病毒ChAdV63和非复制型痘病毒MVA为载体制备hiv病毒感染疫苗。我们发现，添加tPA-SP可提高所有测试疫苗的细胞内hiv conv蛋白水平。当肌肉注射给BALB/c小鼠时，观察到疫苗诱导t细胞的DNA模式频率增加了2- 3.5倍，然而，当使用更有效的ChAdV63启动- mva增强异体方案时，没有一致的显著改善。我们的结果与之前的DNA研究一致，并强调tPA-SP的免疫增强可能是免疫原、疫苗方式、免疫反应类型和物种特异性的。因此，对于每种疫苗策略，应分别评估tPA-SP诱导所需免疫应答的效果。

关键字

HIV-1疫苗免疫原性、hiv - conv疫苗、人组织纤溶酶原激活物信号肽(tPA-SP)

介绍

提高免疫原性和随后的疫苗疗效是一个挑战。为了成功诱导细胞介导的免疫应答，应有效地产生病原体衍生的肽并递送至MHC等级和II类限制途径[1,2]。由于MHC I类和II类之间肽载荷的亚细胞定位的差异，将免疫原靶向细胞质和ER中可能导致CD8的增强⁺和CD4⁺分别t细胞反应。此外，引导病原体来源的蛋白分泌可以改善抗体诱导和交叉提呈，从而诱导T细胞[3,4]。因此，有意操纵免疫原胞内运输以提高疫苗性能是一个积极的研究领域。

组织纤溶酶原激活物信号肽(tissue plasminogen activator signal peptide, tPA-SP)是哺乳动物细胞中提高重组蛋白表达水平最常用的异体先导序列之一[5-12]。当与蛋白质n端偶联时，它引导新生的氨基酸链进入内质网和细胞分泌途径[5,13- 15]。此外，tPA-SP切割信号的修饰有助于其有效去除，并加速载体新生多肽折叠成功能蛋白[16]。虽然并非对所有偶联蛋白都有益[7,14]，但tPA-SP与疫苗免疫原的融合增强了抗体[5,9,15,17]和细胞介导的[9,11,18]应答的诱导，延长了免疫记忆[5,15]，并在模型感染中保护了病原体[5,8,9,15,19]。

我们正在开发针对HIV-1的候选疫苗，侧重于CD8⁺t细胞对HIV-1蛋白[20]高度保守区域的反应。这些在大多数HIV-1变异中是共享的，它们的突变通常与复制成本有关[21-24]，但在自然感染中包含典型的亚显性表位。在临床前研究[20,25-34]之后，在hiv -1阴性和阳性的欧洲和非洲成人中，提供hiv - conv免疫原的疫苗已经进入了8个临床试验，在最具免疫原性的方案中，保守区域特异性T细胞的诱导频率达到了每百万循环PBMCs 3-5.5万个细胞之间的中位数峰值[35-38]。在这些研究中，hiv - con免疫原的基因编码由质粒DNA、非复制猿(黑猩猩)腺病毒chadv63和非复制痘病毒修饰的牛痘病毒Ankara (MVA)载体，没有前导肽。因为我们还不知道有效的T细胞的频率，这对于保护人类对抗HIV-1是必要的[39,40]，我们的目标是提高疫苗的性能。在本研究中，为了了解未来的发展，我们调查了hiv病毒感染疫苗的t细胞诱导是否受益于tPA-SP与hiv病毒感染免疫原的连接。

材料和方法

疫苗的构建和制备

hiv - conv[20]和thivconv[25]疫苗的设计、构建和制备已在前面进行了描述。免疫时，在大肠杆菌DH5α中产生质粒DNA，用enfree plasmid Giga kit (Qiagen)分离，-20℃保存至使用。重组chad -63疫苗在HEK 293细胞悬浮培养中培养，层析纯化，滴度，-80℃保存至使用。重组MVA疫苗在原代鸡胚成纤维细胞中生长，经两次CsCl缓冲离心纯化，滴度，-80°C保存至使用。

Immunofluorescent染色

在6孔板上培养的HEK 293T细胞转染2.5µg的pSG2。tHIVconsv或pSG2。根据制造商的规格，使用Lipofectamine 3000 (Invitrogen)的hiv conv质粒DNA。对于感染，在37℃，5% CO无血清DMEM培养基中，用表达hivconv或thivconv蛋白的重组MVA或ChAdV63感染HEK 293T细胞，多重感染(MOI)分别为5和10₂为2小时。然后用PBS洗涤细胞，在完全DMEM培养基(10% FCS和1%青霉素/链霉素)中进一步孵育24小时，用冰冷PBS洗涤并固定10分钟。用含有4%甲醛的10%中性缓冲福尔马林溶液(Sigma)放在冰上。固定细胞在室温下孵育20分钟，PBS洗涤，0.2% Triton (TX-100)渗透5分钟，再次洗涤，PBS中1%牛血清白蛋白(BSA)阻断30分钟。使用抗pk (Abcam)、抗calnexin (BD Bioscience)和抗cd63 mAb (BD Bioscience)单克隆抗体。细胞洗3次，15分钟。用Vectashield DAPI核染色载体(载体实验室)将细胞固定在显微镜载玻片上，然后在荧光显微镜(徕卡DMI 3000B)上检查。

脉冲追踪分析

dna转染细胞的代谢标记[³⁵以前曾报道过蛋氨酸。简单地说，如上所述，将HEK 293T细胞瞬时转染DNA。18小时后，用无蛋氨酸最低必需培养基替换生长培养基30分钟，然后加入含75µCi (2.7 MBq)的新鲜培养基[³⁵S]蛋氨酸毫升^－１．标记15分钟后，细胞在含有未标记蛋氨酸的培养基中进一步培养不同时间，并在含有Nonidet P-40、100 mM碘乙酰胺和蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液中裂解。

免疫沉淀和SDS-PAGE

用免疫沉淀和SDS-PAGE分析细胞裂解液，如前所述[41]。简单地说，细胞裂解液用抗pk -tag mAb (Abcam)和蛋白A - Sepharose在4°C过夜进行免疫沉淀。细胞成球，球被洗涤，在SDS样品缓冲液中重悬，在95℃下加热5分钟，然后在10%丙烯酰胺还原凝胶上进行SDS- page。

小鼠，免疫和脾细胞的制备

5 ~ 6周龄雌性BALB/c小鼠组。所有疫苗均在全身麻醉下肌注100µg DNA, 10µg DNA⁶重组MVA和3×10的斑块形成单位（PFU）⁸重组ChAdV63。处死当日，取脾脏，用尼龙细胞滤器(BD Falcon)，用5ml注射器橡胶柱塞分别按压器官分离细胞。用RBC Lysing Buffer hybrim - max (Sigma)去除红细胞后，在R10 (RPMI 1640中添加10% FCS、青霉素/链霉素和β-巯基乙醇)中清洗并重新悬浮脾细胞，进行ELISPOT、细胞因子染色(ICS)等检测。

道德声明

所有的动物程序和护理都严格遵守英国内政部1986年动物(科学程序)法案的指导方针。德赢vwin首页网址该方案得到了当地研究伦理委员会(牛津大学临床医学)的批准。实验是根据项目牌照编号为。30/2833由TH持有，并严格执行替换、减少和改进(3Rs)原则。

肽和肽库

通过质谱分析，所有肽的纯度至少为80% (Ana Spec, San Jose, CA, USA)，在DMSO (Sigma-Aldrich)中溶解，生成10 mg/ml的库存，并在-80°C保存。199个hivconv衍生的多肽(15/11)被分为6个32 - 35个单独多肽池，用于ICS和ELISPOT检测。肽的最终浓度为1.5µg/ml。

IFN-γELISPOT测定

使用Mouse IFN-γ ELISPOT kit (Mabtech)按照厂家说明书进行ELISPOT检测。采用生物素结合的二级抗ifn -γ单抗(R4-6A2，大鼠IgG1)、碱性磷酸酶和显色底物(Bio-Rad)的顺序应用来观察斑点，并使用AID ELISpot Reader系统(Autoimmun Diagnostika)进行计数。IFN-γ产生细胞无肽频率低于40 SFU/10⁶并从肽刺激培养的细胞中减去。

细胞内细胞因子染色

在37°C, 5% CO条件下，用肽或肽池刺激100万个细胞₂处理90 min后，再加入GolgiStop (BD bioscience)。如果需要，在刺激开始时加入CD107a-FITC抗体。孵育5小时后，用FACS缓冲液(PBS, 1% FCS, 0.01%叠氮)洗涤细胞，用抗cd16 /32抗体(eBioscience)在4℃阻断20分钟，然后用抗cd8和抗cd4单抗染色(eBioscience)。然后使用Cytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences)清洗和渗透细胞，并对细胞内细胞因子进行染色:抗tnf -α、抗ifn -γ和抗il -2 mAb (eBioscience)。细胞用Cell Fix (BD Biosciences)清洗固定，然后用LSRII (BD)流式细胞仪采集细胞，用Flowjo (Tree Star)和SPICE软件分析。

体外杀试验

将相同数量的P815细胞按照厂家的规格，分别用800 nM或32 nM的CFSE进行差异标记。用800 nM CFSE标记的P815细胞用多肽脉冲2小时，洗涤多次。上述方法制备免疫小鼠脾细胞，与cfsel标靶P815细胞以效应靶比(E:T) 10:1或5:1混合，37℃孵育过夜。细胞被清洗，用活/死标记进行染色，并用流式细胞仪进行分析。细胞毒性计算公式如下:特异性裂解% =100 ×(非脉冲对照细胞数-肽脉冲细胞数)/非脉冲对照细胞数。

统计分析

使用曲线垫棱镜第5版进行统计分析。假设T细胞应答是非高斯分布的，因此结果呈现为中位数（范围）。使用Kruskal-Wallis测试进行多种比较。使用双尾Mann-Whitney U测试进行比较具有相同体外重新捕获的组。P值<0.05被认为是显着的。

结果

DNA转染后，tPA-SP与hiv conv融合可增加蛋白表达，但不会增加半衰期

hivconv免疫原的806-氨基酸长序列[20]发表。将tPA 22P/ a突变信号序列(MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSAR)[16]的DNA序列编码连接到hivconv开放阅读框(ORF)的5 '端，表达thivconv(图1A)。特别是22P/ a突变的tPA-SP将在信号肽酶转位到内质网的过程中被有效的共译去除[25,42]。对于DNA疫苗模式，我们首先使用显微镜来评估瞬时转染的HEK 293t细胞中hiv conv蛋白的亚细胞定位，或者更准确地说，它的c端Pk标签[43]，并且是相对于ER伴侣蛋白calnexin和晚期核内体/溶酶体标记CD63进行的。免疫荧光分析显示，与表达未修饰的hiv conv的细胞相比，转染了thivconv的细胞染色更亮，并提示Pk标签与被tPASP增强的钙联素ER共定位，而未到达晚期内质体/溶酶体间隔(图1B)。流式细胞术分析发现，转染pSG2后，HEK 293T细胞Pk标签阳性的频率更高。thivconv相对于pSG2。结果表明，tpa - sp修饰的hiv - conv疫苗的荧光强度更高，这再次表明tpa - sp修饰的hiv - conv的表达更高(图1C)。在pSG2之后，未降解的hiv conv蛋白的细胞内半衰期被发现是相似的。HIVconsv pSG2。在脉冲追逐实验中转染thivconv，后者在0、0.5和1小时蛋白水平略有升高(图1D)。总的来说，这些数据表明，在DNA传递之后，在转染的HEK 293T细胞的ER中添加tPA-SP可以增加hiv conv蛋白的积累。

图1:来自pSG2的hiv感染免疫原的表达。HIVconsv pSG2。tHIVconsv DNA疫苗。(A) hiv conv和tpa - sp融合的thivconv免疫原示意图。将t细胞表位H和mAb Pk标签粘贴到hiv conv的c端，以促进[20]的临床前开发。保守区域上方的字母表示该分支，使用了该分支的共识，下面的条形图描述了肽池P1-P6覆盖的免疫原区域。(B) hivconv蛋白的亚细胞定位(Pk标签)。用pSG2转染hek293t细胞。HIVconsv pSG2。tHIVconsv dna疫苗。两天后，细胞与针对Pk标签(顶部红色，底部绿色)、calnexinas ER标记(绿色)和CD63作为晚期核内体/溶酶体标记(红色)的嗜铬原偶联单克隆抗体一起孵育，以描述hivconv免疫原的亚细胞定位。 DAPI was used to visualize the nuclei (blue). Cells were photographed using laser scanning confocal microscopy.Bar, 20 µm. (C) Two days after DNA transfection, HEK 293T cells were lifted from the plates and incubated with FITC-conjugated anti-Pk mAb to detect HIVconsv expression. Percentages of HIVconsvexpressing cells (left) and their MFI (right) were determined using flow cytometry (see Figure 3 for a representative gating). Data are shown as mean ± SEM (n=3). (D) Analysis of the HIVconsv protein half-life in HEK 293T cells transfected with either pSG2.HIVconsv or pSG2. tHIVconsv DNA vaccines. After metabolic labeling with [³⁵S]蛋氨酸，细胞用冷蛋氨酸追逐，达到放射自显影的指示时间，细胞裂解液用抗pk单抗免疫沉淀分析，10% SDS-PAGE和放射自显影。

tpa - sp修饰改善了DNA疫苗诱导t细胞的能力

研究tPA-SP对BALB/c小鼠t细胞免疫原性的影响⁺首先用H-2染色细胞内IFN-γ分析T细胞^d免疫优势肽H (RGPGRAFVTI;Env残基311-320)将[44]添加到hivconv[20]的c端，用于临床前开发(图1A)。pSG2免疫。thivconv DNA诱导h特异性CD8增加2- 3.5倍⁺T细胞相对于未排出的PSG2.hivconsv疫苗，这对D达到了统计学意义（P=0.01) and DD (P=0.02)方案(图2A)。在单独的免疫中，我们评估了诱导的T细胞的广度和特异性。小鼠接受DDD方案和每一个pSG2。tHIVconsv pSG2。在IFN-γ ELISPOT检测[45]中，通过对6个库P1-P6(32-35重叠的15-mer多肽)的应答来枚举hivconv组。P2、P4和P6对pSG2的反应范围为448-1055和128-415点形成单位(SFU)/106个脾细胞。tHIVconsv pSG2。分别为hiv - conv疫苗，修饰的thivconv诱导的频率明显更高(图2B)。此外，有75 SFU/106脾脏细胞特异性的P1是由thivconv诱导的，而不是由hiv conv传递。对ICS中h -特异性T细胞产生IFN-γ、TNF-α和IL-2产生和脱颗粒(CD107a)的分析检测到两个群体的多功能和tpa -sp整体免疫原性增强与IFN-γ ELISPOT检测一致(图2C)。在单独的DDD疫苗接种中，这次使用pSG2。HIVconsv pSG2。tHIVconsv and pSG2.HIVconsv+pSG2. HIVconsv (half-doses), immune splenocytes were tested against all 199 individual peptides across HIVconsv, reasoning that different subcellular localization of the HIVconsv protein may lead to differential epitope processing and presentation, and using the unmodified and tPA-SPcoupled immunogens together may benefit the overall breadth of response. Thus, the strongest responses among clusters of adjacent overlapping 15-mers were detected to peptides 15, 42, 112 and 197 (containing the H epitope). There was a hint of differential processing with HIVconsv inducing stronger responses to peptide 112 compared to 42, while the tHIVconsv immunogen elicited higher frequencies of T cells to peptide 42 relative to 112, while mixed HIVconsv+tHIVconsv delivery induced equal peptide 42 and 112 frequencies. However, Kruskal-Wallis test did not find the three sets of T-cell frequencies induced by different immunogens and their combination significantly different (Pd = 0.19)(图2)。

图2:tPA-SP可增强hiv病毒的免疫原性，用于质粒DNA传递。(A)用pSG2免疫BALB/c小鼠。hivconv(暗)或pSG2。每7周间隔1次(D)、2次(DD)或3次(DDD)，末次免疫后2周处死。CD8⁺T细胞诱导在ICS测定中使用最佳H-2^d免疫优势肽H. (B)在单独的实验中，小鼠接受3个DNA免疫(DDD)使用pSG2。hivconv(暗)或pSG2。tHIVconsv(光)疫苗。他们的hiv conv特异性T细胞在IFN-γ ELISPOT检测中被枚举，使用6个肽池P1-P6的15-mer多肽与跨越整个hiv conv蛋白的11个氨基酸重叠(图1A)。(C)免疫脾细胞使用多色流式细胞术分析IFN-γ， TNF-α，表达hivconv(暗)和thivconv(亮)的疫苗诱导的h -特异性T细胞百分比，右边显示T细胞的多功能。请参见图4E以了解一个代表性的门控策略。(A-C)中的数据是减去无肽背景作为中位数(四分位范围)后显示的(n=5)。同样的在体外使用双尾Mann-Whitney U检验比较H-或池特异性T细胞的hiv conv和thivconv诱导频率，其中星号表示P< 0.05。(D) BALB/c小鼠组分别给予3个剂量的pSG2。pSG2 HIVconsv(上)。thivconv(中)或半剂量混合pSG2. hivconv +pSG2。上图所示的thivconv(下)及其汇集的hiv conv特异性脾细胞被枚举为199个单独的15-mers多肽(仅在井中显示有斑点的多肽)(n=3)。虚线表示积极响应的任意阈值(至少50 SFU/106以上的背景)。采用Kruskal-Wallis检验比较未修饰和tpa - sp偶联免疫原及其联合诱导的三组t细胞频率(P= 0.19)。

带有和不带有从病毒载体表达的tPASP的hiv conv表达的不同模式

我们临床传递t细胞免疫原策略的核心是猴腺病毒启动和MVA增强。因此，将hiv conv和thivconv免疫原的编码基因工程到这两个载体中，疫苗命名为ChAdV63。HIVconsv ChAdV63。tHIVconsv MVA。HIVconsv MVA.tHIVconsv。与DNA疫苗相似，使用Pk特异性mAb进行免疫荧光验证Pk标签的表达。在使用病毒载体时，tPA-SP疫苗的胞质泡状结构中荧光的积累更为明显(图3A)。在流式细胞术中，tPA-SP对重组ChAdV63-和mva感染细胞中hiv conv表达的影响不同。而MVA感染的细胞数量较高。hivconv比mvathivconv表达Pk标签，且MFI略高，这些参数被倒置，有利于thivconv传递重组ChAdV63感染(图3B)。对两种病毒的多个时间点和多重感染进行了检测，并选择感染后24小时作为表达水平和由于细胞病变效应而失去粘附的细胞之间的最佳折衷(未显示)。 Thus at least at this time point, the effect of tPA-SP addition on the HIVconsv expression differed for the poxvirus and adenovirus vectors.

图3：MVA和chad -63疫苗中不含或含tPA-SP的hiv conv的表达(A)在以痘病毒-(MOI 5)或腺病毒-(MOI 10)为载体的疫苗感染HEK 293T细胞24小时后，使用fitc标记的抗pk标签mAb(绿色)和共聚焦显微镜观察未修饰和tPA-SP表达的hiv conv的亚细胞定位。DAPI定位细胞核(蓝色)。酒吧,20µm。(B)感染后1天，将HEK 293T细胞与fitc偶联的抗pk单抗孵育，利用图中所示的门控(左图)，用流式细胞仪测定hiv conv表达细胞的百分比及其MFI(右图)。数据显示为平均值±SEM (n=3)。

tPA-SP对ChAdV63-MVA方案(CM)诱导t细胞的弱负作用

为了评估tPA-SP对ChAdV63-MVA方案诱导hiv - conv特异性T细胞的影响，将编码hiv - conv或thivconv免疫原的ChAdV63和MVA疫苗依次免疫BALB/c小鼠(图4A)。IFN-γ ELISPOT分析采用hiv conv肽池P1-P6检测到，通过添加tPASP, t细胞频率减少了2倍。响应幅度的下降仅在P2池(P<0.01)和P5 (P< 0.03)(图4 b)。多肽刺激的t细胞频率总体呈相似趋势，其中多肽42 (P=0.007)和112 (P< 0.001)(图4)。对于免疫优势肽42,112和H，例体外通过杀伤试验来确定tPA-SP是否能提高CD8⁺t细胞对肽脉冲靶细胞的溶解活性。虽然在效应靶比10:1时检测到强裂解，中位杀伤介于44%和77%之间，但统计上仅检测到肽H更强的杀伤，这有利于未修饰的hiv conv免疫原(图4D)。接下来，我们评估了在CM方案中加入tPA-SP是否影响了CD8对IFN-γ、TNF-α和IL-2的表达⁺T细胞。对于肽112特异性CD8检测到大约2倍的显着降低⁺TPA-SP附件在TPA-SP附件之后产生IFN-γ，TNF-α和IL-2的T细胞仅对IL-2产生的肽H显着差异，并且对任何功能发现肽42的差异（图4E）。因此，对于CM方案，TPA-SP除了艾滋病毒杆菌的补充弱一些表位的T细胞诱导。

图4：chad - mva (CM)方案中添加tPA-SP对hiv感染免疫原性的弱负作用。(一)免疫计划。(B) BALB/c小鼠用表达未修饰(暗)或tPA-SP-linked(光)hivconv免疫原的重组ChAdV63和MVA疫苗免疫。使用6个肽池P1-P6 (B)和选定的个人15-mer刺激肽和肽H (C)，通过IFN-γ ELISPOT检测tPA-SP对hiv conv免疫原性的影响(n=5+5;集合了2个实验)。(D)在效应靶比为10:1 (n=5)时，评估相同的脾细胞裂解P815靶细胞的能力，脉冲时使用两种最具免疫优势的15肽和H肽。免疫CD8 (E)⁺采用多色流式细胞术分析T细胞在肽42、112和H刺激下产生IFN-γ、TNF-α、IL-2和脱颗粒(CD107a) (n=5)。对于所有的图表，数据都是在中位数(四分位数范围)减去背景后显示的。用相同的库/肽刺激检测到hiv conv和thivconv诱导的t细胞频率，使用双尾Mann-Whitney U试验进行比较。星号表示P< 0.05。

tPA-SP对DNA-DNADNA-ChAdV63-MVA方案(DDDCM)诱导t细胞的最小影响

接下来，通过重组载体CHadv63然后MVA（方案DDDCM;图5A），测定三个DNA灌注促进TPA-SP对T细胞免疫原性的影响。使用加速3周间隙与重组CHAFD63后的标准6周间隔，没有观察到接受患有THIVCONV的小鼠之间的IFN-γELISPOT测定测定的T细胞频率的显着差异，并未观察到接受HIVCONSV的小鼠之间的六个肽池（图5b）也不是单独测试的肽（图5c）。一个明显更强离体经thivconv感染的小鼠脾细胞对肽脉冲P815靶细胞的杀伤，仅检测到肽H (Pd = 0.029)(图5)。最后，使用IFN-γ ELISPOT和最近确定的最优肽LVGPTPVNI(15-肽42)和(YYDPSKDLI(15-肽112)[31]对DDD、CM和DDDCM方案进行了直接比较。而thivconv > hivconv DDD和DDDCM方案诱导的特异性T细胞频率总体趋势明显，CM方案中thivconv和thivconv < hivconv的反转趋势明显，只有少数比较达到了统计学意义，中位数差异小于2倍(图5E)。

图5:缺乏TPA-SP对DNA-DNA-DNA-CHADM-MVA（DDDCM）方案中的HIVCONSV诱导TPA-SP对T细胞诱导的一致效果。(一)免疫计划。（b）通过六个肽池在IFN-γELISPOT测定中，在IFN-γELISPOT测定中接受BALB / C小鼠的BALB / C小鼠的血清曲（暗）或THIVCONSV（LIVERCOSV特异性T细胞的频率P1-P6（B），个体响应15-MER肽和肽H（c）（n = 4）。（D）测试脾细胞，用于将P815靶细胞脉冲用两种最免疫素15-MEL肽和肽H在效应物到目标比例10：1（n = 5）中脉冲脉冲。（e）使用最佳长度肽（n = 3），在IFN-γELISPOT测定中获得DDD，CM或DDDCM方案中的一种DDD，CM或DDDCM方案和特异于三种最免疫原性表位的T细胞的引发频率。对于所有的图表，数据都是在中位数(四分位数范围)减去背景后显示的。使用双尾曼诺夫尼U试验进行比较患有相同池/肽重新刺激检测到的亨仑和毒性诱导的T细胞频率。星号表示P< 0.05。

讨论和结论

建设[20]以来,我们已经报道了高t细胞免疫原性的保守区域HIVconsv疫苗中演示了鼠标,非人类的灵长类动物和人类临床研究阶段I /花絮”,他们的政府引起的高频区相对于其他研究broadly-directed, plurifunctional CD8⁺t细胞反应(30-36 20、25、28日,38)。尽管如此，我们仍在继续寻找能够进一步改善疫苗性能的策略，以最大限度地提高对人类的疗效。在这里，我们评估了小鼠t细胞免疫原性的影响，引导hiv感染新生多肽进入ER和分泌途径，通过添加tPA-SP。所有三种测试疫苗pSG2。ChAdV63 tHIVconsv DNA。tHIVconsv和MVA。在thivconv中，我们检测到转染/感染人类细胞中的hiv conv蛋白水平增加，并在囊泡胞质结构中有较高的积累。而这种修饰使pSG2诱导的T细胞的频率增加了2- 3.5倍。而使用chadv63 . hivconv - mva进行更有效的传递则失去了这一优势。hivconv异源原激疗法。在免疫小鼠中未检测到hiv病毒特异性抗体的诱导(未显示)。

我们的结果与已发表的研究结果一致。与tPA-SP融合的免疫原蛋白表达和分泌增加，同时免疫反应增强，在某些情况下，保护效果增加[7-11,14,15,19,46-48]。所有这些阳性报告几乎都有两个共同的特点:他们使用了质粒DNA载体的疫苗，并且在小鼠模型中观察到了改进的疫苗性能，但Casimiro等人[49]也观察到了在猕猴中添加tPA-SP的好处。因此，无论疫苗接种是否会给人类带来好处，目前还不得而知。与病毒载体相比，质粒DNA具有不同的免疫原性，因此用DNA和痘病毒免疫会导致长期表位等级[29]的差异。此外，其他一些研究未能发现tPA-SP在诱导免疫应答方面的优势[14,46,50]。因此，添加tPA-SP的效果是免疫原特异性的，需要针对每种特定的免疫原、载体方式、方案和诱导的免疫应答类型进行检测和确认。

尽管tPA-SP是DNA疫苗普遍使用的信号肽，其他细胞伴侣也在研究中，以提高疫苗的性能。因此，最近有报道称，MHC Ii类相关不变链(Ii)与各种免疫原融合可提高CD8⁺t细胞的反应[]51号~ 53号。这种增强表现在腺病毒载体的疫苗上，可以从小鼠转译到非人灵长类动物，而传递不变链偶联丙型肝炎病毒衍生免疫原的疫苗目前正在进行人体试验。也包含lysosomalassociated lysosome-targeting序列的膜蛋白1 (LAMP-1) DNA plasmid-vectored疫苗被证明重定向免疫原从proteasomal-MHC类我向lysosomal-class II通路,导致显著增强疫苗的免疫原性在几个动物模型[15,54岁,55]。因此，亚细胞靶向策略仍然是提高疫苗效率的一个高度活跃的研究领域。

总的来说，这项研究表明，将tPA-SP与hiv conv免疫原连接可以提高其细胞内表达，但只有当thivconv通过“裸”DNA传递时，疫苗的性能才会受益。对于已经有效的ChAdV63-和mva介导的传递，添加tPA-SP并没有进一步增加t细胞诱导比未修饰的hiv conv实现的t细胞诱导更高。然而，将新生的hiv conv蛋白靶向到ER/分泌途径可能会转化为对疫苗生产细胞的低毒性，从而在生产过程中产生高疫苗产量，尽管后者仍有待证实。虽然我们的结论与已发表的其他dna载体疫苗的观察结果一致，但这里的主要创新之处在于全面比较了三种疫苗载体系统，并建立了我们独特的t细胞免疫原免疫原性的tPA-SP效应。总的来说，来自该研究和其他研究的现有证据表明，如果不确定特定的免疫原、表达方式、所需免疫反应类型和预期物种，就不能假设tPA-SP增强疫苗的免疫原性。

确认

这项工作是由英国医学研究理事会(MRC G1001757 to T.H.)和英国国际发展部(DFID)根据MRC/DFID协约共同资助的。S.A.-J。由沙特阿拉伯王国高等教育部的阿卜杜拉国王奖学金资助。B.O.的部分资金来自国际艾滋病疫苗倡议，她的资金是在美国国际开发署(美援署)和其他捐助者的支持下获得的。国际艾滋病国际倡议捐助方的完整名单可在http://www.iavi.org上查询。T.H.是詹纳研究所调查员。我们也感谢国际艾滋病疫苗倡议提供了hiv conv多肽。

两位作者没有相互竞争的利益。

参考

1. Crotzer VL, Blum JS(2008)免疫监测过程中细胞溶胶对细胞内抗原的溶酶体运输。交通9:10到16。［Ref。］
2. Vyas JM, Van der Veen AG, Ploegh HL(2008)已知的未知的抗原处理和呈递。Nat Rev Immunol 8: 607-618。［Ref。］
3. 陈伟，彭锴，马思明，等。(2004)CD8+ T细胞对甲型流感病毒免疫应答的免疫优势等级逆转:交叉呈现和裂解独立免疫优势的作用。J免疫173:5021-5027。［Ref。］
4. Shen L, Rock KL(2004)细胞蛋白是体内交叉引物抗原的来源。美国国立科学院学报101:3035-3040。［Ref。］
5. (2006)编码非结构1 (NS1)基因的DNA质粒与组织纤溶酶原激活物信号序列融合后免疫小鼠诱导抗登革2型病毒。疫苗24:195 - 205。［Ref。］
6. Jalah R, Rosati M, Kulkarni V, Patel V, Bergamaschi C, et al.(2007)通过传递优化的DNA表达质粒，在小鼠中高效系统表达具有生物活性的IL-15。DNA细胞生物学26:827-840。［Ref。］
7. Kaur M，Rai A，Bhatnagar R（2009）狂犬病DNA疫苗：MHC I类和II类没有影响免疫应答和防止致命挑战的保护序列。疫苗27：2128-2137。［Ref。］
8. Li Z，Howard A，Kelley C，Delogu G，Collins F等人。（1999）DNA疫苗的免疫原性表达融合到组织纤溶酶原激活剂信号序列的结核蛋白。感染IMMUN 67：4780-4786。［Ref。］
9. 罗米，陶p，李继，周某，郭d等。（2008）用质粒DNA的免疫编码流感的病毒核蛋白融合到组织纤溶酶原激活剂信号序列引发了强烈的免疫反应和对小鼠的H5N1攻击的保护。J Virol方法154：121-127。［Ref。］
10. 邱金涛，刘波，田超，Pavlakis GN，于晓芳(2000)利用DNA表达载体靶向gag抗原的分泌途径增强对人类免疫缺陷病毒1型gag的一级和二级细胞免疫应答。J病毒74:5997-6005。［Ref。］
11. Seo SH, Jin HT, Park SH, Youn JI, Sung YC(2009)通过抗原工程和电穿孔优化HPV DNA疫苗诱导的CD8+ T细胞应答和治疗性抗肿瘤作用。疫苗27日:5906 - 5912。［Ref。］
12. Wang S, Farfan-Arribas DJ, Shen S, Chou TH, Hirsch A, et al.(2006)密码子使用、启动子效率和前导序列对HIV-1 Env DNA疫苗抗原表达和免疫原性的相对贡献。疫苗24:4531 - 4540。［Ref。］
13. 黄永强，陈志强，张伟，黄永强，宋勇，等。(2008)抗HIV-1亚型C/B'重组病毒双启动子多基因DNA疫苗的设计、构建和鉴定。J获得免疫Defic Syndr 47: 403-411。［Ref。］
14. Megati S, Garcia-Hand D, Cappello S, Roopchand V, Masood A, et al.(2008)修饰HIV-1 env gp160基因以改善pDNA疫苗诱导的细胞介导的免疫应答。疫苗26:5083 - 5094。［Ref。］
15. Midha S, Bhatnagar R(2009)炭疽保护抗原通过DNA疫苗接种到不同的亚细胞位置，增强体液和细胞免疫反应。Eur J Immunol 39: 159-177。［Ref。］
16. Wang JY, Song WT, Li Y, Chen WJ, Yang D, et al.(2011)通过引入新的三聚体基序和tPA信号序列的突变改善哺乳动物细胞分泌蛋白和三聚体蛋白的表达。应用微生物技术91:731-740。［Ref。］
17. C型肝炎病毒清除后抗原特异性记忆CD4(+) T细胞的进化。中国免疫学杂志。［Ref。］
18. 梁X，傅TM，谢H，Emini EA，Shiver JW（2002）HIV-1 NEF疫苗成分的开发：缺乏小鼠缺乏MyRistoylation和Dileucine Motif的Nef突变体的免疫原性研究。疫苗20：3413-3421。［Ref。］
19. Delogu G, Li A, Repique C, Collins F, Morris SL(2002)在小鼠肺结核模型中表达组织型纤溶酶原激活物信号序列融合蛋白或泛素结合抗原的DNA疫苗组合诱导持续保护性免疫。感染免疫70:292-302。［Ref。］
20. Letourneau S, Im E-J, Mashishi T, breereton C, Bridgeman A, et al. (2007) HIV-1通用疫苗的设计和临床前评估。PloS one 2: e984。［Ref。］
21. Carlson JM, Schaefer M, Monaco DC, Batorsky R, Claiborne DT, et al. (2014) HIV传播。异性间HIV-1传播瓶颈的选择偏差。科学》345:1254031。［Ref。］
22. Claiborne DT, Prince JL, Scully E, Macharia G, Micci L, et al.(2015)传播HIV-1的复制适应度驱动急性免疫激活、记忆CD4+ T细胞前病毒负荷和疾病进展。美国国家科学学院学报112:1480-1489。［Ref。］
23. Deng K, Pertea M, Rongvaux A, Wang L, Durand CM, et al.(2015)由于逃逸突变的优势，需要广泛的CTL反应来清除潜伏的HIV-1。自然517:381 - 385。［Ref。］
24. Ferguson AL, Mann JK, Omarjee S, Ndung’u T, Walker BD，等(2013)将HIV序列转化为定量适应度景观，预测合理免疫原设计的病毒漏洞。免疫38:606 - 617。［Ref。］
25. Abdul-Jawad S, Ondondo B, van Hateren A, Gardner A, Elliott T，等。摩尔Ther 24: 375-384。［Ref。］
26. Borthwick NJ, Rosario M, Schiffner T, Bowles E, Ahmed T, et al.(2015)恒河猴对hiv感染的体液反应。免疫炎症Dis 3: 82-93。［Ref。］
27. Clutton G, Bridgeman A, Reyes-Sandoval A, Hanke T, Dorrell L(2015)瞬时IL-10受体阻断可增强CD8 T细胞对猴腺病毒载体HIV-1保守区免疫原的应答。Hum vaccine Immunother 11: 1030-1035。［Ref。］
28. Clutton G, Carpov A, Parks CL, Dean HJ, Montefiori DC, et al.(2014)优化多组分亚单位疫苗平行诱导HIV 1型特异性抗体和t细胞应答。艾滋病28:2495 - 2504。［Ref。］
29. IM E-J，Hong JP，Roshorm Y，Bridgeman A，LétourneauS等人。（2011）连续上升次肾上腺CD8 + T细胞表位对病毒挑战的保护效果。Plos Pathog 7：E1002041。［Ref。］
30. Knudsen ML, mbehe - mvula A, Rosario M, Johansson DX, Kakoulidou M，等(2012)与传统质粒DNA疫苗相比，电穿孔甲病毒复制子DNA更能诱导T细胞对保守的HIV-1区域的应答。J病毒86:4082-4090。［Ref。］
31. Ondondo B, Abdul-Jawad S, Bridgeman A, Hanke T (2014) BALB/c小鼠中T细胞对HIV- 1蛋白组保守区域的反应特性。临床免疫21期:1565-1572。［Ref。］
32. Ondondo B, Brennan C, Nicosia A, Crome S, Hanke T(2013)肌肉注射新型pSG2后没有全身毒性变化。ChAdV63 HIVconsv DNA。HIVconsv和MVA。将hiv病毒疫苗接种BALB/c小鼠。疫苗31:5594 - 5601。［Ref。］
33. Rosario M, Borthwick N, Stewart-Jones GB, Mbewe-Mwula A, Bridgeman A, et al.(2012)在猕猴体内使用辅助合成长肽诱导T细胞和抗体进入HIV-1的保守区域。艾滋病26日:275 - 284。［Ref。］
34. Rosario M, Bridgeman A, Quakkelaar ED, Quigley MF, Hill BJ, et al.(2010)长肽诱导针对HIV-1保守区域的多功能T细胞，其广度优于单基因疫苗。欧洲免疫杂志40:1973-1984。［Ref。］
35. Ahmed T, Borthwick NJ, Gilmour J, Hayes P, Dorrell L, et al.(2016)通过保守的亚显性Pol表位控制疫苗诱导的人CD8 T细胞体外复制HIV-1。疫苗34:1215 - 1224。［Ref。］
36. Borthwick N, Ahmed T, Ondondo B, Hayes P, Rose A，等(2014)疫苗诱导的人类T细胞识别保守蛋白区域抑制HIV-1。摩尔Ther 22: 464-475。［Ref。］
37. 2014年，质粒DNA载体、猴腺病毒载体和修饰痘苗病毒载体的保守区疫苗对人类免疫缺陷病毒1型未感染成人的安全性和耐受性进行了随机、单盲I期试验。《公共科学图书馆•综合》9:e101591。［Ref。］
38. muta G, Farah B, Langat R, Indangasi J, Ogola S, et al.(2016)通过疫苗诱导的CD8+ T细胞体外抑制非洲成人HIV-1。Mol thermethods Clin Dev 3: 16061。［Ref。］
39. Hanke T(2014)下一代HIV-1疫苗的prime-bost策略中的保守免疫原。专家意见Biol Ther 14:601-616。［Ref。］
40. Hayes PJ, Cox JH, Coleman AR, Fernandez N, Bergin PJ，等(2016)基于腺病毒的HIV-1候选疫苗在疗效试验中通过限制HIV-1抑制范围诱出CD8 t细胞。艾滋病30:1703 - 1712。［Ref。］
41. Hanke T，Barnfield C，Wee Eg-T，ÅgrenL，塞缪尔RV等。（2003）Semliki森林病毒的初级升压方案中的构建和免疫原性 - 矢量化的实验HIV植物疫苗。J Gen Virol 84：361-368。［Ref。］
42. 陈丽，陈丽华，陈丽华，等(2003)表达人类免疫缺陷病毒1型gag基因的DNA质粒、重组痘苗病毒和复制缺陷腺病毒载体在恒河猴中的免疫原性比较。J病毒77:6305-6313。［Ref。］
43. 汉克T, Szawlowski P, Randall RE(1992)利用标签特异性单克隆抗体和标签连接抗原构建含有猴免疫缺陷病毒p27的固体基质抗体-抗原复合物。J Gen Virol 73: 653-660。［Ref。］
44. 高桥，Cohen J, Hosmalin A, Cease KB, Houghten R, et al.(1988)人类免疫缺陷病毒包膜糖蛋白gp160的免疫显性表位被I类主要组织相容性分子限制性小鼠细胞毒T淋巴细胞识别。美国国家科学院学报85:3105-3109。［Ref。］
45. Mwau M, McMichael AJ, Hanke T(2002)用于候选HIV疫苗临床试验的ELISPOT分析的设计和验证。艾滋病逆转录病毒18:611-618。［Ref。］
46. Wallace A, West K, Rothman AL, Ennis FA, Lu S，等。Hum vaccine Immunother 9:2095 -2102。［Ref。］
47. Wang S, Heilman D, Liu F, Giehl T, Joshi S, et al.(2004)一种产生LcrV抗原的DNA疫苗可有效地保护小鼠免受鼠疫致死性黏膜攻击。疫苗22:3348 - 3357。［Ref。］
48. [张璐，贾宁，李军，韩艳，曹伟，等。(2014)基于ha的H7亚型流感病毒DNA疫苗的优化设计。Hum vaccine Immunother 10: 1949-1958。［Ref。］
49. 陈敏等(2002)利用人免疫缺陷病毒1型pol基因在啮齿动物和非人类灵长类动物中的疫苗诱导免疫应答。J病毒76:185-194。［Ref。］
50. Perez-Velez ME, Garcia-Nieves T, Colon-Sanchez C, Martinez I(2009)用Dengue-2包膜DNA疫苗诱导小鼠中和抗体。中华医学会卫生科学分会。［Ref。］
51. Capone S, Naddeo M, D’alise AM, Abbate A, Grazioli F, et al. (2014) HCV非结构抗原与MHC ii类相关不变链融合可增强非人类灵长类动物载体疫苗诱导的t细胞应答。Mol Ther 22: 1039-1047。［Ref。］
52. Spencer AJ, Cottingham MG, Jenks JA, Longley RJ, Capone S, et al.(2014)通过融合MHC ii类不变链增强疫苗诱导的CD8+ T细胞对疟疾抗原ME-TRAP的应答。PloS one 9: e100538。［Ref。］
53. Holst PJ, Sorensen MR, Mandrup Jensen CM, Orskov C, Thomsen AR, et al. (2008) MHC ii类相关不变链抗原显著改善腺病毒疫苗诱导的细胞介导免疫。J Immunol 180: 3339-3346。［Ref。］
54. de Arruda LB, Chikhlikar PR, August JT, Marques ET(2004)编码人类免疫缺陷病毒-1 Gag的DNA疫苗，通过溶酶体相关膜蛋白靶向主要组织相容性复合体II区，引发增强的长期记忆反应。免疫学112:126 - 133。［Ref。］
55. Rowell JF, Ruff AL, Guarnieri FG, Staveley-O'Carroll K, Lin X, et AL .(1995)溶酶体相关膜蛋白-1介导的将HIV-1包膜蛋白靶向到内体/溶酶体间室增强了其在MHC ii类限制性T细胞中的表现。J Immunol 155: 1818-1828。［Ref。］

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文章信息

文章类型:研究文章

引用:Ondondo B, Abdul-Jawad S, Roshorm Y, Bridgeman A, Hanke T(2016)人组织纤溶酶原激活物信号肽对疫苗诱导T细胞的载体传递依赖效应。J HIV艾滋病2(4):doi: http://dx.doi。org/10.16966/2380 - 5536.130

版权：©2016 Ondondo B，等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

收到日期:2016年7月12日

接受日期:2016年8月29日

发布日期：2016年9月01日