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研究文章
HIV/AIDS患者致病因素:蛋白酶、磷脂酶和生物膜的研究

莱茵德•考尔＊Ritu GoyalMegh年代DhakadPreena Bhalla)理查德睡椅

印度新德里，Maulana Azad医学院和联合Lok Nayak医院微生物系

*通讯作者:Ravinder Kaur博士，MBBS，医学博士，微生物系主任教授，Maulana Azad医学院和联合Lok Nayak医院，新德里，印度，电话:011-23235751(171);电子邮件:rkaur.mamc@gmail.com


摘要

目的:假丝酵母菌种被认为是最具致病性的酵母之一，经常从免疫缺陷患者中分离出来。本研究的目的是测定蛋白酶，磷脂酶和粘附活性假丝酵母从艾滋病毒/艾滋病患者分离的物种，有助于浅表和全身念珠菌病的发病机制。

材料和方法:目前的调查涉及从不同临床来源回收的314个样本的详细研究;研究HIV/AIDS患者的痰、血、尿、口腔拭子和脑脊液样本。的识别假丝酵母采用菌管试验、玉米粉琼脂试验、糖同化发酵试验和Vitek-2酵母菌鉴定系统进行菌种鉴定。对所有分离株进行蛋白酶、磷脂酶测定和粘附试验。

结果:143株假丝酵母从314个不同的临床来源中恢复了物种。优势种为白色念珠菌(82.51%)，其次为白色念珠菌C.tropicalis(6.29%),C.krusei(4.89%)、副乳杆菌病(3.49%)和C.glabrata(2.79%)。100％C.parapsilosis> 89% C.tropicalis > 83.9%C.albicans＞75%C.glabrata> 42.8%C.krusei磷脂酶活性为80%C.parapsilosis>77%热带乳杆菌>75%光滑乳杆菌>61.1%白色乳杆菌>42.8%C.krusei表现出蛋白酶活性，83.8%C.albicans> 80%C.parapsilosis> 77.7%C.tropicalis> 75% C.glabrata > 71.4%C.krusei展出的依从性活动。

结论:目前的研究表明C.albicans其次是热带c.c alis, C.krusei, C. parapsilosis和C.glabrata。总人数C.albicans产生蛋白酶、磷脂酶和诱导生物膜形成的数量较多念珠菌属非。白色的产生这些毒性因子。这一结果表明生物膜的产生是重要的假丝酵母以及其他建立感染的机制。

关键字

生物膜;念珠菌病;艾滋病毒/艾滋病;磷脂酶;蛋白酶

介绍

由于获得性免疫缺陷综合征(艾滋病)的流行、维持生命技术的改进和抗癌治疗，真菌感染的实例在过去二十年中急剧增加。与其他具有环境生态位的病原真菌不同，假丝酵母在60-80%的人类[1]的胃肠道和泌尿生殖道粘膜上发现了共生物种。最常见的感染是假丝酵母物种包括黏膜感染，其次是侵袭性感染。与念珠菌血症相关的危险因素包括中性粒细胞减少、癌症化疗、抗菌药物和长时间留置导尿[2]。口咽部念珠菌病(OPC)发生在几个患者群体中，随着CD4+细胞计数的死亡，它的频率越来越高，通常阈值小于200细胞/mm3.[3]．

菌丝的形态变化和菌丝形成能力对生物膜的形成起着重要作用。假丝酵母物种已经发展了一个有效的电池推定的毒性因素和特定的策略，以协助定殖，入侵和发病机制。表示的毒性因子假丝酵母物种主要强调生物膜的形成、蛋白酶、磷脂酶的产生等，这取决于感染的类型、感染的部位和阶段以及宿主反应的性质。一旦接触成功，酶通过破坏或降解细胞膜和细胞外蛋白促进粘附，从而允许酵母进入宿主[4]。生物膜的产生也与相关生物的高水平的抗菌素耐药性有关，这使得根除生物变得困难。

本研究的主要目的是测定蛋白酶、磷脂酶和粘附活性假丝酵母从艾滋病毒/艾滋病患者分离的物种，有助于浅表和全身念珠菌病的发病机制。

材料和方法
假丝酵母分离株和研究人群

200名有症状的、经确认的人类免疫缺陷病毒(HIV)阳性成人患者，男女，怀疑有假丝酵母在新德里的Maulana Azad医学院作为研究人群。根据所涉及的器官系统采集相关临床样本，如口咽拭子、痰、血、尿、CSF、粪便，直接镜检、真菌培养和血清学。采用生化方法对酵母菌分离株进行鉴定和形态鉴定。

研究设计

前瞻性观察研究。

伦理批准

伦理批准获得了Maulana Azad医学院和联合医院(Lok Nayak, GB Pant医院，Guru Nanak眼科中心和Chacha Nehru Bal Chikitsalaya)机构伦理委员会的批准，新德里-110002，印度。

免疫状态评估

根据制造商的说明，通过使用荧光激活细胞分类器BD FACS计数系统(Becton Dickinson)的流式细胞术，对每个纳入研究的患者进行CD4计数，评估免疫状态。

识别和物种形成

的识别假丝酵母根据标准推荐程序[6-8]和Vitek-2酵母鉴定系统(bioMerieux, Marcy Etoile，法国)，通过细菌试管试验、玉米粉琼脂试验、糖同化和酵母氮基琼脂发酵试验(Difco, Becton Dickinson，印度)分离种。

所有菌株的毒力活性包括蛋白酶测定、磷脂酶测定和粘附试验，如下:

蛋白酶试验:假丝酵母用稍作改进的Staib法检测牛血清白蛋白培养基(2%葡萄糖，KH)2阿宝40.1%, MgSO40.05%，琼脂2%冷却至50℃后与1%牛血清白蛋白溶液混合)。蛋白酶活性评分为-级(无可见晕)，+级(在菌落周围1-2 mm范围内可见水解)，++级(在离菌落[9]边缘2 mm范围内可见水解)。

磷脂酶估计:通过在蛋黄琼脂上培养分离菌，并通过稍微修改的Samaranayake et al.[10]方法测量沉淀区大小，筛选其胞外磷脂酶活性。磷脂酶活性(Pz值)由菌落直径与降水区总直径的比值确定。这个比率被称为Pz(磷脂酶带)。如果Pz小于1，则产生磷脂酶。Pz小于0.7，说明该菌株的毒性较[10]强。

依从性分析:采用分光光度法测定分离菌株的粘附活性。用微量滴定板法在405nm处进行分光光度计读数。每个分离株的粘附活性评分为阴性(% T集团；<5, 1+ (% t .集团；5 ~ 20)， 2+(% T集团；20 ~ 35)， 3+ (% T集团；35 ~ 50)，或4+ (% T集团；> = 50)[4]。

统计分析:采用SPSS软件(21.0版;SPSS s.l.，马德里，西班牙)。在使用Shaipro Wilk检验进行统计分析前，对数据进行正态性检验。分类变量的分析采用卡方检验或Fisher精确检验。所有统计检验均认为p<0.05为差异有统计学意义。所有的统计学显著性检验均采用双尾检验。

结果

对200例有症状的艾滋病患者进行了研究。5例患者为中性(2.5%)。已婚男性111人(56.9%)、未婚女性53人(27.1%)、未婚男性25人(12.8%)、未婚女性6人(3%)。21-40岁患者155例(79%)，26-40岁患者最多。在我们的研究中，男:女比例是2.3:1。

CD4细胞计数为16-1033个/µl。93例(46.5%)患者CD4细胞计数<200个/µl, 40例(20%)患者CD4细胞计数<100个/µl, 20例(10%)患者CD4细胞计数<50个/µl，属于严重免疫抑制的主要人群。

在我们的研究人群中，最常见的主诉为口腔白斑(82%)、体重减轻(79%)、发烧(67%)和食欲减退(53%)。99.5%的患者有一种以上的抱怨。

一百四十三假丝酵母分离株与C.albicans(82.51%)是最常见的物种，其次是c . tropicalis(6.29%),C.krusei(4.89%),C.parapsilosis(3.49%),C.glabrata(2.79%)。

118例(82.5%)检测到磷脂酶活性。假丝酵母隔离。83.8%C.albicans表现出的磷脂酶活性为76%假丝酵母nonalbicans物种。100％C.parapsilosis> 89%C.tropicalis> 83.9%C.albicans> 75% C.glabrata > 42.8%C.krusei表现出磷脂酶活性。++磷脂酶活性最高，为60%C.parapsilosis其次是50%C.glabrata, 48.3%的C.albicans和44.4%C.tropicalis而这一比例为14.2%C.krusei见表1。

99例(69.23%)检测到蛋白酶活性。假丝酵母隔离。69.4%C.albicans产生蛋白酶的比例为68%假丝酵母nonalbicans．80％C.parapsilosis> 77% C.tropicalis > 75%C.glabrata> 61.1%C.albicans> 57.4%C.krusei表现出蛋白酶活性。蛋白酶活性(++)最高，为55.5%C.tropicalis, 29.6%的C.albicans, 25%的C.glabrataand14.2%C.krusei而(+)活性见于80%C.parapsilosis结果见表2。

平板实验显示82.6%的粘附活性假丝酵母隔离病人。1+粘附活性分别为9.1%，2+、3+、4+活性分别为28.7%、14.7%、30.1%。4+坚持活动C.albicans(32%),C.krusei(28.5%),C.glabrata(25%),C.parapsilosis(20%)和C.tropicalis(11%)。

83.8%的白念珠菌产生生物膜，76%的白念珠菌产生生物膜Nonalbicans物种。83.8%C.albicans> 80%c . parapsilosis> 77.7%C.tropicalis> 75% C.glabrata > 71.4%c . krusei展出的依从性活动。最大粘附活性(4+)为32%白念珠菌, 28.5%的c . krusei, 25%的c . glabrata, 20%的c . parapsilosis和11%c . tropicalis如表3所示。

生物膜，蛋白酶，和磷脂酶的生产假丝酵母从临床标本中分离出的物种见表4。所有c . parapsilosis(100%)表现出磷脂酶活性c . tropicalis(89%),白念珠菌(83.9%),c . glabrata(75%)和c . krusei(42.7%),c . parapsilosis(80%)和c . tropicalis产蛋白酶量最高，为77.5%c . glabrata(75%),白念珠菌(69.4%)和c . krusei(42.7%)。而粘附活性表现为白念珠菌(83.9%)和c . parapsilosis(80%)紧随其后c . tropicalis(77.7%)、光滑乳鼠(75%)和C.krusei(71.4%)。

表1:表现为磷脂酶活性假丝酵母隔离

磷脂酶活性Pz<1.00(阳性)，Pz<0.7(毒性更强)

表2:表现为蛋白酶活性假丝酵母分离株(-)时无可见光晕存在，(+)时可见蛋白水解区局限于菌落周围1-2 mm，(++)时蛋白水解区>距离菌落边缘2 mm

表3:粘附活性表现为假丝酵母隔离

4 +;强阳性，3+和2+;中度正，1+和(0);弱阳性或弱阴性。

表4:生物膜由不同的假丝酵母物种

在口腔拭子中:C.albicans表现出75%、61%、73%的磷脂酶、蛋白酶和粘附活性，热带荚果线虫分别表现出3.5%的磷脂酶、蛋白酶和粘附活性C.glabrata表现出1.8%的磷脂酶、蛋白酶和粘附活性C.parapsilosis表现为3.5%、2.65%、2.65%的磷脂酶、蛋白酶和粘附活性C.krusei表现为0.88%、0.88%、1.8%的磷脂酶、蛋白酶和粘附活性。

在痰样本中C.albicans表现出56%的磷脂酶、蛋白酶和61的粘附活性C.tropicalis磷脂酶、蛋白酶和粘附活性分别为8.7%。C.glabrata蛋白酶和粘附活性为4.35%C.parapsilosis表现出4.35%的蛋白酶和粘附活性，但在C.krusei只有4.35%的人检测到磷脂酶阳性。

在尿样中，热带荚膜线虫表现出50%的磷脂酶、蛋白酶和粘附活性C.krusei分别表现为50%的磷脂酶、蛋白酶和粘附活性。然而，在血液培养样本中C.albicans表现出25%，50%的磷脂酶和粘附活性。C.tropicalis表现出25%的磷脂酶活性C.krusei分别表现出25%的磷脂酶、蛋白酶和粘附活性。只在粪便样本中C.krusei分别产生100%的蛋白酶和粘附活性。图1表示的是由假丝酵母物种。

所有的假丝酵母spp具有毒力活性。然而，数值没有统计学意义，只有磷脂酶活性C.krusei显示有统计学意义的值(p = 0.01）.图2显示了CD4计数与不同等级的磷脂酶、蛋白酶和粘附活性的相关性假丝酵母种虫害隔离。CD4计数与粘附活性呈正相关，与磷脂酶、蛋白酶活性呈负相关假丝酵母种虫害隔离。

讨论

种的致病性假丝酵母菌株分离是由菌株的特性、宿主的免疫状态和[11]感染位点的当地条件决定的。的致病性C.albicans是一个复杂的过程，包括不同的阶段、定植、粘附、侵入组织和损伤宿主细胞、细胞壁的组成以及毒素和蛋白水解酶的产生[11,12]。

假丝酵母是一种无性、二倍体、二形的真菌，存在于人类和他们的环境中。假丝酵母生物体是共生体，要像病原体一样工作，就必须中断正常的宿主防御。一般风险因素假丝酵母感染包括免疫缺陷状态、糖尿病和医源性因素，如抗生素的使用、留置设备、静脉药物的使用和高营养液体。念珠菌病作为一种令人担忧的机会性疾病出现在越来越多的免疫功能受损、老年人、长期接受抗菌和侵袭性癌症化疗或接受侵袭性外科手术和器官移植的患者中。

图1:磷脂酶，蛋白酶和生物膜产生假丝酵母物种

图2:A)磷脂酶与CD4计数的相关性;B)蛋白酶与CD4计数的相关性;C)依从性与CD4计数的相关性。

白念珠菌的磷脂酶和天冬氨酸蛋白酶被认为是重要的毒力因子[13]，这些酶的缺失或表达降低可能表明白念珠菌的毒性较低假丝酵母物种，当与假丝酵母这些酶表达较高的物种[14,15]。

天冬氨酸蛋白酶是由致病菌分泌的假丝酵母在体内在感染。蛋白酶在感染过程中完成许多特殊的功能，包括消化分子以获取营养，消化或扭曲宿主细胞膜以促进粘附和组织入侵，消化宿主免疫系统的细胞和分子以避免或抵抗宿主的抗菌攻击。香港的Gokce G et al.[16]和Wu et al.[4]早有报道C.albicans已知从艾滋病毒感染患者分离的病毒的蛋白水解率(100%)明显高于从艾滋病毒阴性个体分离的病毒(56%)。

在我们的研究中，蛋白酶的产生能力C.albicans(69.4%)几乎与假丝酵母nonalbicans(68%)不像2011年土耳其的一项研究报道的那样C.albicans(89.7%)产生更多的蛋白酶假丝酵母non-albicans(25.8%)，而2011年来自南印度的工人[18]报道的蛋白酶生产能力为假丝酵母nonalbicans(50.45%)低于C.albicans(67.34%)。然而，2012年来自意大利[19]的一项研究报告显示48%C.albicans有蛋白酶活性的时候假丝酵母nonalbicans没有产生蛋白酶。

在我们的研究中80%C.parapsilosis> 77%C.tropicalis＞75%C.glabrata> 61.1%C.albicans> 57.4%C.krusei表现出蛋白酶活性。蛋白酶活性(++)最高，为55.5%C.tropicalis, 29.6%的C.albicans, 25%的C.glabrata和14.2%C.krusei而80%C.parapsilosis显示(+)活动。口腔拭子中白色念珠菌占61%，热带念珠菌占3.5%，热带念珠菌占2.65%C.parapsilosis, 1.8%的C.glabrata和0.88%的克鲁氏菌表现出蛋白酶活性。痰中分离株的蛋白酶活性也相似，为56%C.albicans, 8.7%的C.tropicalis、、、、两种植物各占4.35%C.parapsilosis．而在尿液中分别分离50%C.tropicalis和C.krusei表现出更多的蛋白酶活性。在血液培养样本中C.krusei表现出25%的蛋白酶活性。在所有的粪便样本中C.krusei(100%)显示蛋白酶活性。

磷脂酶通过C.albicans最先由Costa等人[20]检测到。C.albicans是唯一的假丝酵母已知能分泌磷脂酶的物种[10,21]。细胞外磷脂酶被认为是通过溶解宿主细胞或改变宿主细胞的表面特征，如促进粘附和渗透[22]来促进毒力。磷脂酶可增强宿主细胞膜的粘附性并引起宿主细胞膜的溶解。术语磷脂酶是指一组具有水解甘油磷脂中的一个或多个酯键能力的非均质酶。由于磷脂酶靶向膜磷脂并消化这些成分，导致细胞裂解;[23]直接宿主细胞损伤和裂解被认为是导致微生物毒力的主要机制。在我们的研究中，83.8%C.albicans产生的磷脂酶活性为76%假丝酵母nonalbicans．Mohandas V等人的[18]也显示46.93%C.albicans产生超过42%的磷脂酶假丝酵母nonalbicans证明C.albicans具有较大的细胞外磷脂酶活性。我们的研究结果也与Ibrahim et al.[22]和Gokce G[16]在2007年土耳其的报道相一致，报道磷脂酶产量为60.3%C.albicans与所有的消极因素相比假丝酵母非白色的菌株。

根据Samaranayake等人[10]的研究，磷脂酶的产生是通过C.albicans体外在高浓度的蔗糖和半乳糖中降低，在高浓度的葡萄糖中完全抑制蔗糖和半乳糖。在临床方面，提高膳食糖的口服浓度可以抑制磷脂酶的形成，从而降低这种酵母的致病潜力。

在我们的研究中，100%的副孢子虫>89%的热带孢子虫>83.9%的白色孢子虫>75%C.glabrata> 42.8%C.krusei表现出磷脂酶活性。60%的患者++磷脂酶活性最高(Pz <0.7)C.parapsilosis, 50%的C.glabrata, 48.3%的C.albicans和44.4%C.tropicalis相比之下，比例较低C.krusei(14.2%)。以前的研究报道磷脂酶活性在30 - 100%假丝酵母L从不同的患者群体和不同的部位分离[4,24]。Price等[24]报道，比例可能取决于场地;例如，在55%和30%中发现了磷脂酶活性假丝酵母分别从血液和尿液中分离而在我们的研究中，在血液培养和尿液样本中，分别为75%和100%假丝酵母磷脂酶产生的物种。在我们的患者中，口服磷脂酶活性为84.7%假丝酵母而1998年来自孟买的Kothavede和panthaki[25]在口腔拭子中显示出67.1%的磷脂酶活性，而来自斯里兰卡[10]的一项研究报告称，来自口腔的分离菌产生了79%的磷脂酶。Ribeiro等人对239例口腔和阴道进行了研究C.albicans从HIV阳性患者的菌株中发现了明显高于HIV阴性个体的磷脂酶活性。

两份出版物记录了，[14]C.albicans呼吸道感染分离株产生的磷脂酶比血液分离株产生的磷脂酶更多，而在我们的研究中，血液样本中的磷脂酶生产高于呼吸道样本，但由于在我们的研究中，血液样本的数量相对较低，因此不能得出明确的结论。这些数据表明，隔离地点C.albicans以及患者的疾病状态可能是指示磷脂酶活性的重要因素。在我们的研究中，尿液样本中的磷脂酶产量(100%)高于其他临床样本

生物膜和耐药发展是一个复杂的多因素现象，尚有待于充分阐明和理解。不同的机制可能是造成的内在阻力假丝酵母生物膜。这些因素包括:(i)生物膜内的高密度细胞;(ii)生物膜基质的影响;生长率下降和营养限制;(四)抗性基因的表达，特别是那些编码外排泵的基因;(v)“持续性”细胞[27]的存在。生物膜是由分泌的黏液包围的微生物的集合。生物膜被认为促进了感染的持续性。我们研究了生物膜假丝酵母HIV感染的OPC患者分离株的阳性率为83.5%C.albicans和76%假丝酵母nonalbicans生产的生物膜。意大利的Sara Asticcioli在2007年报告了一个类似的发现假丝酵母nonalbicans产生的生物膜明显少于致病膜C.albicans相反，土耳其的Gokce G et al.[16]在2007年报道了11.8%的白色念珠菌和41.93%的白色念珠菌假丝酵母non-albicans菌株为生物膜阳性。

来自英国的Hawser和Douglas[28]在白血病患者中也报道了脱毒梭状芽孢杆菌和C.glabrata产生生物膜的可能性明显低于致病性C.albicans．在我们的研究中，83.8%C.albicans> 80% C.parapsilosis > 77.7%C.tropicalis＞75%C.glabrata> 71.4%C.krusei展出的依从性活动。最大粘附活性(4+)为32%C.albicans, 28.5%的C.krusei, 25%的C.glabrata其中20%为副孢霉病，11%为热带孢霉病。在口服菌株中:73%C.albicans, 3.5%的C.tropicalis, 2.65%的C.parapsilosis，分别为1.8%C.glabrata和C.krusei显示出坚持活动，而2013年Pune Maharastra的一项关于HIV/AIDS患者的研究报告为59.6%C.albicans隔离和73.9%假丝酵母non-albicans口腔生物膜阳性。

在痰样本中也是61%C.albicans, 8.7%的C.tropicalis，各4.35%C.glabrata和C.parapsilosis展出的依从性活动。而尿液样本中，50%的C.tropicalis克鲁塞菌表现出粘附活性，在血液培养样品中，50%白色念珠菌和25%白色念珠菌C.krusei在我们的研究中显示出了粘附活性，而印度卡纳塔克邦2012年一项关于新生儿血流感染的研究报告称，有43.75%的光斑C.glabrata、37.5%热带C.tropicalis和6.25%的克鲁赛C.krusei的粘附[17]阳性。100％C.krusei粪便显示了我们研究中产生的粘附活动

增强的生物膜可能是长期疾病和不良结局的独立危险因素。本研究中生物膜的产生更多地与菌种有关假丝酵母而不是感染部位。生物膜是一种特殊的特性假丝酵母孤立与坚持的差异无关，但与缓慢增长有关。假丝酵母生物膜可能有助于浅表和全身念珠菌病的发病机制，因为它们是出了名的抗真菌药物耐药。在本研究中，我们使用了含有8%高葡萄糖的SDB培养基，该培养基被用来诱导生物膜的形成C.parapsilosis一些研究报道了分离株[30-32]。然而，其他研究表明，高糖条件，模拟TPN溶液中发现的那些，并不促进生物膜的产生C.albicans隔离。

结论

在我们的研究中，所有的毒力标记都与它们的致病潜力有很好的相关性假丝酵母分离物在不同的致病实体。本研究显示假丝酵母parapsilosis和白色念珠菌在不同的毒力活动中，假丝酵母parapsilosis与最大磷脂酶产量相比C.tropicalisC.albicans,C.glabrata和C.krusei而伴恙虫病C.tropicalis蛋白酶产量最高的是哪个C.glabrata、C.albicans和C.krusei．然而，最大的粘附活性出现在C.albicans紧随其后的是C.parapsilosis．总人数假丝酵母白念珠菌产生的蛋白酶、磷脂酶和生物膜的数量都远远多于白念珠菌念珠菌属非白色的产生这些毒性因子。生物膜的产生被认为是一个重要的部分白色念珠菌而非白色念珠菌似乎也具有建立感染的其他机制。然而，根据患者的年龄和感染部位对菌株进行分组时，生物膜的产生没有显著差异。

其致病机制不同假丝酵母需要通过更多样化的研究来更好地理解物种，这将有助于更好地理解这些机会主义寄生虫与宿主的关系。此外，不同抗真菌药物对生物膜设置的有效性的确定对指导治疗决策具有重要的临床意义，可能会影响这些难以治疗的感染、毒性的患者的结果假丝酵母物种不是单一的因素，而是多种因素的组合，如蛋白酶、磷脂酶、生物膜的产生。

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条信息

文章类型:研究文章

引用:Kaur R, Goyal R, Dhakad MS, Bhalla P, Diwan R (2015) HIV/ AIDS患者致病因子:蛋白酶、磷脂酶和生物膜的研究。J HIV AIDS 1(2): http://dx.doi。org/10.16966/2380 - 5536.110

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出版的历史:

  • 收到日期:2015年8月24日

  • 接受日期:2015年9月25日

  • 发表日期:2015年9月29日