
N/A不适用于这种放大;30 ' = 30分钟;30 " = 30秒
在刚果民主共和国金沙萨诊所就诊的Drug-Naïve艾滋病毒1型感染者的遗传多样性和抗逆转录病毒耐药性
埃里克Ntambwe Kamangu,1 *Adawaye用法语,2法布里斯Susin,3.拉斐尔Boreux,4理查德Lunganza Kalala,1乔治·莱罗Mvumbi,1帕特里克•德•摩尔4多洛雷斯Vaira,3.显示Hayette,3,4
1刚果民主共和国金沙萨大学医学院基础科学系分子生物学单元*通讯作者:Erick Ntambwe Kamangu,金沙萨大学医学院基础科学系分子生物学单元,刚果民主共和国金沙萨;电子邮件:erick.kamangu@unikin.ac.cd或erickamangu@gmail.com
背景
大量使用抗逆转录病毒(ARV)造成了对治疗产生耐药性的突变株的出现。因此,世界卫生组织(世卫组织)建议对新感染人类免疫缺陷病毒(艾滋病毒)的病人进行流行病学监测。本研究的目的是确定金沙萨treatment-naïve患者中HIV 1型病毒的遗传多样性和与抗逆转录病毒耐药性相关的突变流行情况。大量使用抗逆转录病毒(ARV)造成了对治疗产生耐药性的突变株的出现。因此,世界卫生组织(世卫组织)建议对新感染人类免疫缺陷病毒(艾滋病毒)的病人进行流行病学监测。本研究的目的是确定金沙萨treatment-naïve患者中HIV 1型病毒的遗传多样性和与抗逆转录病毒耐药性相关的突变流行情况。方法
153名HIV 1型阳性患者自愿参加了这项研究。他们是在金沙萨的不同中心招募的。纳入的时间为2013年8月至2014年2月。将5毫升(5ml)血液收集在装有EDTA抗凝剂的试管中。500微升血浆被送往比利时大学医院Liège (CHU-Liège)艾滋病参考实验室进行分析。使用QIAamp RNA Mini Kit (QIAGEN®)从140µl血浆中提取RNA。逆转录酶PCR和巢式PCR使蛋白酶和逆转录酶(RT)上感兴趣的区域得以扩增,用于后续测序。结果
患者平均年龄37岁,年龄从18岁到65岁不等。病毒载量(VL)和CD4淋巴细胞比率的中位数分别为5.68 log10 RNA拷贝数/ml和180个细胞/ml。分别对153例患者中130例(84.9%)和145例(94.8%)进行蛋白酶和RT的扩增和测序。以A型为主35例(22.9%);其次是CRF02_AG(11.1%)、C(9.8%)、G(9.8%)、K(9.8%)、D(7.8%)、H(7.8%)和J(5.0%)。结论
我们的研究结果证实了金沙萨HIV 1型的高度多样性。它揭示了病毒的异质性和动态,以及与抗逆转录病毒药物相关的传播耐药性的存在。hiv - 1;遗传多样性;抗逆转录病毒药物耐药性;天真的患者;金沙萨
人类免疫缺陷病毒(HIV)是根据病毒类型、组、亚型、亚亚型和循环重组型(CRFs)进行分类的[1-3]。这种分类的优点是可以更好地选择适合感染患者的治疗类型[2,3]。在撒哈拉以南非洲,分子流行病非常多样化;以A、C、G亚型和不同CRFs为主[1-6]。
抗逆转录病毒药物(ARVs)的引入降低了与HIV感染相关的发病率和死亡率[7]。但同时,它的大量和不成比例的使用导致了耐治疗的突变株的出现。因此,世界卫生组织(WHO)建议对新感染HIV[7]的患者进行流行病学监测。这包括监测不同传播毒株的流行情况,并在人群中寻找与治疗相关的突变。
金沙萨是一个艾滋病毒感染率较低的城市;过去5年,它一直低于5%[8]。自2002年开始,抗逆转录病毒药物的获取仍然接近于地面,不到15%的合格人口能够获得[8]治疗。在刚果民主共和国(DRC),推荐的治疗方法是将2个核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTI)和1个非核苷酸逆转录酶抑制剂(NNRTI)联合用于一线治疗[9]。二线治疗用1个蛋白酶抑制剂(PI)和2个NRTI[9]。NRTI最常用的分子有:Abacavir (ABC)、Didanosine (ddI)、Lamivudine (3TC)、Stavudine (d4T)和Zidovudine (ZDV);用于NNRTI的:依非韦伦(EFV)和奈韦拉平(NVP);PI:利托那韦促进洛匹那韦(LPV/r)[10]。LPV/r仅在二次强化处理中引入[9,10]。在金沙萨,A型(34.3%)在流行病学文献中占主导地位; they are followed by variants G (17.3%), D (11.2%), C (7.4%), CRF01_AE (4.9%), F (4.8%), H (3.9 %) and U (3.5%) [11].
本研究的目的是确定金沙萨treatment-naïve患者中艾滋病毒1型的遗传多样性和与抗逆转录病毒(ARVs)耐药性相关的突变流行情况。
人口
153名被诊断为HIV 1型阳性的受试者自愿参加了这项研究。他们在金沙萨的不同中心招募。受试者的入选标准:(i)是诊断hiv - 1积极按照国家指导方针[9],(ii)在包容、18岁以上(iii)有资格获得抗逆转录病毒治疗(ART)的监控中心和(iv)根据记录的天真的艺术中心。德赢vwin首页网址巢式PCR DNA在金沙萨大学分子生物学实验室用于确认患者的HIV阳性。患者的人口学、临床和实验室信息被记录在研究前测试的标准化表格上。所有患者都签署了参与研究的知情同意书。纳入的时间为2013年8月至2014年2月。
血液样本
从肘部折痕静脉采集5ml (5ml)血液,用EDTA抗凝血管采集。收集的血液以1000 g离心10分钟,获得3个阶段(血浆,buffy coat和Cullot)的清晰分离。将1毫升血浆(上清)转入之前标记过的微管,送至医学院分子生物学实验室进行分析。将样品加入2管,每管500μl。一管用于测定金沙萨[13]患者基线时的病毒载量(VL)。另一根试管被送往比利时Liège的Liège大学医院(CHU-ULg)艾滋病参考实验室进行测序。
CD4细胞计数是在患者各自的中心使用Facs计数(Becton Dickinson Immunocytometry Systems)完成的。
RNA提取、扩增、测序
使用QIAamp RNA Mini Kit (QIAGEN®)在LRS CHU-Ulg[14]位点从140µl血浆中提取RNA。提取的样品在-80℃保存至使用。
提取后,用反转录PCR (RT-PCR)和巢式PCR扩增蛋白酶和逆转录酶(RT)上感兴趣的区域,进行后续测序。PCR是在Steegen(表1)[15]所描述的循环和温度条件下进行的。每个样品在蛋白酶和逆转录酶上进行意义和反义扩增。用于PCR检测的引物见表2。未用第一引物(Normals)扩增的样本,用文献[15]中所述的替代引物(ATL)进行PCR。
得到的扩增片段为蛋白酶约500个碱基对,rt约800个碱基对。这些片段用Sanger测序法进行测序。用ExoSAP-IT技术对其进行纯化,消除PCR扩增的残留产物,并对纯化片段进行测序。在读取序列之前,对产物进行了第二次纯化。
使用Vector NTI Advance®11.5 (Invitrogen, Life Technologies)软件对产生的片段进行配对,并与斯坦福大学数据库(hivdb.stanford.edu)[16]进行比较。法国国家科学研究机构(ANRS - www.hivfrenchresistance.org)和马克斯普兰克(www.geno2pheno.org)用于识别HIV-1亚型和可能的突变。如有必要,对碱基进行小的调整以使序列对齐。
统计数据
采用Friedman检验分析各组变异和不同突变的差异。概率p值<0.05被认为是显著的。病毒载量以每毫升的十进制对数表示。
本研究选取了153例HIV 1型感染者。我们的人口由61名(39.9%)男性和92名(60.1%)女性组成;是男女性别比为1.5 (p<0.05)。平均年龄37岁,年龄18 ~ 65岁(表3)。病毒载量(VL)和CD4淋巴细胞比率的中位数分别为5.68 log10 RNA拷贝/ml和180个细胞/ml(表3)。
子类型化
分别对130例(84.9%)和145例(94.8%)患者进行蛋白酶和逆转录酶的扩增和测序。123份样品用正常引物扩增,7份样品用替代引物扩增。用正常引物扩增125份,用替代引物扩增20份。以A型为主,35例(22.9%);其次为CRF02_AG(11.1%)、C (9.8%) G (9.8%) K(9.8%)、D(7.8%)、H(7.8%)和J(5.0%),见表4和图1。各亚型的性别分布差异不大;除B、D亚型外,以女性为主(图2)。亚型按年龄区间分布如图2所示。
蛋白酶抑制剂相关突变
与蛋白酶抑制剂耐药相关的突变可分为大突变和小突变。在我们的研究中,我们观察到几个与蛋白酶抑制剂相关的突变(图3)。最显著的主要突变是:L90M(2.0%)、D30N(1.3%)、V32I(1.3%)、V82A(1.3%)和I84V(1.3%)。最常见的小突变有:K20I/RT/M(28.1%)、L10I(27.5%)、I47R/IM(6.5%)、V11I(5.2%)、V32E/L(4.6%)、G48R(3.3%)和A71T/V(2.0%)。
N/A不适用于这种放大;30 ' = 30分钟;30 " = 30秒
逆转录酶抑制剂(RTI)
我们还观察到与核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)和非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)相关的突变(图4)。NRTI最常见的突变是:V75I / D / L / M(18.3%)、K70E / N / R(9.8%)、D67G / E / N(9.2%)、M184V / L / K / R(9.2%)、T215F / N /我/ L(9.2%)、Y115F(7.8%)、M41L(7.2%)、T69P / N(5.2%)和L74V / M /我(3.9%)。NNRTI最常见的突变有:V179F/T/D(9.8%)、K103N/I/NRS(8.5%)、V106I/A(7.2%)、Y181K/C(5.8%)、V90I/GIS(5.8%)、A98G/GPR(5.2%)、V108I/KN(5.2%)、Y188C/L/D(4.6%)和F227C/L(4.6%)。
这项研究的目的是确定金沙萨treatment-naïve患者中艾滋病毒1型的遗传多样性和与抗逆转录病毒药物耐药性相关的突变流行情况。我们的人口包括61名(39.9%)男性和92名(60.1%)女性;男女性别比为1.5 (p<&0.05)。年龄段以26 ~ 35岁42例(27.45%)为主,其次为36 ~ 45岁40例(26.14%)。在我们的环境中进行的不同研究中发现了关于感染人群的相同的社会人口学信息[8,9,17,18]。
在153例患者的naïve抗逆转录病毒治疗(ART)中,我们扩增了130份(84.9%)蛋白酶区样本和145份(94.8%)逆转录酶区样本。这使我们对这两个区域的放大率高于85%。在各种条件下也可以观察到这种放大差异;由于相关基因的大小,样品在逆转录酶上比在蛋白酶上更容易扩增[19,20]。扩增失败可能是由于存在于金沙萨[11]的HIV 1型变异的扩增位点的高度多样性。它们也可能是由低病毒载量(VL)或检测限以下引起的[15,19]。事实上,VL低于3.0 log10 RNA拷贝/ml的7个样本(4.6%)均未进行任何扩增。
A亚型在金沙萨占主导地位,占研究人口的22.9%。其次为CRF02_AG(11.1%)、C (9.8%) G (9.8%) K(9.8%)、D(7.8%)、H(7.8%)和J(5.0%),见表4。我们的结果与中非国家[4,11,21]和西非邻国[4,11,20-22]发现的不同亚型相一致。除了CRF02_AG的高患病率外,我们的结果与金沙萨过去的文献报道一致[11,22- 24]。CRF02_AG的强烈存在反映了金沙萨HIV病毒的活力。这既可以源于农村人口向大都市的流动,也可以源于移居者和移民在首都的回归;从而给城市带来了更多的多样性。亚型按性别和年龄的分布情况很有趣。B型多见于男性,年龄在36 ~ 45岁和56 ~ 65岁之间。其他的大多是按性别比例和年龄排列的。 There is no significant association between HIV-1 subtypes and age or sex in our population of study.
防:蛋白酶;RT:逆转录酶;Alt:选择引物
观察到PI的几种主要耐药性;大突变和小突变。这类药物的遗传障碍很高;PI的一个主要突变可能导致对特定PI的不可逆抗性。而PI需要几个小突变的积累才能产生不可逆的抗性。观察到的主要突变有:L90M(2.0%)、D30N(1.3%)、V32I(1.3%)、V82A(1.3%)和I84V(1.3%)。最轻微的突变为:K20I/RT/M(28.1%)、L10I(27.5%)、I47R/M(6.5%)、V11I(5.2%)、V32E/L(4.6%)、G48R(3.3%)和A71T/V(2.0%)。在刚果民主共和国,pi仅用于国家项目[9]推荐的第二行。这些微小突变在ART-naïve患者中传播的高频率是令人担忧的,特别是因为它们可能导致患者在病情改变的情况下对治疗产生二次耐药性。如果一线治疗失败,几乎2.0%的患者将对二线ART方案产生不可逆耐药性,其中包括利托那韦促进洛匹那韦(LPV/r); implying a failure to this line of treatment too.
K65R突变(2.6%)与Stavudine (d4T)、Abacavir (ABC)、Lamivudine (3TC)、Tenofovir (TDF)和Didanosine (ddI)耐药有关;K70E/N/R(9.8%)与TDF相关;L74V/M/I(3.9%)带有ddI和ABC;V75I/D/L/M(18.3%)带d4T;115f(7.8%)与ABC;M184V/L/K/R(9.2%)带3TC;T215F/N/I/L(9.2%)伴齐多夫定(ZDV)和d4T[25-36]。对于NNRTI, A98G突变(5.2%)与奈韦拉平(NVP)耐药有关,E138A/K突变(3.3%)与依非韦伦(EFV)耐药有关;L100F/V (2.6%), K103N (8.5%), V106I/A/M (7.2%), Y181K/C (5.8%), Y188C/L/D (4.6%), G190R/A(3.9%)和M230L(1.3%)都与NVP和EFV的抗性有关[28,32,35,37- 40]。我们注意到,在这一点上,由于传播突变,近10%的初诊患者容易出现DRC (ZDV + 3TC + NVP)推荐的一线治疗失败。
在刚果民主共和国,对一线抗逆转录病毒产生耐药性的最严重突变的患病率不同:V75I(18.3%)、K70E(9.8%)、D67N(9.2%)、M184V(9.2%)、T215F(9.2%)、Y115F(7.8%)、M41L(7.2%)、T69P(5.2%)和L74VI(3.9%)为NRTI;V179F(9.8%)、K103N(8.5%)、V106A(7.2%)、Y181C(5.8%)、V90I(5.8%)、A98G(5.2%)、V108I(5.2%)、Y188C(4.6%)和F227C NNRTI (4.6%);和:L90M(2.0%)、D30N(1.3%)、V32I(1.3%)、V82A(1.3%)和I84Vπ(1.3%)。
我们的研究结果显示,金沙萨的1型艾滋病病毒具有很强的多样性。它揭示了病毒的异质性和动态,以及与抗逆转录病毒药物相关的初级耐药性的存在。在接受抗逆转录病毒治疗的患者naïve中检测到几种与蛋白酶抑制剂相关的主要和次要耐药性以及与逆转录酶抑制剂相关的突变。这表明,在病人开始接受治疗之前,以及在决定改变治疗方法以更好地照顾病人之前,必须进行基因分型检测。
的利益冲突
作者声明他们没有利益冲突。
作者的贡献
EK、AC和DV构思了这项研究。MPH, RK, PDM和GM参与了研究设计。EK协调数据收集。EK, AC和FS进行实验室工作,数据分析和结果解释。FS和RB参与实验室分析。DV协调实验室分析。FS, RB, AC和DV参与了结果的解释。EK起草了手稿。所有作者都参与了写作,阅读并批准了最终的手稿。
在此下载临时PDF
文章类型:研究文章
引用:Kamangu EN, Chatte A, Susin F, Boreux R, Kalala RL, et al.(2015)在刚果民主共和国金沙萨诊所就诊的Drug-Naïve HIV 1型感染者的遗传多样性和抗逆转录病毒耐药性。J HIV艾滋病1.1卷:http://dx.doi.org/10.16966/2380-5536.101
版权:©2015 Kamangu EN等。这是一篇开放获取的文章,在知识共享署名许可协议的条款下发布,该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制,前提是注明原作者和来源。
出版的历史:
所有Sc德赢娱乐国际i Forschen期刊都是开放获取的