摘要

核糖体分析(RP)是一种对给定时间内核糖体所占据的mRNA区域进行测序的技术。这一新发明的技术已经得到了很好的赞赏，因为我们对生物密码子使用偏差现象有了更深入的理解。随着微阵列和RNA测序等常用技术对基因表达的研究，RP可以提供核糖体沿编码序列的速度信息。该技术已经帮助科学家识别了许多非规范的翻译起始位点，沿着编码序列的暂停事件和停止密码子读通，这些都有助于在翻译水平上的基因表达。在这一回顾中，RP方法，结果和软件包可用的数据分析被讨论。

关键字

RNA序列;核糖体;编码;RP方法

介绍

分子生物学的中心理论认为，DNA中的遗传信息被转录为信使RNA (mRNA)，信使RNA被翻译成多肽链并折叠成功能蛋白[1]。不同于细胞内的DNA，转录组根据细胞的需要而变化。因此，通过分析完整的转录本来研究基因表达可以为了解细胞内基因的时空调控提供重要的见解。微阵列和RNA测序(RNA-seq)是两种广泛使用的技术来分析全基因组的转录本丰度。值得注意的是，基因表达的调控既发生在转录水平，也发生在转录后/翻译水平。后者不能由上述两种技术来决定。因此，为了区分mRNA分子上的哪个区域参与了主动翻译，最近发展了一种新的技术，称为核糖体分析(RP)。RP是指在翻译过程中，在特定时间内，核糖体所占据的mRNA上的核苷酸的全基因组图谱。通常多聚体图谱用于区分参与主动翻译的mRNA分子和非翻译的mRNA。但多聚体分析无法回答以下几个问题:(a)在翻译过程中，核糖体沿mRNA或跨不同mRNA分子的速度是否一致? (b)核糖体的速度与基因表达之间是否存在联系? (c) mRNA结构如何影响翻译过程中的核糖体速度? And (d) how ribosome speed during translation is influenced by the initiation and termination codons? However, the RP technique can address the abovementioned queries in a genome wide context. In table 1 the advantages of RP technique over Microarray, polysome profiling and RNA sequencing have been mentioned in brief.

微阵列	RNA-seq	多核糖体剖析	RP
利用预合成探针分析已知基因	分析全转录组	它可以通过观察多聚体来分析积极参与翻译的mRNA	分析翻译转录组
基于核酸杂交和荧光分析mRNA的表达	通过下一代测序分析mRNA的表达	RNA-seq翻译下mRNA的鉴定及表达谱分析	通过下一代测序鉴定和量化与核糖体结合的mRNA区域
无法识别新的转录本	可以识别新的转录本，可变剪接和snp吗	能识别新的转录本和选择性剪接，snp吗	能识别新的转录本snp吗
提供转录水平信息	提供转录水平信息	提供转录后信息，但不能破译核糖体沿着mRNA分子的位置	提供转录后信息和核糖体沿mRNA分子的位置信息

表1:RP技术相对于其他目前使用的技术，如微阵列，rna测序，多聚体分析的独特优势

RP方法

RP是一种可以解码翻译调控的精细水平的方法，在这种水平下，同一个转录组可以产生不同的翻译转录组。由Ingolia等人[2]引入，它是一种利用高通量深度测序技术对核糖体保护的mRNA片段进行测序的强大技术，称为“核糖体足迹”(ribosome footprint)(图1)。细胞最初用转译抑制剂(如环己亚胺)冷冻核糖体，以在给定条件下捕捉转译状态快照为基础。然后用非特异性核酸酶如RNase或微球菌核酸酶(MNase)裂解固定的细胞，降解未受保护的mRNA片段，留下完整的核糖体占据的片段约28-30个核苷酸。衍生的小片段用深度测序方法处理以获得核糖体足迹。RP是一种高度敏感的技术，通过分析mRNA分子的核糖体足迹密度，甚至可以以特定的定位方式检测罕见的翻译信息。将这些足迹映射到全基因组核糖体占用概况，最终解码核糖体在核苷酸水平上的位置。该技术的起源较近，目前已被广泛接受和应用于不同生理条件下不同生物的核糖体足迹图谱。最近报道了Ingolia等人[2]对原始方案的几个优化[4- 7]。迄今为止，只有Illumina(加利福尼亚州，美国)提供品牌名为TruSeqRibo Profile的商业试剂盒，用于哺乳动物和酵母系统中的RP。 One of the difficulties of the technique is to avoid contamination from the rRNA. Effective control of rRNA fragments in RP experiments is essential, because the background noise due rRNA fragments can reduce the efficiency of detecting the signals from mRNA. Therefore the commercially available kit like Ribo-Zero rRNA depletion kit (Epicenter) is generally used for removal of rRNA contaminating fragments in RP experiments. Recently, double strand specific nuclease was used for rRNA depletion in different species [8].

RP可以洞察不同层次的翻译

核糖体结合在mRNA的核糖体结合位点(RBS)，第一个氨基酸的加入标志着翻译启动的开始。启动核糖体机制继续翻译，直到到达终止密码子，即延长，最后由释放因子释放新生多肽终止翻译。现在，很明显，RP提供了关于三个不同水平的平移动力学的新信息，即起始、延伸和终止，这将在下面讨论。

翻译起始位点的映射

在RP技术出现之前，定位mRNA上定义开放阅读框(ORF)的翻译起始位点或起始位点(TIS)并不容易。测量或绘制平移起始位点。为了定位翻译起始位点，三尖杉木碱和乳霉素药物被用来阻断核糖体的翻译起始点，或者通过嘌呤霉素和环己亚胺[9]的阻断来实现翻译的提前终止。全球翻译起始测序(GTI-seq)使用E位点抑制药物环己亚胺(CHX)和乳酸霉素(LTM)，通过分析哺乳动物细胞[10]中的核糖体足迹，识别转录组中noble TIS。由于GTI-seq无法对TIS进行量化，Gao等人[11]采用了一种称为定量翻译起始测序(QTI-seq)的新技术，该技术使用LTM冷冻起始核糖体，然后使用嘌呤霉素(PMY)处理耗尽伸长核糖体来量化和绘制TIS。从最近主要针对TIS的RP实验来看，很明显，翻译起始机制远比之前认为的复杂。RP实验记录了5个ʹUTR位点的非aug开始或起始数量的急剧增加[12-14]，这些非aug翻译起始大多发现于短的上游orf (uORF)。短的uORF存在于基因的上游区域，由于其体积太小而不能产生功能蛋白产品，而通过抑制下游蛋白编码基因或主要ORF[15]的翻译而发挥调节作用。非上游调控ORF (nORF)在主ORF中也有来自RP实验的启动信号。对核糖体足迹数据的分析显示，从长时间分散的非编码RNA (lincRNA)[16]中翻译出了功能不活跃的新orf。 In bacteria, Tetracycline mediated inhibition of ribosomes by blocking ribosomes at initiation sites effectively maps several new TIS using RP [17].

延伸过程中的核糖体动力学

通过RP技术，在翻译延伸期间的核糖体占据区域被映射。因此，与核糖体保留较短时间的mRNA区域相比，核糖体谱图中核糖体保留较长时间的mRNA区域被更多地表示。前一个区域代表翻译延伸期间核糖体保留较长时间的区域翻译速度较慢（也称为核糖体暂停位点），这可能是由于非最佳密码子的出现，或由于mRNA二级结构，或由于抗Shine Dalgarno序列或新生肽与核糖体的相互作用，存在含有脯氨酸、丝氨酸和组氨酸等氨基酸的延伸[18,19]etc，而后一个区域表示由于存在最佳密码子或缺少上述mRNA或生长多肽的阻碍因素，翻译速度较高。核糖体暂停对于共翻译蛋白质折叠非常重要[20]。

生物体内同义密码子的差异使用称为密码子使用偏倚(CUB)[21]。通过比较基因组内高表达基因和低表达基因的同义密码子使用情况，科学家预测，在翻译[22]时，某些同义密码子的解码速度比其他同义密码子快。这种同义密码子在翻译速度上的差异最近得到RP的实验证据[23-25]。用密码子操纵荧光素酶mRNA片段进行实验Neurosporacrassa结果表明，密码子使用与翻译动力学之间存在相关性，即最优密码子增加了翻译延伸速度，而非最优密码子降低了翻译伸长率(图2)。非最优密码子诱导的核糖体暂停可导致衍生蛋白的共翻译折叠，这是维持蛋白[26]结构和功能的重要机制。在一个较早的研究中，密码子优化N.crassa生物钟基因频率(frq)，发现对无序区域进行优化可以得到结构上不同且无功能的蛋白质产物[25,27]。

图1:RP方法的示意图表示
核糖体分析的不同步骤如下:(i)从细胞中分离核糖体结合的mRNA;(ii).由RNase消化，使核糖体结合的RNA仍然受到保护，酶可接近的RNA区域被消化;(iii)分离核糖体结合的RNA，合成cDNA，然后与适配器连接，并进行下一代测序。

图2:两个mRNA分子的蛋白质合成和核糖体印迹的示意图，即包含所有最佳密码子的mRNA1和包含由黑线划分的最佳和非最佳密码子的mRNA2。在这两种情况下，上半部分显示合成蛋白的翻译核糖体，下半部分显示核糖体足迹密度。在mRNA1中，在mRNA中存在最佳密码子，诱导快速翻译。在mRNA2中，由于在某些密码子中存在同义突变，导致核糖体暂停和共翻译折叠。在mRNA中导致非最佳密码子的同义突变在同源tRNA分子的这些位置上显示出更多的核糖体足迹和核糖体停顿。

终止翻译和终止密码子通读

终止密码子包含任何给定蛋白质合成事件的终止信号。但在某些情况下，这些终止密码子不会终止蛋白质合成，因此，部分或整个3ʹ非翻译区域也会被翻译，产生带有扩展c端区域的蛋白质变体。已知终止密码子读通发生在一些病毒中[28,29]。RP技术有助于破译酵母中许多新的停止密码子读取事件，果蝇和哺乳动物(30 -)。在3个ʹ转录本末端的核糖体足迹中报道了核糖体框架移位导致的停止密码子通读黑腹果蝇[31]。终止密码子通读赋予了后续蛋白质产物改变的功能和定位，因此在物种进化中也起着重要作用。

足迹中A和P位点的测定

核糖体足迹长度一般为28个核苷酸，但有些足迹不是标准长度。由于碳足迹长度的异质性[33-35]，很难设计一种方法或软件来预测碳足迹中受体(a)和肽基(P)位点的位置。在此之前，一个位点是通过将足迹的5 '端与转录本的起始位点或足迹的中心核苷酸对齐而确定的，被认为是一个位点[9]。Martens et al.[36]最近的一项研究，基于丝氨酸、组氨酸、脯氨酸等特定氨基酸的暂停位点，确定了核糖体足迹中的A和P位点位置。在这项研究中，在足迹中发现了真核生物和原核生物的A和P位点。在酵母中，P和A位点在5 '端下游预测了4和5个密码子，而在大肠杆菌中，3 '端上游预测了5和4个密码子。从上述研究可以明显看出，某些密码子的暂停趋势可以指示一个核糖体足迹中的A和P位点。

细胞器核糖体图谱

细胞器如线粒体和叶绿体基因表达也构成生物体生存能力的完整部分。这些细胞器有自己的蛋白质合成机制，这更类似于原核生物而不是真核生物。由于细胞器核糖体不同于细胞质核糖体，常规核糖体分析可能跳过细胞器核糖体保护片段。Rooijers等人的[37]成功地优化了线粒体RP的方案，以描述引发线粒体翻译的野生型和疾病。为了解酵母线粒体生物发生[38]的动态，还进行了线粒体RP研究。同样，利用核糖体分析[39]在玉米叶绿体分化的不同阶段进行了叶绿体RP分析。随着实验程序和生物信息学分析技术的改进，RP技术将有助于了解线粒体和叶绿体的翻译动态。

RP数据分析软件包

RP被分子生物学家视为揭示翻译调控的一项有前途的技术。RNA-seq平台包含大量短读数据，因此分析RP数据对于生物学家来说仍然是一项艰巨的任务。随着RP技术的日益普及，开发了若干软件包和管道，用于对RP实验产生的数据进行定量和定性分析[41-44]。尽管这些管道由于读取时间很短而最小化了许多固有问题，但从具有不同5'和3'UTR区域的类似转录本中获得的足迹无法以100%置信水平绘制。核糖锥化是最近发展起来的一种管道，它可以简单有效地利用三重态周期预测蛋白质编码ORF。Ribo Tools是一个开源的质量监控工具箱，可从Galaxy获得，其开发目的是通过精确确定RP数据中的密码子占用情况、翻译歧义性和终止密码子读取来最小化不确定性[42]。表2中还提到了其他几个RP数据分析管道。

软件包	脚本	可用性	发布下	参考
RiboTaper	R	软件/ RiboTaper_126 / https://ohlerlab.mdc-berlin.de/	Github	Calviello等，[3]
riboseqR	R	http://bioconductor.org/packages/release/bioc/ html / riboSeqR.html	Bioconductor	钟等，[8]
RiboTools	Python 2.7	https://testtoolshed.g2.bx.psu.edu/view/ rlegendre / ribo_tools	星系	Legendre等，[42]
PROTEOFORMER	Pearl5	http://www。biobix.be / proteoformer	星系	克拉普等人[41]
GWIPS-viz		http://gwips.ucc.ie/	UCSC基因组浏览器	米歇尔等，[9]

表格2：可用来分析RP数据的软件包和管道

结论

RP采用RNAseq技术来理解与平移起始、延伸和终止相关的复杂性或动力学。利用RNA seq与RP并行进行转录组测序是了解特定条件下给定生物体转录和翻译动态的首选方法。在不久的将来，我们将进一步了解不同生物核糖体的密码子-反密码子相互作用的差异。具有更简单的工作流程和自动化分析管道的商用套件的可用性，肯定会帮助科学家描绘不同的生物体，并将增强我们对翻译动力学的理解。

工具书类

1. Crick FHC(1958)蛋白质合成研究。计算机协会。Soc Exp Biol 12: 138-163 [Ref。］
2. Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS(2009)使用RP进行核苷酸解析翻译的体内全基因组分析。科学324:218 - 223。［Ref。］
3. Calviello L, Mukherjee N, Wyler E, Zauber H, Hirsekorn A, et al.(2015)一种光谱分析方法用于检测高分辨率RP数据中主动翻译的开放阅读框架。自然方法13:165-170。［Ref。］
4. Miettinen TP, Bjorklund M(2015)修饰RP揭示了来自3 '非翻译区域的核糖体保护mRNA片段的高丰度。核酸Res 43: 1019-1034。［Ref。］
5. Reid DW, Shenolikar S, Nicchitta CV(2015)简单廉价的RP分析mRNA翻译。方法91:69 - 74。
6. Nakahigashi K, Takai Y, Kimura M, Abe N, Nakayashiki T, et al.(2016)利用四环素抑制RP进行翻译起始位点的综合鉴定。DNA Res 23: 1-9。［Ref。］
7. Weinberg DE, Shah P, Eichhorn SW, Hussmann JA, Plotkin JB，等(2016)改进的核糖体足迹和mRNA测量为酵母翻译的动力学和调控提供了见解。细胞代表14:1787-1799。［Ref。］
8. Chung BY, Hardcastle TJ, Jones JD, Irigoyen N, Firth AE, et al. (2015) RP中双特异性核酸酶的使用和一个用户友好的Ribo-seq数据分析软件包。RNA 21: 1731 - 1745。［Ref。］
9. 核糖体分析:基因组范围内蛋白质合成的高分辨率监测器。威利组间Rev RNA 4: 473-490。［Ref。］
10. 李胜，刘波，李胜，黄淑霞，沈波，等。(2012)基于单核苷酸分辨率的哺乳动物细胞翻译起始位点的全局定位。美国国立科学院科学研究所109:E2424-E2432。［Ref。］
11. Gao X, Wan J, Liu B, Ma M, Shen B, et al.(2015)体内核糖体启动的定量分析。Nat方法12:147 -153。［Ref。］
12. Zhang F, Hinnebusch AG(2011)具有非aug起始密码子的上游ORF在体内被翻译，但对于GCN4 mRNA的翻译控制是必不可少的。核酸Res 39: 3128-3140。［Ref。］
13. Van Damme P, Gawron D, Van Criekinge W, Menschaert G (2014) n端蛋白质组学和RP提供了小鼠和人类翻译起始的替代景观的综合观点。细胞蛋白质组学13:1245-1261。［Ref。］
14. 潘华，赵旭，张旭，Abouelsoud M，孙军，等。(2015)人与小鼠负延伸因子- b非aug起始密码子的翻译起始。PLoS One 10: e0127422。［Ref。］
15. Jackson R, Standart N (2015) RP的惊人力量。RNA 21: 652654。
16. Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS(2009)使用RP进行核苷酸解析翻译的体内全基因组分析。科学324:218 - 223。［Ref。］
17. Nakahigashi K, Takai Y, Kimura M, Abe N, Nakayashiki T, et al.(2016)利用四环素抑制RP进行翻译起始位点的综合鉴定。DNA Res 23: 1-9。［Ref。］
18. Li GW, Oh E, Weissman JS(2012)细菌中抗闪-达尔加诺序列驱动翻译暂停和密码子选择。自然484:538 - 541。［Ref。］
19. Woolstenholme CJ, Guydosh NR, Green R, Buskirk AR (2015) RP在缺乏EFP细菌中翻译停顿的高精度分析。细胞代表11:13 -21。［Ref。］
20. Ray SK, Baruah VJ, Satapathy SS, Banerjee R(2014)共翻译蛋白折叠揭示了低表达基因编码序列中同义密码子的选择性使用。J Genet 93: 613-617。［Ref。］
21. Satapathy SS, Powdel BR, Buragohain AK, Ray SK(2016)细菌中同义密码子选择最优密码子的差异。DNA研究》(Ref。］
22. Ray SK，Goswami I（2016）同义密码子在翻译延伸速度方面不相同。当前Sci 110:1612-1614。[Ref。］
23. aghe D, Martinez-Gomez NC, Drummond DA, Marx CJ (2013) Good密码子，bad transcript:一个关键酶同义突变导致基因表达和适应度大幅降低。摩尔生物进化30:549-560。［Ref。］
24. (2015)密码子使用影响翻译伸长的局部速率以调控共译蛋白折叠。59号细胞:744-754。［Ref。］
25. 周敏，郭军，查静，蔡敏，陈绍华，等。(2013)非最佳密码子使用影响时钟蛋白FRQ的表达、结构和功能。自然495:111 - 115。［Ref。］
26. Miettinen TP, Bjorklund M(2015)修饰RP揭示了来自3 '非翻译区域的核糖体保护mRNA片段的高丰度。核酸Res 43: 1019-1034。［Ref。］
27. (in chinese with chinese abstract)[周敏，王涛，付军，肖刚，刘艳(2015)非最优密码子使用对蛋白质结构的影响。摩尔微生物97:974-987。［Ref。］
28. Qβ外壳蛋白顺反子UGA终止信号的自然解读。Nat New Biol 234: 206-209。［Ref。］
29. 在一些植物病毒中，UAG终止密码子泄露的信号包括两个下游密码子。中华医学会生物学及分子生物学分会。［Ref。］
30. 陈志强，陈志强，陈志强，等。酿酒酵母终止密码子读通基因的研究进展[j]。核酸Res 31: 2289-2296。［Ref。］
31. Dunn JG, Foo CK, Belletier NG, Gavis ER, Weissman JS (2013) RP揭示了果蝇黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中普遍存在和受调节的终止密码子读取。ELife 2: e01179。［Ref。］
32. Stiebler AC, Freitag J, Schink KO, Stehlik T, Tillmann BA, et al.(2014)在短uga终止密码子背景下的核糖体读通触发了真菌和动物代谢酶的双重定位。PLoS Genet 10: e1004685。［Ref。］
33. 核糖体分析:从单密码子到基因组规模翻译的新观点。Nat Rev Genet 15: 205-213。［Ref。］
34. Guydosh NR, Green R (2014) Dom34在3’非翻译区域挽救核糖体。细胞156:950 - 962。［Ref。］
35. Lareau LF, Hite DH, Hogan GJ, Brown PO(2014)通过测序核糖体保护mRNA片段揭示翻译延伸周期的不同阶段。ELife 3: e01257。［Ref。］
36. Martens AT, Taylor J, Hilser VJ(2015)通过核糖体图谱数据的长度分析揭示核糖体A和P位点。核酸Res: 43: 3680-3687。［Ref。］
37. Rooijers K, Loayza-Puch F, Nijtmans LG, Agami R(2013)核糖体图谱揭示了正常和疾病相关线粒体翻译的特征。Nat Commun 4:1 -8。［Ref。］
38. Couvillion M, Shipkovenska G, Tye B, Churchman LS(2015)线粒体核糖体图谱揭示了酵母线粒体生物发生中的快速和动态翻译调控。FASEB杂志29:1。［Ref。］
39. Chotewutmonti P，Barkan A（2016）玉米叶绿体分化过程中叶绿体翻译的动态。PLoS Genet 12:e1006106[Ref。］
40. michael AM, Fox G, Kiran A, De Bo C, O’connor PB, et al. (2014) GWIPSviz:开发一个核糖序列基因组浏览器。核酸Res 42: D859-D864。［Ref。］
41. (2015) PROTEOFORMER:通过RP和MS整合的深层蛋白质组覆盖。核酸Res 43: e29。［Ref。］
42. Legendre R, Baudin-Baillieu A, Hatin I, Namy O (2015) RiboTools:用于RP定性分析的Galaxy工具箱。生物信息学31:2586 - 2588。［Ref。］
43. Chung BY, Hardcastle TJ, Jones JD, Irigoyen N, Firth AE, et al. (2015) RP中双特异性核酸酶的使用和一个用户友好的Ribo-seq数据分析软件包。RNA 21: 1731 - 1745。［Ref。］
44. Calviello L, Mukherjee N, Wyler E, Zauber H, Hirsekorn A, et al.(2015)一种光谱分析方法用于检测高分辨率RP数据中主动翻译的开放阅读框架。自然方法13:165-170。［Ref。］

在此下载临时PDF

条信息

文章类型:评论文章

引用:核糖体分析:一种对编码序列上的核糖体翻译动力学的深入了解:一篇综述文章。Int J Mol Genet Gene Ther 2(1): doi http://dx.doi.org/10.16966/2471-4968.107

版权:©2016 Agarwala N，等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

收到日期:2016年9月30日

接受日期:2016年10月25日

发表日期:2016年10月31日