摘要

本研究旨在了解编码家蚕变态角质层蛋白CPR95的角质层蛋白基因的调控机制。CPR95的发育特征与E74A相似。20E脉冲处理诱导的E74A和CPR95转录本在体外．因此，结果表明CPR95与E74A具有相关性。CPR95上游E74A结合位点的定点突变和报告基因检测表明CPR95与E74A具有很强的相关性。通过基因组信息和瞬时报告基因分析，我们证实了CPR95的表达调控机制。结果表明，CPR95在家蚕蛹前阶段的瞬时表达受蜕皮反应转录因子E74A的调控。

关键字

时间表达；表皮蛋白；蜕皮激素脉冲；定点突变；基因枪

介绍

昆虫角质层是一种具有三个功能区的多层结构：表皮、前表皮和内表皮，它们在蛋白质组成、结构特征和生理功能方面存在差异[1]。昆虫角质层的性质取决于角质层蛋白质的结构，不同的角质层类型在机械性能上表现出明显的差异，这些差异与单个蛋白质的特性有关[2]。昆虫角质层的性质在物种和阶段上存在差异，这种差异是由角质层蛋白质的结合引起的。表皮蛋白质的特征是重复出现一些主要由疏水残基组成的小基序[2]。因此，昆虫在每个幼虫蜕皮时形成新的角质层，在幼虫到蛹或蛹到成虫转化时形成不同类型的角质层。昆虫角质层主要由几丁质和角质层蛋白质组成，角质层蛋白质决定了昆虫角质层的性质，导致了昆虫角质层的多样性。

已有报告[3-12]角质层蛋白的蜕皮激素反应性表达。它们的大多数表达是由蜕皮甾体脉冲诱导的；表达需要20E的存在和去除[9,11,13]。这种情况与蜕皮周围阶段的情况相似。很少有报告称20E上调[7,9,10]因此，具有不同发育特征的表皮蛋白基因是由不同类型的蜕皮激素信号诱导的，最近的一篇综述[14]对此进行了描述。

蜕皮酮反应转录因子已被证明可以确定表皮蛋白基因[4]的表达。βFTZ-F1增加了表皮蛋白基因BMWCP5的启动子活性，该基因在化蛹前后表达，蜕皮甾滴度在其峰值后下降[15,16]。BR-C Z2激活了BmorCPG11启动子独立于其他蜕皮酮反应转录因子[6]。除上述转录因子外，EcR还与表皮蛋白基因的启动子区结合，BMWCP10，并激活其转录[15]。BHR3受调节BmorCPH5，且其转录峰出现时间早于对照组BMWCP5［4］．因此，转录因子与靶表皮蛋白基因上游结合，使角质层蛋白基因在翅片和表皮中分期特异性表达。因此，表皮蛋白基因是蜕皮反应转录因子的靶点，如上所述。这些研究利用基因组数据库进行，并假设蜕皮酮响应转录因子E74A调控CPR95的表达。

材料和方法

实验动物

杂交品系b .森在25°C 12 h光照下饲养:12 h暗光周期。5龄幼虫第6天开始游荡，3 d后化蛹，10 d后成虫封闭。4 ~ 5龄幼虫蜕皮、游荡、化蛹和羽化发育阶段对应的时间(以天为单位)分别为V0、W0、P0和A0。化蛹前3天按W1-W3设计。W3期分为W3早期(W3E)、W3中期(W3M)和W3晚期(W3L) 3个阶段。W3分阶段是根据腿部[3]缩短的时间和可见长度来确定的。

在体外翅盘培养

制备和培养W2期幼虫的翅盘在体外如前所述[4]。根据之前的报道[17]，培养在25°C无菌条件下进行。

定量逆转录聚合酶链反应

为检测表皮蛋白基因和转录因子的表达水平，参照文献[4]进行总RNA和cDNA合成。根据生产商的协议，使用ABI7500 real-time PCR仪(Applied Biosystems)，使用Fast Start Universal SYBR Green Master (Roche)进行定量逆转录-PCR。使用核糖体蛋白S4基因对每个样本的数据进行归一化。利用Primer3软件(http://frodo.wi.mit。edu/)，如表1所示。

表1:引物列表

质粒构建与诱变

根据前期[3]报道，采用PCR扩增CPR95上游区域(-2040 ~ +18和-136 ~ +18)。扩增的DNA片段被消化尚驰和NheI然后连接到尚驰和NheI荧光素酶报告质粒pGL3-basic产生构建体的位点Renilla荧光素酶报告(PhRGhsp以果蝇热休克蛋白70启动子[18]作为归一化对照[11]。以CPR95-136质粒为模板，用Quick-Change TM SiteDirected Mutagenesis Kit (Stratagene)进行CPR95单突变体(-104/-102)E74Amut。用Pfu DNA聚合酶扩增20毫微克质粒DNA，然后用酶切法对原代质粒进行酶切DpnI．将突变质粒导入XL1-Blue超能力细胞。诱变反应是根据制造商的说明进行的。每个突变的引入都通过测序得到证实。用于构建和突变的寡核苷酸引物如表1所示。

荧光素酶瞬时表达试验

报告细胞在翼盘中的瞬时表达如前所述[4]。按照厂家说明，12.5 mg金颗粒(直径1.0µm)包被质粒DNA (pgl3来源的载体各50µg和5µg phRG-hsp)。使用粒子枪(Bio-rad)将报告结构引入翼盘。轰击是在150 psi(每平方英寸磅)的氦压力下进行的。轰击后，在Grace 's培养基(Invitrogen)中(含或不含2µg/ ml 20E (Sigma))， 25°C下培养48 h。培养方法已经描述过[17]。培养48 h后，用PBS冲洗翅片2次。将组织置于25µl 1x报告细胞被动裂解缓冲液(Promega)中悬浮，在液氮中冷冻/解冻5个循环后，上清液在4°C中平衡1小时。收集上清液在4°C中12,000 g离心2分钟。荧光素酶报告基因分析是使用双荧光素酶报告基因分析系统(Promega)在光度计(Perkin Elmer)中根据制造商的协议进行的。荧光素酶活性归一化至肾细胞荧光素酶活性水平。 All experiments were performed at least five times. The results were expressed as the mean ± S. E. M., and significance was set at p <0.05.

组织学研究

解剖包含头部、胸部和腹部（图1）的表皮片，在Carnoy固定液中固定2小时，然后脱水并包埋在石蜡中。7微米切片在二甲苯中脱蜡，通过酒精系列再水化，然后用自来水洗涤15分钟。洗涤后，进行周期性酸转移（PAS）进行反应[19]以检测衍生自BM的多糖。然后将载玻片在Lillie溶液中浸泡10分钟（100 ml KIO_4.+ 0.4 ml 60% HNO_3.)，在希夫试剂中放置30分钟，然后在H_2.所以_3.溶液[5ml的1N HCl + 5ml的10% K_2.s_2.O_5.+ 100毫升H2 O(3×1分钟),并与自来水冲洗10分钟。然后与苏木精染色的部分为5分钟,使退色通过浸泡在酸醇(70%盐酸乙醇+ 1毫升1 n)为1分钟,并在运行的自来水洗了15分钟。洗后,他们在一系列分级脱水乙醇(70%,90%,95%,和绝对的),用二甲苯清理，并使用加拿大香脂和盖滑块安装。切片在光学显微镜下观察(Olympus BX50)，并使用DP-BSW软件记录。

图1：以下物质W3中期幼虫。A.箭头表示胸廓表皮标本解剖位置。B.箭头指示腹部表皮(A)、翼盘(W)、头囊(H)标本的位置。

结果

CPR95在鸟类翅膀盘中表达的表皮蛋白基因中表现出不同的表达谱家蚕

角质层蛋白基因CPR95(图2A)在五龄幼虫中表达家蚕，与E74A相似。E74A是蜕皮激素应答的转录因子之一，在W3L期达到表达高峰，此时蛹前期血淋巴蜕皮激素水平下降。因此，为了了解E74A和CPR95的表达谱，我们对E74A和CPR95的表达进行了分析。

图2：表皮蛋白基因CPR95 (A)和蜕皮酮反应转录因子E74A (B)的发育概况。从翅片中提取RNA，反转录为cDNA，用于实时荧光定量PCR。值代表三个独立实验结果的平均值±S.E.M.。

CPR95和E74A在翼片上类似

CPR95的表达在W3E期后迅速增加，在W3L期达到峰值，当血淋巴中的蜕皮甾体滴度下降时，其迅速下降（图2A）。E74A转录物在W3E期后迅速增加，在W3L期达到峰值，然后迅速下降（图2B），与CPR95的表达相似。当血淋巴蜕皮甾体滴度降低时，W3L期后E74A和CPR95转录物迅速减少（图2）。因此，检查了治疗后去除蜕皮激素（蜕皮激素脉冲）的效果。去除激素后E74A转录物增加（图3A）添加放线菌酮时未观察到。去除20E后，CPR95的转录本也显示出类似的增加（图3B）结果表明，去除20E后，两个基因的转录均被激活。两个基因均表现出相似的蜕皮素脉冲响应性；去除20E后，转录被诱导。从表达谱的相似性来看，CPR95是由蜕皮激素应答转录因子E74A。因此，我们搜索了CPR95的上游基因组序列，发现了CPR95基因上游两个假定的E74A结合位点[4]（图4）。然后，我们应用报告子分析法对与E74A相关的CPR95启动子进行分析。

图3:蜕皮酮脉冲处理对E74A (A)和CPR95 (B)的影响。从翅片中提取RNA，反转录为cDNA，用于实时荧光定量PCR。W2阶段的翅片在含有20E的培养基中孵育12小时，然后转移到含有或不含环己亚胺的无激素培养基中(50µg/ml)。值代表三个独立实验结果的平均值±S.E.M.。星号表示学生t检验p<0.05显著性。

图4:不同长度的CPR95启动子活性5^/从侧翼地区。荧光素酶报告基因构建物具有不同长度的5^/-将CPR95野生和突变结构的侧翼轰击到W2期的翼盘中，并在有或没有2µg/ml 20E的情况下培养48小时。数字指假定转录起始点的核苷酸位置。荧光素酶活性标准化为Renilla荧光素酶活性。荧光素酶分析在五个times和结果报告为平均值±S.E.M.萤火虫/雷尼拉比率。

报告者分析显示CPR95和E74A的相关性

通过20E脉冲处理，含有CPR95上游2040 bp区域的质粒显示了更高的启动子活性(图4)。含有推测的E74A结合位点的缺失结构(CPR95-136)也显示了类似的活性(图4)。因此，我们使用CPR95-136对该结合位点进行了突变。结果显示启动子活性降低(图4)。未添加20E的培养基中CPR95启动子区荧光素酶活性降低到添加20E的培养基中。这表明突变消除了被认为是E74A效应的20E脉冲效应。这一结果强烈提示CPR95的启动子活性受E74A调控。

讨论

本文报道了5龄幼虫翅片表皮蛋白基因的不同表达模式，阐明了5龄幼虫翅片表皮蛋白基因的调控家蚕通过基因组数据库[4,11,15,20]在这里，我们阐明了相关的蜕皮激素应答转录因子。不同表皮蛋白基因的启动子区域被EcR和不同的蜕皮激素应答转录因子βFTZ-F1、E74A、BR-C Z2和BR-C Z4结合和激活，导致它们的不同表达模式。这些研究通过基因组信息和使用翼盘的瞬时报告分析。

在本研究中，我们发现了一个表皮蛋白基因CPR95，该基因的转录本在W3E阶段后迅速增加，在W3L达到顶峰，然后迅速下降。大多数表皮蛋白基因在化蛹前后出现表达高峰[21]，βFTZ-F1、BR-C和E74A等转录因子调控这些表皮蛋白基因的表达[4-6,15]。E74A是唯一与CPR95发育特征相似的转录因子。CPR95是由蜕皮酮脉冲诱导的，并且对E74A表现出类似的蜕皮酮反应(图3)d .腹[22],m . sexta[23],家蚕(4、24)。在本研究中，我们发现了CPR95和E74A的相关性。CPR95启动子受到蜕皮酮脉冲处理的强烈调控，而E74A结合位点近端突变使CPR95启动子消失(图4)。结果表明E74A与CPR95具有很强的相关性。结合qRTPCR结果，我们认为CPR95的转录受E74A的调控。提示对蜕皮酮的反应决定了转录因子及其相关表皮蛋白基因的表达时间，导致了CPR95和CPR95的差异BmorCPH5表达[4]。据报道，含有R&R残基的角质层蛋白质[25]与几丁质结合[26,27]，并将构成原表皮。尽管一些非R&R角质层蛋白质具有角质层结合能力[28,29]，但据报道，大多数角质层蛋白质不与几丁质结合[30,31]大多数表达在翅盘中的角质层蛋白基因在化蛹前通过蜕皮素脉冲信号转录，并且大多数具有R&R残基。CPR95具有R&R残基，转录时间晚于BmorCPH5［4］．

的表达BR-Z2,βFTZ-F1和e - 74 a头部、胸部和腹部表皮分别明显[5,6]。组织学照片和基因表达模式显示，不同的蜕皮反应转录因子在表皮的不同区域表达，从而决定了表皮蛋白基因的表达(图5)。因此，这些蜕皮反应转录因子对其靶基因具有调控作用，其一系列的表达将导致昆虫的变态。

图5:表皮三个不同区域的显微照片。三个区域的整合呈现出不同的特征。观察到不同类型的表皮(ep)和前表皮(pr)。细胞核(N)和基底膜位于基底区。

本研究结果表明，表皮蛋白基因是按照其调控转录因子的顺序进行序列表达，从而产生一系列连续的表皮蛋白，从而构建表皮、外表皮和内表皮。这些不同类型的角质层蛋白结合形成蛹的角质层，本研究结果表明蜕皮酮反应转录因子决定了角质层蛋白基因表达的空间。基因组信息和瞬时报告基因分析将进一步阐明昆虫表皮构建的机制。

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条信息

文章类型:研究文章

引用:Ali MS, Mishra B, Polan MS, Ninagi O, Swapon AH，等(2016)基因组分析基础上的一种角质层蛋白调控研究。Int J Mol Genet Gene Ther 2(1): doi http://dx.doi.org/10.16966/2471-4968.104

版权:©2016 Ali MS等。这是一篇根据知识共享署名许可证条款发行的开放获取文章，允许在任何媒体中不受限制地使用、发行和复制，前提是原始作者和来源均已获得授权。

出版历史：

收到日期:2015年12月16日

接受日期:2016年1月05

发表日期:2016年1月10