摘要

在西方国家，食道和胃食管交界区(GEJ)腺癌的发病率呈上升趋势。为了确定新的诊断和治疗策略，需要更好地了解与胃癌相关的分子畸变。我们检测了HOX转录本反义基因间RNA (HOTAIR)的表达、调控和预后价值，HOTAIR是HOX簇中的一种长链非编码RNA (lncRNA)。我们收集了40例胃、食道或GEJ腺癌手术患者的活组织切片。分析可能具有预后价值的临床病理变量，以确定独立的预后因素。采用qRT-PCR检测HOTAIR在人胃腺癌细胞中的表达，利用xCELLigence阻抗分析实时跟踪细胞增殖和迁移。HOTAIR在切除的胃、食管和GEJ腺癌中的高表达是预后不良的独立预测因素。我们发现HOTAIR过表达可使HFE145胃细胞增殖加倍。miR-449和Vorinostat或siRNA抑制HDACs (miR-449靶点)降低了HOTAIR的表达在体外．HOTAIR表达未受控制通过miR-449对p53的调控。我们提出了HDAC作为HOTAIR表达调控因子的作用。

关键字

胃癌;热空气;HDAC;mir - 449;非编码RNA

介绍

尽管全球胃癌发病率有所下降，但在全球范围内，胃癌仍是第四大最常见的恶性肿瘤，也是导致男性和女性癌症死亡的第二大原因[1,2]。在西方国家，食道及胃食管交界区(GEJ)腺癌的发病率呈上升趋势。虽然食管、胃和GEJ腺癌的临床预后逐渐改善，但患者的生存期仍较差，5年总生存期为20%[3]。因此，有必要更好地了解与胃癌相关的分子畸变，以确定新的诊断和治疗策略。

非编码RNA (Non-coding RNAs, ncRNAs)是人类RNA的主要组成部分，并调节基因表达[4,5]。微rna (miRNA)是一种21-25个核苷酸的ncrna，由于其在许多人类恶性肿瘤[6]的发病机制中的作用，在过去的十年中受到越来越多的关注。最近，长(>100核苷酸)ncRNAs (lncRNAs)也被鉴定为基因转录调控因子[4,5]。其中一个lncrna是HOX转录本反义基因间RNA (HOTAIR)，它转录自HOXC位点[7]。HOTAIR结合多梳抑制复合物2 (polycomb- suppression complex 2, PRC2)并将其定位到HOXD位点，抑制HOXD基因表达。PRC2是一个组蛋白H3赖氨酸27 (H3K27)甲基化酶，参与发育基因沉默和癌症进展[8,9]。HOTAIR在癌细胞中的过表达似乎重新编程了从上皮细胞到间充质胚胎成纤维细胞的多梳结合谱，这与转移进展[10]的高风险相关。

胃癌的发生与HOX基因及HOX簇内miRNAs的异常表达有关[11-13]，部分原因是表观遗传改变[14,15]。总的来说，这表明在胃癌发生过程中，HOX簇的基因表达有普遍的变化。因此，我们想要检测HOX簇内编码的lncRNA HOTAIR在胃癌活检中的表达和预后价值，以及它的调控。

材料和方法

病人的选择和活检的收集

该队列研究包括2008年7月至2009年11月因胃腺癌、食管腺癌或GEJ手术的患者。所有个人都提供了知情的书面同意书。丹麦伦理委员会批准收集活检标本（期刊号H-B-2008-049），丹麦数据保护局批准建立生物库（期刊号2008-41-2138）。活检取自肿瘤组织和邻近正常组织。在与RNA提取相邻的活检中评估肿瘤含量，范围在35%到70%之间。从医学图表和病理报告中提取预定义的临床和副临床数据。

细胞培养

人sn638胃腺癌细胞在RPMI 1640培养基(Invitrogen, Carlsbad, CA)中培养，正常胃上皮细胞系HFE145(由Howard University, Washington D.C.教授Hassan Ashktorab提供)在DMEM培养基(Invitrogen)中培养。两种培养基分别在37ºC和5% CO2湿化气氛中添加10%胎牛血清(FBS) (Invitrogen)、100µg/ml链霉素和100 U/ml青霉素(Invitrogen)。HOTAIR在SNU638细胞中的表达是HFE145细胞的1000倍(图S2)，因此我们在HFE145细胞中进行过表达研究，而在SNU638细胞中进行敲除实验。

在体外药物治疗

刺激前1天，500.000细胞接种于6孔板。在RNA提取前，用100µM 5- fu (Hospira Nordic AB, Stockholm, Sweden)、10µM Nutlin-3 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)或2.5µM、5µM、10µM Vorinostat (Patheon Inc.， Mississauga, Ontario, Canada)处理细胞24小时。将Nutlin-3和Vorinostat溶于二甲基亚砜(DMSO)中。2.5µM Vorinostat处理的最终DMSO百分比为0.0025%，5µM Vorinostat处理的最终%为0.005%，10µM Vorinostat或Nutlin3处理的最终%为0.01%。阴性对照细胞用0.01% DMSO处理。所有处理均为3个重复。

转染

转染前，500.000个SNU638细胞接种在6孔板中24小时。使用5µl TurboFect转染SNU638细胞^TM在体外转染试剂(Fermentas, Burlington，加拿大)，并与50 nM TaqMan®MicroRNA Assay hsa-miR-449 (Applied Biosystems, Foster City, CA)或50 nM siRNA fextube基因溶液短干扰组蛋白去乙酰化酶1 (siHDAC1)， siHDAC2或混合(Qiagen, Hilden，德国)。300µl GIBCO^TM加入Opti-MEM I (Invitrogen, Carlsbad, CA)，孵育20 min后应用于细胞。转染24小时后提取RNA和蛋白。用siGLO siRNA (Thermo Scientific, Waltham, MA)处理阴性对照细胞。所有转染均为三次重复。

细胞死亡测量

为了确保本文的结果代表活细胞的基因表达，我们检测了miR-449、HDAC sirna和药物处理对SNU638细胞活力的影响，通过计数转染和药物处理24小时后在培养基中自由流动的细胞数量。细胞计数使用伯爵夫人自动细胞计数器(Invitrogen)。阴性对照在纯培养基或含0.01% DMSO的培养基中培养。所有实验都是四次重复。正如预期的那样，siHDAC和Vorinostat治疗会在一定程度上导致细胞死亡，这在其他胃癌细胞系中已经得到证实[16,17]。此外，DNA损伤药物5-FU和Nutlin-3也诱导细胞死亡(图S3 A和B)。然而，大多数细胞在治疗后存活下来，存活的细胞看起来很健康，允许本文提出的测量。

细胞增殖和迁移

用LZRSHOTAIR表达载体(Addgene plasmid 26110)[10]转染HFE145细胞，研究HOTAIR对胃癌细胞增殖和迁移的作用。将400.000个HFE145细胞接种于10 cm板中24小时后，用4µg LZRS- hotair或4µg空LZRS载体(Turbofect)转染^TM(发酵)如上所述。转染24小时后，10.000个细胞/孔在cm -plate 16中进行增殖，20.000个细胞/孔在E-plate 16的上腔中进行迁移研究(ACEA Bioscience, San Diego, CA/Roche Diagnostics GmbH, Manheim, Germany)。分别在36小时和12小时进行实时增殖和迁移，使用RTCA DP仪(ACEA/Roche)进行xCELLigence阻抗分析。这种方法允许通过测量金电极上的电阻抗来持续测量细胞增殖或迁移，金电极包含在井底用于增殖测量，金电极包含在微孔聚对苯二甲酸乙二醇酯的底部，该微孔聚对苯二甲酸乙二醇酯分隔上下室用于迁移测量。N=6用于增殖研究，N=4用于迁移研究。使用RTCA软件(ACEA/Roche)进行计算。

RNA提取和qPCR

手术期间采集胃肿瘤或正常邻近组织的活检，并在收集后立即放入RNA(应用生物系统)。在-80ºC储存之前，稍后将RNA移除，并加入1 ml Trizol (Invitrogen)。组织样品在qisuelyser (Qiagen)上均质，并根据Trizol RNA分离(Invitrogen)的制造商协议从组织和细胞培养中分离RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度计测量RNA浓度。根据制造商协议，在2100生物分析仪(安捷伦技术公司，加州圣克拉拉)上检测RNA质量，所有RNA样本的RNA完整性数(RIN)值≥8。用Super Script III First-Strand Synthesis SuperMix for qPCR (Invitrogen)从1µg分离的RNA中合成cDNA。采用SYBR GreenER q-PCR SuperMix对ABI PRISM (Invitrogen公司)进行定量反转录PCR (qRT-PCR)分析。反应在应用生物系统公司的ABI PRISM 7900HT序列检测系统(SDS)上进行。将mRNA表达归一化为GAPDH，计算肿瘤或处理细胞株与正常组织或对照细胞株表达水平的差异。通过研究标准曲线的斜率来估计引物的效率。 All standard curves had a slope between -3.3 and -3.6 indicating a primer efficiency of 90-100%. mRNA primers were designed using Primer-Blast software from NCBI [18], to span at least one intron in order to ensure amplification of cDNA only (for mRNA primers see Table S1).

西方墨点法

使用RNA/DNA/Protein纯化试剂盒(Norgen Biotek corporation, Throld, Canada)纯化蛋白质。将400µg蛋白装入聚丙烯酰胺凝胶(NuPAGE®Novex®4-12% BisTris Gel 1.0 mm, Invitrogen)中分离。蛋白印迹在聚二氟乙烯膜上(Invitrogen公司)，并与一抗HDAC1 (sc-81598)、HDAC2 (sc-7899)、p53 (sc-126)、Calnexin (sc-11397)的一抗孵育过夜。用化学发光法观察蛋白质(Amersham^TM发射极耦合逻辑^TM选择Western Blotting检测试剂，GE Healthcare, Little Chalfont，英国)，使用las1000 Pro v. 2.6 (FujiFilm，东京，日本)。

截止值定义

将队列分为低表达组和高表达组，将HOTAIR表达转化为二元变量。我们采用与Wu等人[19]相同的方法，将肿瘤分为两组:低HOTAIR表达= 2 / 3的肿瘤中出现的表达水平最低。HOTAIR高表达=在最后三分之一的肿瘤中有高表达。Gupta等人的[10]认为HOTAIR RNA的表达在分离成高表达组和低表达组时的截断值为125倍，而在本研究中，高表达组和低表达组的截断值为93倍。

统计评估

总生存期定义为从手术日期到死亡的时间。用Kaplan-Meier方法估计时间-事件数据，用log-rank检验和单变量回归分析进行比较。采用多Cox比例风险回归模型确定独立预后因素，置信区间为95%。根据推荐[20]，由于事件数量较少，分析中只包括四个变量。选择单变量分析中最显著的变量。采用SPSS version 19和Graph Pad Prism进行统计分析。qRT-PCR结果以3个技术重复中至少3个独立实验的平均值表示，并采用非配对双尾t检验进行分析。在p值≤0.05时，数据集之间的差异被认为是显著的。误差柱=±SEM，除非另有说明。

结果

病人

从2008年7月至2009年11月在哥本哈根大学医院胃肠外科手术的111名患者中，40名患者被纳入。所有纳入研究的患者均为丹麦本土白种人。10例患者接受了化疗，均为辅助治疗。7例患者接受术后辅助治疗，包括5个周期的氟尿嘧啶(5- FU)加亚叶酸和局部放疗(1,8 Gy x 25份，5份/周)。此外，3例患者接受了6个周期的泰索替、卡铂和卡培他滨。

研究期间患者的生存期与未收集肿瘤组织的手术患者无统计学差异(中位生存期32.2个月(26.4-31.3)vs. 26.9个月(22.4-31.3)。HR=1.65 (0.9-2.8) p=0.078)(图S1)。胃癌和GEJ/E/G癌患者预后无显著差异。

纳入的40例患者中，3例失访，4例组织标本质量太差。患者的人口特征和临床病理特征如表1所示。有关其他患者特征，请参见补充表S2.19患者（58%）在分析时死亡。中位随访时间为22个月（1-37个月）。

人口统计资料
变量		的患者数量	％
性别	男性	25	76
	女	8	24
性能状态	0	14	42
	1	19	58
年龄	中位数	63年	(36 - 90)
远处转移	是的	3.	9
	没有/未知	30.	91
二特点
变量		的患者数量	％
劳伦 分类	扩散	12	36
	肠	21	67
本地化	食道/ GEJ	19	58
	胃	14	42
节点与癌	N 0 - 1	17	52
	N 2 - 3	16	48

表1:患者的人口特征和临床病理特征。

HOTAIR过表达是死亡的独立预测因素

我们发现，与邻近的正常组织相比，肿瘤中HOTAIR的表达从不变到近700倍的增长(图1A)。与正常胃上皮相比，HOTAIR高表达组的HOTAIR表达在腺癌中上调了93倍至近700倍(图1A)。与HOTAIR高表达组(中位生存期16.7个月)相比，HOTAIR低表达组(中位生存期22.9个月)生存时间明显更长(图1B)。

图1:HOTAIR的高表达与生存差相关:每例患者肿瘤组织中mRNA的表达水平与相应的正常组织比较。
(一)33例胃癌肿瘤HOTAIR的qRT-PCR分析。HOTAIR fold增幅最高的33%为HOTAIR高，其余三分之二为HOTAIR低。
(B)11例HOTAIR高(红色)和22例HOTAIR低(蓝色)患者的Kaplan-Meier总生存曲线在A中显示(p=0.026)。

通过对不同预后因素的研究，我们发现年龄>=65岁p=0.032 (HR=3.2 (95%CI 1.1-9.3))， TNM期+IV期p=0.044 (HR=3.7 (95%CI 1.4- 10))和HOTAIR高表达p=0.026 (HR=3.3 (95%CI 1.2-9.6))被确定为患者人群中唯一重要的死亡预测因素(表2)。

集团	Log-rank (Mantel-Cox)测试	x平方分布	p值	生存曲线 明显不同?	风险比(Mantel-Haenszel)	比率的95%置信区间
性	男性与女性	1日19	0275年	没有	1，8	0, 63 5, 1
年龄	> = 65 vs < 65	4, 61	0032年	是的	3、2	1, 1到9,3
本地化	GEJ vs眼底/语料库/腔	0, 37	0545年	没有	1，3	0, 52岁,5
	GEJ vs语料库/眼底	0, 03	0864年	没有	0, 89	0, 23日至3、4
	GEJ vs腔	0, 86	0353年	没有	1、7	0, 56 - 5 0
	语料库/眼底vs腔	0, 66	0418年	没有	2，0	0, 38到10
劳伦分类	扩散和肠	0, 16	0686年	没有	1，2	0, 46岁,2
围神经的入侵	是和不是	1, 07年	0301年	没有	1、7	0, 61 - 4, 7
血管内增长	是和不是	0, 27	0602年	没有	1、6	0,28至9,0
TNM	I+II vs III+IV	4日00	0044年	是的	3、7	1, 4 - 10所示
	T3/4 vs T1/2	0, 46	0498年	没有	1，4	0, 51到4,1
T	T3 vs T1/2	0 01	0942年	没有	0, 95	0, 21 - 4, 2
	T4 vs T1/2	1，00	0318年	没有	1，8	0, 58岁,3
	T4、T3	1、21	0272年	没有	1，9	0, 60 6, 1
N	N0和N1 +	0, 03	0868年	没有	1，1	0, 41岁,9
米	M0、M1	0, 23	0629年	没有	0, 67	0, 13 - 3, 5
热空气	高与低	4, 94	0026年	是的	3334年	1、2到9、6

表2:生存分析。

HOTAIR过表达诱导HFE145细胞增殖

为了研究HOTAIR对细胞增殖和迁移的作用，我们在正常胃上皮HFE145细胞中过表达HOTAIR。我们发现HOTAIR转染使加倍时间从20.9小时(±1.6小时)减半至10.8小时(±0.5小时)(p<0.05)(图2a和B)。因此，HOTAIR高表达使细胞增殖加倍，从而增加了细胞的致癌潜能。HOTAIR的过表达并不影响HFE145细胞在12小时内通过细胞膜的迁移(图2c和D)，这意味着我们在这些实验中没有发现转移潜能的增加。

图2:HOTAIR诱导胃HFE145细胞增殖:用LZRS-HOTAIR表达载体(红色)或空LZRS对照载体(蓝色)转染HFE145细胞。
(A, B)HOTAIR诱导HFE145增殖，使HFE145倍增时间减少50% (p<0.05)。
(C, D)相反，HOTAIR并不促进细胞的迁移。N=6为增殖测定，N=4为迁移测定。
*与对照细胞有显著差异p<0.05。

抑制HDAC抑制HOTAIR的表达

我们之前已经发现miR-449在胃癌[21]中表达下调。我们进一步发现miR-449靶向hdac并抑制胃肿瘤细胞[21]的生长。hox簇部分受表观遗传控制，因此miR-449可以调控其表达。此外，Chiyomaru等人的[22]研究表明HOTAIR是miR-34a的直接靶点，miR-34a是与miR-449具有相同种子序列的miRNA。相同的种子序列赋予mirna靶向相同序列的能力，表明miR-449在HOTAIR下调中发挥作用。因此，我们假设miR-449通过直接或间接调节HOTAIR抑制胃癌细胞的生长，从而研究miR-449过表达如何影响HOTAIR的表达。我们发现，将miR-449转染到SNU638细胞中导致HOTAIR表达降低(图3A)。miR-449靶向多个信号通路，过表达miR可激活p53(图3B)[21]。5-FU或Nutlin-3处理激活p53增加了HOTAIR的表达(图3 C和D)，因此不能解释miR-449转染后HOTAIR表达的减少。然后我们寻找miR-449调控HOTAIR表达的其他机制，发现miR-449靶向HDAC1和-2(图4 A和B)。因此，我们测试了HDAC1和-2的siRNA敲低如何影响HOTAIR表达。 First we confirmed the knockdown of HDAC1 and -2 by RTq-PCR and Western blotting (Figure 4 C and D). We found that siRNA knockdown of HDAC1 and -2 alone and especially combined led to a marked reduction in HOTAIR expression (Figure 4E). The effect of HDAC inhibition on HOTAIR expression was further confirmed with a dose dependent reduction in HOTAIR expression by the HDAC inhibitor Vorinostat (Figure 4F). Thus, we conclude that miR-449 regulates HOTAIR expression by either directly targeting HOTAIR or indirectly through the inhibition of HDACs.

图3:miR-449过表达可降低HOTAIR的表达，而p53激活不降低HOTAIR的表达
(一)转染miR-449后，SNU638细胞中的HOTAIR表达降低。
(B)Western blotting显示，miR-449转染后p53表达增加。
(C, D)qRT-PCR检测到，在5-FU或Nutlin-3诱导p53激活后，HOTAIR表达增加。所有治疗均为24小时。
*与对照细胞有显著差异p<0.05。

图4:HDACs的抑制导致SNU638细胞中HOTAIR表达降低。
(A, B)miR-449过表达后，HDAC1、HDAC2 mRNA和蛋白表达降低。(C, D)RTq-PCR和Western blotting证实了HDAC1和HDAC2基因的敲除。(E)HDAC1和HDAC2 siRNA敲除后HOTAIR mRNA表达降低。(F)HDAC抑制剂Vorinostat剂量依赖性地降低HOTAIR表达。所有治疗均为24小时。
*与对照细胞有显著差异p<0.05。

讨论

局部浸润和远处微转移往往在手术时无法检测到，是癌症相关死亡的主要原因。因此，为了个体化和加强围手术期治疗，尽早发现生物标志物以识别高危复发和生存期短的患者是很重要的，最好是在诊断时。

在本研究中，我们发现HOTAIR在食管癌、GEJ癌和胃腺癌的活检中最高上调了690倍，并且HOTAIR的高表达与生存差相关。HOTAIR的诱导也被发现是一个强大的预测因子，可以独立于已知的临床和病理危险因素，如乳腺癌[10]，肝癌[23]，肿瘤大小，分期和激素受体状态。结直肠癌[24]和近期胃癌支持本文提出的结果[25,26]。HOTAIR在HOXC位点表达，通过招募PRC2[7]抑制HOXD簇。HOTAIR的过表达伴随着染色质状态的改变，使得PRC2被招募到上皮细胞中正常情况下不与PRC2结合的基因中，导致多种抑制肿瘤转移[27]基因的表达下调。HOTAIR过度表达调控的基因包括CDH1靶基因[24]，该基因与胃腺癌[28]侵袭性增加和转移发生有关。这可能是HOTAIR过表达易导致胃、食管和GEJ腺癌预后不良的机制之一。

我们发现HOX簇编码的HOTAIR异常表达与胃癌进展有关。在本研究中，我们证实了HOTAIR过表达可诱导正常胃上皮细胞增殖，并与食管癌[29]、胃肠道间质瘤[30]、结直肠癌[24]、胰腺癌[31]、肝癌[23]和乳腺癌[10]癌和细胞系的观察结果相对照。结合早期的报道[10,13,24-26]，它表明HOX簇转录本的转录调控异常在胃癌发生中是重要的。多项研究表明，HOTAIR的高表达会导致包括胃癌在内的多种癌症的不明显转移增加。我们测量了非癌细胞系HFE145在过表达HOTAIR后在细胞膜上迁移的能力，并没有发现在12小时内迁移的任何增加。然而，我们没有研究HOTAIR过表达对细胞通过其他方式扩散和转移的能力的影响，而不是迁移，如粘附的丧失，生长因子的表达，染色质状态的重塑。目前对控制HOTAIR表达的过程知之甚少。因此，精确的转录控制需要进一步阐明。在本研究中，我们发现miR-449可能通过直接靶向HOTAIR或靶向HDACs而引起HOTAIR的下调。将HOTAIR作为miR-449的直接靶点超出了本文的范围。 HDACs deacetylate histones and tighten their interaction with DNA, resulting in the inhibition of gene transcription [32]. Here we showed that inhibition of HDAC1 and -2 leads to a loss of HOTAIR expression. Thus HDACs may inhibit the transcription of HOTAIR repressors, although this needs further investigation. The reduction of HOTAIR expression by siHDAC and vorinostat implies that treatment with HDAC inhibitors may have a role in gastric cancer therapy, which has also been suggested by Claerhout et al. [17]. In support of this, high HDAC expression is associated with poor prognosis in gastric cancer [16].

结论

总之，HOTAIR的表达增加了胃癌细胞的增殖，并与胃癌患者的不良预后有关，这证实了最近的研究结果[26]。我们的数据显示，miR-449和HDAC可能参与了HOTAIR在胃癌中的调控，但这还需要进一步研究。应进一步研究HOTAIR在胃肠道肿瘤中的高表达，以确定肿瘤风险的增加以及是否需要更广泛的手术和/或积极的围手术期化疗。

致谢

感谢Mette Hedegaard Moldaschl的专业技术援助。这项工作得到了丹麦MRC (LFH)、Novo Nordic基金会(LFH)、哥本哈根大学健康和医学科学学院(JABS)、肿瘤研究基金会(MG)和罗氏(MG)的支持。

作者的贡献

JS、MG、LiB和BF获得了本文给出的数据。JS, MG, LFH获得资助，设计研究，分析解读数据，起草文稿。JS, LiB, BF和LFH对手稿的重要知识内容进行了批判性的修改。JS进行了分子生物学分析，MG进行了统计分析。BF进行病理评估。LFH指导了这项研究。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

工具书类

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条信息

文章类型:研究文章

引用:Strickertsson JAB, Grunnet M, Bardram L, Federspiel B, Friis-Hansen L (2017) miR-449和HDAC调节HOTAIR的表达，预测切除的胃食管腺癌的不良预后和HFE145细胞的双重增殖率。J胃失调3(2):doi http://dx.doi.org/10.16966/2381-8689.135

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出版的历史:

收到日期:2017年9月26日

接受日期:2017年11月08

发表日期:2017年11月10日