摘要

在这里，我们展示了基于阵列的无标记生物传感器如何应用于单克隆抗体(mAbs)的高通量、高信息表位定位。使用抗原变体进行高分辨率的表位定位可以识别抗体上的特定结合区域。表位定位的使用可以加速治疗性单克隆抗体和疫苗的发现，并告知正在研究的相互作用的数量和多样性。具体地说，我们展示了表位定位提供的机会，以区分在其他高度相似的单克隆抗体之间的靶标结合的细微差异。

关键字

单克隆抗体;抗原决定基映射;Label-free生物传感器;高通量筛选

研究抗体如何与抗原结合具有重要意义

目前，治疗性单克隆抗体已被FDA批准用于大多数主要疾病类别的临床适应症，包括癌症、感染、自身免疫、心血管、肺部和炎症性疾病[1]，其市场价值超过500亿美元，占销售前10名药物中的7个[2,3]。由于许多靶点需要复杂的方法来识别和开发靶向功能表位或优于竞争分子的候选靶点，因此新的治疗性单克隆抗体的开发面临着极其激烈的竞争局面[1,4]。然而，传统筛选方法的选择标准未能考虑到知识自由的操作。因此，针对高调靶点开发的治疗方法在商业化阶段可能会遇到重大挑战。此外，许多靶标的序列和结构的可变性也为识别具有广泛活性的先导候选靶标提出了挑战。对于在肿瘤学中发现的高度突变的靶点来说尤其如此。一个理想的候选药物不容易被功能相关的目标表位的修饰所干扰，例如在不同的疾病状态或治疗方案中可能发生这种修饰。类似地，开发有效的疫苗需要激发能够靶向序列高变异性区域的免疫反应。了解针对病毒靶点的特定方面引起的免疫反应，对于发展传染病的治疗方法至关重要。这里描述的增强的表位定位技术提供了改进下一代治疗方法的发现工作流程的能力。

表位定位为治疗筛选提供了许多优势

在选择候选治疗性单克隆抗体方面，基于表位的筛选比基于传统亲和力的筛选更为有利[5-8]。此外，当与功能分析相结合时，基于表位的筛选识别功能表位的候选，从而减少死胡同候选，增加II期和III期试验的成功概率[9]。因此，结合使用无标签生物传感器进行表位分类和表位映射可以提高成功概率，降低总体成本，并提高研发生产率[9]。竞争性表位结合最适合作为基于表位结合位点对单克隆抗体进行聚类的初级筛选工具。当使用labelfree生物传感（如基于阵列的表面等离子体共振成像（SPRi））进行分析时，该分析只需要粗的或纯化的单克隆抗体及其所针对的抗原。虽然定义表位库是候选选择的重要第一步，但它不会直接在结构上定位表位，也不会涉及针对多种形式抗原的筛选。

为了定位表位并了解其对靶标序列和结构变化的影响，表位定位是一个很好的工具[10]。通过阵列SPRi进行表位定位主要有两种方式(1)重叠抗原多肽库在表面排列并探针与单抗注射结合，或(2)靶变异体/突变体通过与生物传感表面[11]偶联的单克隆抗体阵列注射。该文库也被称为参考面板，有利于快速绘制识别线性表位的单克隆抗体的结合位点;它通常不包含具有更高阶结构的序列，因此构象结合物不被映射。根据目标的不同，这些信息可能足以定义表位绑定群落的结构-空间关系。使用突变体/变异体的表位定位方法确实需要对每个变异体进行克隆、表达和纯化，但可以监测与构象敏感的单克隆抗体的结合。此外，突变/变异方法有助于对多种抗原亚型进行比较筛选。在这两种格式中，数据收集的实时性质提供了了解交互发生的速率的机会，提供了对交互的进一步理解。在其他筛选方法中，如ELISA，缺乏实时数据收集可能会有问题，例如，当结合较弱时。在这里，我们提出了一种表位定位方法，既可以增强一个抗原的结构特征和它与单克隆抗体的关系。 Epitope mapping was done using high-throughput SPRi with multiple mutant constructs of herpes simplex viral glycoprotein D(gD) and a panel of mAbs with broad epitopic coverage of gD. In a single experiment, this approach confirmed existing mapping data while detecting new binding profiles not previously identified. These results highlight the power of epitope mapping to quickly screenantigen:mAb interactions for a large panels of mAbs and generate a vast amount of information to drive vaccine and therapeutic drug development.

材料和方法

试剂

如前所述，从杆状病毒感染的昆虫(Sf9)细胞中产生重组突变HSV gD构建物[12-15]。gD的细胞外部分是建立突变体的起点，从治疗的角度来看，抗体应答可能与gD的细胞外部分有关。简而言之，突变体是通过表达n和/或c端截尾物种，在野生型序列中插入或删除新序列来修饰蛋白质结构，或者通过交换个体残基来识别对单抗结合至关重要的基因。抗HSV gD型1或型2的小鼠单克隆抗体来自多个来源，在以前的手稿中都有描述，包括它们基于lower through put突变、mapping和竞争研究的规范分组分配[16,17]。

数组撒

大约40个抗hsv gdmab阵列使用连续流微检测器(CFM)耦合到生物传感器表面。简而言之，单抗与表面的共价结合是通过首先用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和n-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的混合物激活羧甲基葡聚糖表面完成的。在pH为4.0的醋酸钠溶液中制备的单克隆抗体在阵列上的离散位置流动，以允许胺基偶联。剩余的活性酯用乙醇胺淬火。为了研究单克隆抗体结合的关键序列区域，通过单克隆抗体阵列注射gD突变体，并使用IBIS MX96 SPR成像仪进行检测，实时监测生物传感器表面40个单克隆抗体位点上的质量结合。由于偶联过程中失活或对本研究中使用的gD亚型无反应，一些单克隆抗体在本试验中确实产生了结合信号(数据未显示)。gD突变体与单克隆抗体结合后注射gD、Nectin-1和HVEM的受体，以评估单克隆抗体是否能破坏受体结合。每个循环结束后，通过注射pH为2.0的甘氨酸从单克隆抗体表面去除结合组分。

结果

利用gD的变体对特异性单抗结合的gD位点进行定位研究，如图1所示。这些单克隆抗体的典型分组分配，基于以前的研究，被列在图的顶部，以及单克隆抗体与受体Nectin-1和HVEM结合到细胞外gD的能力。受体竞争在很大程度上遵循规范的分组分配，这与从结构结合的角度对这些单克隆抗体所知的情况一致。

图1。单克隆抗体对gD突变体的表位定位。没有先前规范赋值的单抗被列为(Unk)。Nectin-1/HVEM结合中断显示为(+)，未检测受体阻断的单克隆抗体不确定(ND)。红色细胞表明缺乏与突变体的结合，黄色细胞表明结合水平低，绿色细胞表明结合反应高。插入显示SPR传感器gram信号，作为响应单位(RU)随时间(秒)。

抗gD单克隆抗体对突变体的结合反应用热图表示，图1。gD突变体列为行，单克隆抗体列为列。绿色细胞表示强结合信号，黄色细胞表示中间结合信号，红色细胞表示缺乏结合。这些变体不仅定位于gD的N-或C-末端区域的结合，而且强调对结合至关重要的特定残基。参考典型的Ia群和Ib群单克隆抗体，突变体Y38A（306t）和V231W（306t）可用于区分这些亚群。他们证明，尽管这些单克隆抗体具有许多共同的特征，导致了它们的典型分组（例如，尽管V231W突变，但仍然结合），但对于结合至关重要的特定残基可以使用表位作图法（Y38A）来区分它们，如图2所示。此外，该方法的吞吐能力确定了对Y38A突变同样敏感的单克隆抗体，并且之前未对其进行定位，例如108S和77S。在Ia组和Ib组的代表性单克隆抗体的扩展视图中显示了传感器图轮廓，以强调观察到的结合反应的差异，并通过实时跟踪结合强调此SPRi方法提供的价值。Y38A突变几乎破坏了Ib组单抗的所有结合，但不破坏Ia组单抗。受体竞争图谱和表位图谱与gD的结构一致（见图2和补充视频）。

图2。两种糖蛋白d突变的三维结构表征如图1所示。gD的晶体结构(pdb 2C36型)。突变被更详细地显示出来，以突出在这个表位图研究中发现的结构差异。

讨论

高通量SPRi在抗gd单克隆抗体的面板上，通过使用突变体进行表位定位，确认了以前的表位关系映射，并确定了几个以前未确定的单克隆抗体的结合区域。同时与ELISA抗原决定基映射可以执行,实时label-free检测信息丰富得多(图1、2)。此外,基于数组的撒在每个注射也有优势与ELISA的变体同时看到所有独特的马伯位置数组,降低整体抗原的要求。突变表位定位的挑战来自于需要克隆、表达和纯化大量抗原变体。通常，使用丙氨酸扫描(即散弹突变)[18]来创建表位定位参考面板，其中单个残基被改变为丙氨酸，并评估其结合特性[18-20]。对资源的需求限制了这种方法的采用;然而，通过改进用于生成这些面板[11]的平台和改进的技术，包括用于高通量筛选的基于阵列的SPRi，该工作流可以生成以前在早期发现时无法获得的信息。利用表位定位方法也有机会增强抗原和抗体关系的建模。从这些类型的研究中获得的信息非常适合用于蛋白质对接预测算法。此外，表位定位结合结构和结合分析(生物物理预测软件)可以改进突变的设计和布局。

结论

这份手稿中的结果显示，构象突变体的表位定位是一种多功能和强大的工具，可以扩大药物发现和疫苗开发的筛选库。结合其他的表位表征方法，如竞争性装箱和受体竞争，可以发展出抗原/抗体关系的详细图。该工作流的一个关键实现因素是实时生物传感的使用，这里演示了基于阵列的SPRi，它可以以多路方式有效地积累数据，并呈现出相关绑定交互的完整画面。总的来说，这些研究的数据可以推动预测建模方面的新发展，并最终改善药物和疫苗的开发。

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条信息

文章类型:研究文章

引用:同上，N T，Cairns TM，Lou H，Closmore A，Eisenberg RJ等。（2016）了解抗体：使用基于阵列的表位映射的抗原变体的抗原关系。J药物研究开发2（4）：内政部http://dx.doi.org/10.16966/2470-1009.124

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出版历史：

收到日期:2016年11月08

接受日期:2016年12月15日

发表日期:2016年12月20日