摘要

本研究的目的是评估半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸保护肝细胞免受扑热息痛毒性作用的比较效果，通过监测实验兔的肝功能参数。在本研究设计中，动物被分为两组;急性组和慢性组。每组进一步分为五个小组;对照组(组i)、毒性组(组ii)、半胱氨酸处理组(组iii)、赖氨酸处理组(组iv)、甘氨酸处理组(组v)。本研究表明，半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸能显著降低对乙酰氨基酚致肝毒性家兔肝酶的升高。在急性和慢性毒性研究中，半胱氨酸和赖氨酸处理组与甘氨酸处理组相比，肝脏指标显著降低。因此，与甘氨酸相比，半胱氨酸和赖氨酸具有更好的临床应用价值。

关键词

扑热息痛;肝毒性;半胱氨酸;赖氨酸;甘氨酸

介绍

肝脏是具有分泌和排泄功能的器官。肝脏的大部分合成和代谢功能是由肝细胞完成的。肝细胞在蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素和激素的代谢和储存中发挥重要作用。血浆蛋白也由肝实质细胞合成。肝脏既能合成胆固醇，又能清除胆固醇。非必需氨基酸在需要时也可由肝脏合成[1,2]。

肝细胞内存在血清谷草转氨酶(SGOT)、血清谷丙转氨酶(SGPT)、碱性磷酸酶(ALP)和乳酸脱氢酶(LDH)。当肝细胞损伤或死亡时，这些酶在循环中释放。SGOT和SGPT的血浆半衰期分别为16-18小时和42-48小时，线粒体SGOT的半衰期为87小时。这些酶是肝损伤的标志物。胆红素是由网状内皮系统中血红蛋白的酶分解而形成的。血浆胆红素水平在肝脏受损时也升高。

扑热息痛(n -乙酰对氨基酚，4-羟基乙酰苯胺)，又称扑热息痛，是常用的镇痛解热药。在治疗剂量上，它是最安全有效的药物。当意外服用高剂量药物或有自杀企图时，这种毒性剂量的扑热息痛会导致肝小叶中央坏死，导致肝衰竭，最终死亡[4,5]。氧化应激、硝基酪氨酸形成、炎症细胞因子和线粒体通透性转变被认为参与扑热氨醇诱导的肝毒性。Paracetamol主要通过与葡萄糖醛酸和硫酸盐结合代谢，但也有一个次要途径通过Cyp4502E1酶系统将Paracetamol转化为毒性代谢物n -乙酰基-p -苯醌亚胺(NAPQI)。NAPQI通过谷胱甘肽结合物的形成，通过谷胱甘肽(GSH)途径解毒。如果服用过量的扑热息痛，就会产生高浓度的NAPQI，从而导致谷胱甘肽储存库的枯竭。所以这种有毒的代谢物与正常细胞蛋白的-SH基团反应，形成扑热息痛蛋白加合物，导致细胞死亡[6,7]。

氨基酸有许多保护作用，可以帮助身体对抗压力条件。它们在富含蛋白质的饮食中大量存在，如家禽、鸡蛋、小麦、西兰花、大蒜、洋葱、红辣椒、大豆和坚果。n -乙酰半胱氨酸是谷胱甘肽的前体，用于预防扑热息痛引起的肝毒性。谷胱甘肽由三种氨基酸组成;甘氨酸，谷氨酸和半胱氨酸。l -半胱氨酸是一种在人体中由氨基酸蛋氨酸合成的非必需含硫氨基酸。在蛋白质营养不良或肝脏谷胱甘肽消耗引起氧化应激的情况下，半胱氨酸可恢复γ -谷氨酰基半胱氨酸连接酶[9]。半胱氨酸是谷胱甘肽(GSH)的前体，具有强大的抗氧化性能，并作为细胞外还原剂[10]。赖氨酸也是一种必需氨基酸，在重金属螯合、蛋白酶的激活、激素的产生和抗体的增强免疫系统[11]中有用。甘氨酸是一种非必需氨基酸，因为在人体中，它可以由肝脏从其他氨基酸中产生。 Glycine provides defense to body against variety of conditions such as sepsis, hemorrhage and attack of endotoxins. Glycine also protects the liver, kidney, skeletal muscles and heart against reperfusion injury due to ischemia, cold conditions various toxic compounds and drugs [12].

本研究的主要目的是确定不同氨基酸对扑热息痛致肝毒性动物的疗效。半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸在改善扑热息痛(最常用的镇痛和退热药物)引起的肝损伤方面的相对有效性进行了评估。

材料

化学品

本实验使用了l -半胱氨酸(Daejung)、赖氨酸(Fluka Granite)和甘氨酸(Merck Pharmaceuticals)三种氨基酸，以检查它们的肝保护作用，而使用扑热息痛引起肝毒性。所用溶剂均为分析级。蒸馏水是从我们实验室的蒸馏计划中获得的。

实验动物

体重在1 - 2公斤的白化兔从当地市场购买。这些动物被饲养在拉合尔旁遮普大学药学院的动物屋里。在开始实验之前，他们已经适应了一星期的环境。兔子被喂食新鲜的绿色饲料和水随意。

收集的血液

兔子被放在一个木盒子里，兔子的耳朵被小心地剃掉了。通过摩擦耳朵，耳朵的边缘静脉变得突出。用锋利的外科手术刀进行精细的切割，然后在离心管中采集血液。采集的血液在冰水中保存10分钟，并以4000转/分钟的速度离心15分钟。最后用微量移液管在Eppendorf中收集血清并标记。

实验设计

兔子主要分为两组;急性处理组和慢性治疗组。各组进一步分成亚组5和每个子组6只兔（N = 6）被列入每个实验研究英寸治疗前，各组动物在生理和生化和被选作研究只健康家兔调查。

急性治疗组(ATG组)

各治疗亚组在给出各自治疗方案6小时后采血，观察肝功能指标SGPT、SGOT、ALP、LDH、总胆红素(TB)的变化。

第一组(对照组):实验组给予蒸馏水经灌胃管灌胃。

II组(毒性组):以黄芪为悬浮剂，将3克/千克对乙酰氨基酚粉溶于水中制备的对乙酰氨基酚悬浮液经胃管灌胃致家兔急性肝毒性。

III组(l -半胱氨酸治疗组):l -半胱氨酸600mg/kg腹腔注射10min后给予急性扑热氨中毒剂量。

IV组(赖氨酸治疗组):L-赖氨酸（10毫克/千克）给急性对乙酰氨基酚毒性剂量之前注射intraperitoneally10分钟。

V组(甘氨酸治疗组):甘氨酸(800mg/kg)经胃管灌胃10min后给予急性中毒性扑热氨醇。

慢性治疗组

研究组按各自的治疗方案对各亚组进行为期30天的治疗，并采血，观察肝功能指标(ALT、AST、ALP、LDH、总胆红素)的变化。

第一组(对照组):这组患者连续30天通过灌胃管口服安慰剂(水)。

II组(毒性组):对乙酰氨基酚悬浮剂是将75mg/kg/d对乙酰氨基酚粉溶于水中，以黄芪多糖为悬浮剂制备的对乙酰氨基酚悬浮剂，经胃管灌胃给兔30 d，肝功能正常。

III组(l -半胱氨酸治疗组):l -半胱氨酸(200mg/kg)腹腔注射对乙酰氨基酚治疗的兔子在其30天的毒性方案的最后一周。

IV组(赖氨酸治疗组):l -赖氨酸(3mg/kg)腹腔注射给对乙酰氨基酚治疗的兔子在其30天的毒性方案的最后一周。

V组(甘氨酸治疗组):甘氨酸（266.6mg / kg）的最后一周其30天毒性协议的通过胃内导管口服施用对乙酰氨基酚治疗的兔子。

统计分析

采用SPSS 21.0软件进行数据分析。所有肝脏剖面参数均以平均值的标准差表示。采用方差分析(ANOVA)后置杜克氏检验(post-hoc tukey’s test)，采用SPSS统计工具对不同实验组进行比较^®版本21。统计学值p≤0.05被认为是显著的。

结果

对乙酰氨基酚、l -半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸对急性治疗研究中肝脏形态的影响

在急性毒性研究中，观察了对乙酰氨基酚的毒性作用以及l -半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸三种氨基酸对SGOT、SGPT、ALP、LDH和总胆红素水平的保护作用(表1，图1A)。中毒性组(II组)与对照组(1组)比较，中毒性组SGOT(84%↑)、SGPT(70%↑)、ALP(22%↑)、LDH(80%↑)、总胆红素(57%↑)水平显著升高(p<0.05)。半胱氨酸处理组(III组)与毒性组(II组)比较，血浆SGOT(60%↓)、SGPT(41%↓)、ALP(63%↓)、LDH(73%↓)和总胆红素(59%↓)水平显著降低(p<0.05)。赖氨酸处理组(IV组)血浆SGOT(30%↓)、SGPT(61%↓)、ALP(49%↓)、LDH(73%↓)和总胆红素(57%↓)水平较中毒组(II组)显著降低(p<0.05)。甘氨酸处理组(V组)SGOT(18%↓)水平无显著变化(p>0.05)，而SGPT(33%↓)、ALP(26%↓)、LDH(66%↓)和总胆红素(46%↓)水平显著降低(p<0.05)。

对乙酰氨基酚、l -半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸对慢性毒性研究中肝脏形态的影响

在慢性毒性研究中，观察对乙酰氨基酚的毒性作用以及l -半胱氨酸、赖氨酸、甘氨酸三种氨基酸对SGOT、SGPT、ALP、LDH和总胆红素水平的保护作用(表2，图1B)。毒性对照组(ⅱ组)与对照组(1组)比较，SGOT(64%↑)、SGPT(103%↑)、ALP(15%↑)、LDH(23%↑)、总胆红素(33%↑)水平均显著升高(p<0.05)。半胱氨酸治疗组(III组)与对照组(II组)比较，血浆SGOT(25%↓)、SGPT(29%↓)、ALP(19%↓)、LDH(28%↓)和总胆红素(20%↓)水平显著降低(p<0.05)。赖氨酸处理组(IV组)血浆SGOT(21%↓)、SGPT(25%↓)水平显著降低(p<0.05)。高山(↓12%)和非显著改变LDH水平(23%↓)和总胆红素(↓17%)比阳性对照组(组2)。甘氨酸治疗组(V)没有任何明显变化(p > 0.05),血清(↓18%)水平,LDH(19%↓)和总胆红素(↓16%)而显著下降(p < 0.05),血糖水平(↓25%),高山(↓15%)。

表1:l-半胱氨酸、赖氨酸、甘氨酸对扑热息痛治疗兔急性肝谱的影响
1.第I组：对照组，第II组：有毒组，第III组：半胱氨酸治疗组，第四组：赖氨酸处理组，第V组：甘氨酸治疗组
2.数值表示为Mean±SEM
3.*代表P < 0.05
4.将第一组与第二组进行比较。第二组与第三组、第四组和第五组进行比较

表2:在慢性毒性研究对乙酰氨基酚处理的兔子L-半胱氨酸，赖氨酸，甘氨酸对SGOT水平
1.I组:对照组，II组:毒性组，III组:半胱氨酸治疗组，IV组:赖氨酸治疗组，V组:甘氨酸治疗组
2.数值表示为Mean±SEM
3.*代表P < 0.05
4.将第一组与第二组进行比较。第二组与第三组、第四组和第五组进行比较

图1:半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸对扑热息痛急性肝毒性肝谱的比较研究

图1 b:对乙酰氨基酚肝毒性慢性研究中半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸对肝参数的比较作用。

表3:急性和慢性研究中治疗组的多重比较
1.I组:对照组，II组:毒性组，III组:半胱氨酸治疗组，IV组:赖氨酸治疗组，V组:甘氨酸治疗组
*代表P < 0.05

讨论

药物性肝损伤(DILI)是药物治疗的主要限制因素。它是肝[13]最常见的疾病。肝毒素有一个独特的途径可以破坏肝细胞。个体因素也在药物诱导肝损伤(DILI)易感方面发挥关键作用。通过毒物基因组学和蛋白质组学的发展了解这些因素，可以最大限度地减少损伤。许多药物已经上市，以防止药物引起的肝毒性。其中，氨基酸在防止细胞损伤方面起着核心作用。在本研究中，比较了半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸对抗肝毒素的效果。

在表3中，比较研究表明，半胱氨酸和赖氨酸都是同样有效的，取决于以下提示的途径，但甘氨酸在降低SGOT水平上不是同样有效的，但甘氨酸在肝脏炎症病理条件中发挥重要作用。在急性和慢性毒性研究中，半胱氨酸治疗组(III组)SGPT、SGOT、ALP、LDH和胆红素水平均显著降低(P<0.05)。半胱氨酸是谷胱甘肽和pps(3-磷酸腺苷-5-磷酸硫酸盐)合成所必需的。paracetamol的硫酸酯化需要PAPS, NAPQI的解毒需要谷胱甘肽。因此，半胱氨酸通过将扑热息痛代谢转向更安全的侧[15]来预防扑热息痛引起的肝毒性。谷胱甘肽通过还原活性氧具有抗氧化性能。半胱氨酸还通过增加γ谷氨酰基半胱氨酸连接酶的水平，使机体从氧化应激中恢复过来，这种酶是合成谷胱甘肽[9]所必需的。赖氨酸处理组(iv组)SGOT和LDH水平也有类似的显著降低，SGPT水平极显著降低，ALP水平极显著降低。L-N⁶- （1-亚氨基乙基） - 赖氨酸（L-NIL）是一个赖氨酸衍生物。也有人认为，L-NIL作用于iNOS的酶的活性部位，并抑制其活性。L-NIL防止iNOS mRNA表达通过灭活NF-B，其调节iNOS mRNA表达。的L-NIL也保持GSH水平通过降低在肝脏中的NO产生，因为活性氮物质通过GSH [16]清除。它也恢复血窦的灌注。L-NIL还通过降低对乙酰氨基酚[17]的生物活化防止肝损伤。

用甘氨酸（第V组）治疗显示稍微不同的结果如（表3）和（图1）。在急性和慢性研究中，只有谷丙转氨酶的水平显著减少。Glysine是谷胱甘肽（GSH）的一部分，谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸的三肽，可以保护免受自由基相关的氧化应激[18]的细胞。甘氨酸也提高了在大鼠肝移植[19]生存。甘氨酸防止吞噬作用，肝细胞损伤，纤维化和细胞凋亡通过与肝毒性药物[20]中毒引起的。甘氨酸也通过恢复超氧化物歧化酶，过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶从而保护细胞免受NAPQI的氧化应激的活性具有antiperoxidative影响。甘氨酸也保持肝脏[1]的脂质过氧化（LPO）水平。这项研究也证实甘氨酸在维持肝脏的抗氧化活性的作用。在对乙酰氨基酚诱导的肝毒性，枯否细胞被活化，导致细胞因子的释放。甘氨酸门控氯离子通道位于Kupffer细胞。 Thus cytokines production is inhibited as glycine inactivates kupffer cells by hyperpolarizing cellular membrane. So glycine possesses anti-inflammatory activity and improves hepatic pathologic conditions [21]. Glycine also increases portal blood flow, production of bile, the hepatic microcirculation which improves cytochrome P450 activity and significantly reduces the levels of ALT,AST during hepatocellular injury [22].

结论

推测半胱氨酸、赖氨酸和甘氨酸可显著降低对乙酰氨基酚致肝毒性家兔肝酶的升高。在急性和慢性毒性研究中，与甘氨酸处理的动物相比，半胱氨酸和赖氨酸处理组的肝酶显著降低。

的利益冲突

声明不存在利益冲突。

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条信息

文章类型:研究文章

引用:Ahmad M, Javaid A, Kamran SH, Anwar R, Saleem Z，等。药物研究进展2(1):doi http://dx.doi.org/10.16966/2470-1009.112

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出版的历史:

收到日期:2015年12月07

接受日期:2016年1月18日

发表日期:2016年1月21日