摘要

作品简介:Oct4基因是干细胞自我更新调控的重要基因之一。近年来，该基因被认为是一种新型的肿瘤检测分子标志物。因此，在本研究中，我们检测了Oct4基因在MIA Paca-2、PA-TU-8902和AsPC-1细胞株以及胰腺癌中的表达情况。

方法:在本实验研究中,米娅Paca-2, pa - tu - 8902和AsPC-1细胞株在DMEM培养[1](GibcoDulbecco修改鹰媒介是一种广泛使用的基础培养基支持许多不同的哺乳动物细胞的生长)和RPMI [2] - 1640 (RPMI,也称为RPMI 1640或罗斯威尔公园纪念研究所介质,在含有10%胎牛血清(FBS)的培养基中，在37℃、含5% CO₂和90％的水分。胰腺肿瘤和非肿瘤标本购在伊朗肿瘤岸边。然后进行RNA提取和cDNA合成。使用实时PCR测定OCT4表达水平。使用流式细胞术和免疫细胞化学评估细胞系中靶基因的蛋白表达水平。

结果:Oct4在癌细胞株中的表达水平高于正常组织。通过流式细胞术和免疫细胞化学方法确定目的细胞株中靶基因的蛋白表达水平。

结论/含义：Oct4可作为胰腺癌细胞的分子标志物。该基因可能在癌细胞不受控制的增殖中发挥重要作用。

介绍

胰腺导管腺癌(PDAC)是最致命的实体癌，目前是美国第四大常见癌症死亡原因。PDAC在癌症早期没有症状，诊断时发生广泛转移，对化疗和放疗有很高的耐药性，因此诊断较晚。尽管在过去的几十年里对胰腺癌的研究不断扩大，但在这一领域的治疗进展甚微。

实际上，尽管大多数癌症的趋势下降，但PDACs的发病率和死亡率持续上升，胰腺癌预计2030年将成为西方社会中癌症死亡的第二个最常见的原因[4]。据报道，胰腺癌的发病率（其中85％是腺癌）在全球范围内每10万人1至10人之间，而且男性比女性更为普遍[5]。这种癌症很少被诊断为40岁以下的人，平均诊断年龄为71.这种疾病是男性癌症死亡率的第八个主要原因和妇女癌症死亡率的主要原因[6]。

在伊朗，这种癌症的患病率低于欧洲和美国。大多数人在确诊时就有转移，因此手术或化疗干预对这些患者最无效。胰腺癌治疗的临床挑战的潜在障碍之一是对PDAC进展的分子机制了解有限。事实上，表观遗传途径缺陷的发生是这类癌症发生发展的关键机制之一。研究表明，在胰腺癌中，像许多癌症一样，细胞周期调节基因的表观遗传调控、DNA修复、细胞连接和细胞信号通路的缺陷导致肿瘤的发展、进展和对药物治疗的耐药性[7]。

胰腺癌早期的表观遗传障碍克服了遗传障碍。一般认为，癌症是由多种基因突变积累引起的，但越来越多的证据表明，癌细胞在癌症形成、维持和进展过程中也会发生表观遗传异常[8]。

换句话说，组织肿瘤包含一个生物学上不同的异质性细胞群，并且具有自我再生的潜力。

根据克隆进化模型，肿瘤细胞是由细胞内遗传变化的积累和已有克隆的逐渐选择引起的。大多数消灭癌细胞的传统疗法都是基于这一理论。

这些方法的局限性，包括晚期癌症患者预后不良，表明肿瘤细胞中含有启动肿瘤生长和扩张的细胞群，以及转移和复发的能力。这些细胞被命名为癌症干细胞(CSCs)，因为这些癌细胞和基本干细胞之间的增殖相似。该模型估计了CSCs的以下特征:

1）自我康复;

2)异质性，如多维分化潜能;

3)抗凋亡。

这些特征似乎导致了传统疗法效果的降低，而传统疗法对分化或分化不足的肿瘤细胞的作用更大。未分化的干细胞群形成肿瘤块的一小部分。CSC理论估计这些细胞是由有些分化的祖干细胞分化而来的，它们的增殖潜能有限。

最近的研究表明，胚胎干细胞如Oct4和Nanog的特定转录因子在CSC功能的稳定性中起着非常重要的作用，它们是抑制这些细胞增殖的非常重要的靶标，并产生药物以抑制癌细胞的生长抑制癌细胞[12,13]。

事实上，OCT4蛋白是由POU5F1基因编码的转录因子，POU5F1基因是来自位于人类基因组染色体染色体上的DNAbinding蛋白系列的基因。Oct4，其表达与干细胞的多能性质相关，是控制哺乳动物胚胎发生的早期阶段的必要因素[14]。

在一定程度上，这个因子对于维持胚胎干细胞的自我更新特性是至关重要的，而其表达的任何增加或减少，都会改变细胞的命运。所以它参与了癌症形成的过程。到目前为止，还没有Oct4在分化细胞[15]中表达的报道。

最近的许多研究表明，Oct4基因在膀胱癌、乳腺癌和骨肉瘤的蛋白水平上表达。除此之外;Tai等人证实Oct4在几种癌症细胞系中存在，包括肝癌、肾癌、胃癌、宫颈癌和骨癌。然而，该基因在正常细胞中不表达，这表明它非常适合作为癌细胞的分子标志物[16,17]。

因此，在本研究中，我们检测了Oct4在胰腺癌细胞和正常胰腺细胞中的表达情况。

本研究的主要目的是证明Oct4是一种特异性的肿瘤启动子，在广泛的肿瘤中表达，尤其是在本研究中胰腺癌中，而在正常组织中不表达。本研究首次将Oct4基因启动子作为特异性肿瘤启动子在MIA Paca-2、PATU-8902和AsPC-1细胞系中的表达与健康胰腺组织细胞进行比较。

材料和方法

PDAC和非癌症胰腺肿瘤(NCPT)标本，AsPC-1、MIA Paca-2和PA-TU-8902细胞系购自伊朗德黑兰巴斯德研究所。在保证细胞健康的前提下，在培养瓶中培养105个细胞，经多次传代后，对基因进行分析，确定表达模式。

将样品放置在直接监督下，作为无菌和无菌微管中的活组织检查组织，它们通过美国MGM氮罐转移到实验室，并保持在-80℃直至RNA提取。培养并达到70％的密度后，从培养基（通过胰蛋白酶化）中分离细胞系，用PBS缓冲液洗涤两次后，分离出总细胞RNA。用于PDAC，NCPT标本，MIA PACA-2和PA-TU-8902细胞系的培养基是具有高葡萄糖水平的DMEM。ASPC-1细胞系的特定培养基是RPMI 1640 + 10％胎牛血清。培养培养基补充有1％青霉素/链霉素，细胞在37℃和5％CO中培养₂湿度为90％。细胞的倍增时间为25-40小时。每种活组织检查标本分为癌症和健康组织，在病理学家的监督下，并分别进行RNA纯化。通过分光光度计通过电泳和光吸收提取的RNA质量，将所有mRNA分子转化为cDNA，并在寡核苷酸（DT）12-18底漆的帮助下将它们转移到-20℃的冷冻机中。

使用底漆设计软件设计OCT4基因的前向和反向引物序列，然后在NCBI [18]（国家生物技术信息中的基本局部对准搜索工具）上进行爆炸[18]（基本的本地对准搜索工具），以确保其准确性（表1）。

目标基因	设计的oligo	底漆的订单	长度
OCT4	F	cgcaagccctcatttcac.	111.
	R.	CATCACCTCCACCACCTG

表1:Oligo (dT) 12-18引物

为了扩增所需基因，先制备引物，然后利用实时PCR技术扩增目的基因的mRNA (cDNA)。每个PCR中加入4微升专有的正、反引物、3微升cDNA、10微升MastermixSyber green和3微升DNase游离水(最终体积为20微升)，然后用一种特殊的粘合剂覆盖板以防止蒸发。将平板置于Real-Time PCR机中，按推荐程序(95℃循环30秒，条件为;95°C 10秒，52- 58°C 15秒，72°C 20秒)。所有上述测试至少重复3次。

发现和结果

本研究中使用的人类样本包括六个胰腺组织的活检标本。来自标准实验室试剂盒的AsPC-1细胞样本来自一名62岁高加索女性胰腺癌患者。来自标准实验室试剂盒的MIA Paca-2细胞样本，取自一名65岁胰腺癌患者的胰腺体和尾部。来自标准实验室试剂盒的PATU-8902细胞样本取自一名44岁患有胰腺癌的女性。胰腺导管腺癌(PDAC)样本取自55岁男性，NCPT样本取自50岁波斯男性，正常胰腺组织取自45岁波斯男性，均购自伊朗德黑兰肿瘤银行。

RT - PCR法检测Oct4基因在上述肿瘤细胞系及胰腺健康组织活检标本中的表达。在MIA Paca2、PA-TU-8902、AsPC-1、PDAC和NCPT中，Oct4基因的表达量比对照组(正常胰腺组织)高8-9倍。

目的基因(Oct4)在PDAC和NCPT、MIA Paca-2、PA-TU-8902、aspc -1细胞株中的表达率与对照组(正常)比较见表2、表1。

图1:Oct4表达率。

细胞系的样本	AsPC-1 细胞	米娅天竺鼠-细胞	pa - tu - 8902 细胞	正常的胰腺细胞	PDAC	ncpt.
目标基因:Oct4	9．2	8．5	8．3	1	9．6	8.

表2:Oct4表达率。

通过识别和显示二者的理论之间的相似之处,这些细胞的行为和胚胎干细胞,研究人员发现,Oct4gene,这是一个至关重要的胚胎干细胞的基因,是一个主要因素在这些细胞多能性和selfregeneration也是参与癌细胞[19]。

在本研究中，我们检测了Oct4基因在三个胰腺肿瘤来源细胞系(AsPC-1、MIA Paca-2和PATU-8902)、胰腺肿瘤组织周围的健康细胞、PDAC和NCPT中的同时表达。结果证实该基因在胰腺癌细胞系中表达增加，但在癌组织附近的正常细胞中没有。这一结果证实了大量癌症组织中的细胞具有自我再生的能力，不受控制的分裂将导致癌症组织的形成。

结论

本研究结果显示胰腺癌细胞表达控制自我再生的主基因，由于Oct4基因的表达被证明是干细胞基础的标志，因此可以认为这些细胞实际上是CSCs。

参考文献

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条信息

文章类型:研究文章

引用:Shahri SSZ, Sayyedalhosseini S (2020) Oct4基因作为一种新的肿瘤标志物在胰腺肿瘤和非肿瘤细胞系中的表达。J Diab Res Ther 6(2): dx.doi.org/10.16966/2380-5544.154

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出版历史记录：

收到日期:2020年11月06

接受日期:2020年11月18日,

发表日期:2020年11月24日,