摘要

背景:T1D是一种与肠道渗漏有关的自身免疫性疾病，可能与出生后第一年的喂养机制有关。IgG对膳食蛋白质的反应间接评估肠道通透性的破坏。本研究的目的是评估协会的早期喂养政权总对相关饮食抗原血清免疫球蛋白反应(麦胶蛋白,牛——酪蛋白和β乳球蛋白)在发病近年来的孩子,经过两年的进化,并确定具体的相对分布对这些蛋白质免疫球蛋白子类。

方法:对47名T1D儿童和15名健康对照组进行了病例-对照研究。研究人员记录了它们在出生后第一年的进食情况，并在采访时采集了血液样本。采用单克隆抗体ELISA法测定IgG总指数及其亚类(IgG1-4)。

结果:与健康对照组相比，T1D儿童更早地引入了牛奶。没有发现早期饮食和目前存在的IgG抗体之间的联系。然而，T1D患者对麦胶蛋白、酪蛋白和/或β-乳球蛋白的总IgG反应性增加。这些增加主要与IgG1、IgG2和IgG4亚类有关，如在其他肠道起源的自身免疫性疾病如乳糜泻中观察到的。在T1D中，醇溶蛋白作为抗原的潜力最大。

结论:在T1D儿童中发现的IgG反应模式有助于了解T1D肠道渗漏的影响，以及与不耐受和自身免疫相关的异常免疫反应。

关键字

饮食抗原;免疫球蛋白子类;肠漏;墨西哥;1型糖尿病

介绍

1型糖尿病(T1D)是儿童期最普遍的自身免疫性疾病之一。这是由于β细胞的破坏，通常导致绝对胰岛素缺乏。因此，它们的发病通常与一种或多种自身抗体相关的急性症状有关，并与DQA和DQB基因[1]相关。除了遗传易感性，环境因素的相互作用也很重要，比如饮食、感染和抗生素的使用;特别是，早期的喂养制度可能会改变日后患T1D的风险。使用含牛蛋白的婴儿配方奶粉代替母乳喂养，以及预期在婴儿饮食中引入谷物，是与自身免疫过程[2]密切相关的两个因素。

在婴儿配方奶粉中发现的主要蛋白质牛酪蛋白，以及最易引起过敏的牛牛奶蛋白之一β-乳球蛋白，都与T1D风险增加有关，不管胰岛自身抗体的存在与否。这是可能的，因为它们与葡萄糖转运蛋白GLUT2[3]和视黄醇结合蛋白[4]的结构同源，这两种蛋白都存在于人胰岛细胞中。关于谷物，根据越来越多的证据表明T1D和乳糜泻之间存在共同风险因素，有人提出小麦麦胶蛋白在T1D中发挥作用。已经描述了一个窗口期，在4到7个月的年龄，在此期间，建议将小麦引入饮食。其早期或晚期合并与自身免疫和T1D[5]风险增加相关。

麦胶蛋白和酪蛋白都可以改变肠上皮的通透性，有利于准细胞转运[3]。目前，“漏肠”模型是研究最多的领域之一，该模型试图解释T1D的起源，将其与其他因素联系起来，如肠道菌群组成[6]的变化。然而，尚不清楚这种模型是否在所有T1D患者中都是一种常见情况，或者是否根据疾病的阶段进行了修改。因此，评估这些抗原的体液反应可能是评估肠道通透性的一种间接方法，因为它们通过了肠道上皮。

本研究的目的是评估协会的早期喂养政权总对相关饮食抗原血清免疫球蛋白反应(麦胶蛋白,牛——酪蛋白和β乳球蛋白)在发病近年来的孩子,经过两年的进化,并确定具体的相对分布对这些蛋白质免疫球蛋白子类。

方法

对来自索诺拉州儿童医院(HIES)和一家儿科内分泌私人诊所的墨西哥儿科患者进行了病例对照研究。其中包括23名发病时(进化≤2 m)的T1D儿童，24名长期存在的T1D儿童(进化≥2 y)，以及15名没有T1D或过敏症状、总IgE滴度阴性的健康儿童组成的对照组。T1D发病组的样本平均年龄为9.8岁，≥2年进化T1D患者的样本平均年龄为11.2岁，健康儿童的样本平均年龄为9.1岁。

该方案获得了家长的知情同意，并得到了Centro de Investigaciónen Alimentación y Desarrollo, a.c.伦理委员会和HIES学习和研究委员会的授权。他们在接受内分泌科医生的例行检查时，与导师进行了半结构化的访谈，收集了他们在出生后第一年的进食史。然后每位受试者单独采集外周血3 mL，分离血清，4℃保存，以备进一步分析。

采用直接酶联免疫吸附法(ELISA)，根据我们实验室[7]采用的方法，测定醇溶蛋白、牛乳酪蛋白和β-乳球蛋白(Sigma-Aldrich，美国)的总IgG指数。简单地说，用100µL的5 ug/mL醇溶蛋白、酪蛋白或β-乳球蛋白包覆在碳酸氢盐包覆缓冲液(35 mM NaHCO)中_3.， 15mm Na₂有限公司_3.， 0.05%酚红，pH 9.6)。用洗涤液(0.1M Tris/HCl pH 7.4, 0.05%吐温20,0.05%酚红，15 mM NaN)四次洗涤后_3.)，室温下用1%的鱼明胶(Sigma-Aldrich)在洗涤缓冲液中孵育1小时进行封闭。再进行四次洗涤，然后用1:50稀释的患者血清在洗涤缓冲液中孵育2小时。后来四洗了,总发现免疫球蛋白与HRP-conjugated反人类免疫球蛋白抗体(Dako、丹麦)在洗涤缓冲1:20 00稀释2 h。三个洗后,第四个洗了PBS和合活动开发3、3´,5、5´-tetramethylbenzidine。反应在1m H时停止₂所以₄．在450nm下读取平板(Microplate Reader, Bio-Rad, Hercules, CA)。

利用健康儿童血清的吸光度值(光密度)确定每个检测蛋白的截止值，考虑平均值+2SD。以IgG抗麦胶蛋白、抗酪蛋白和抗β-乳球蛋白的血清反应性为指标，用每个患者的血清吸光度值除以临界值。指数≥1.0为阳性。检测总IgG阳性的血清，以确定IgG亚类对T1D中这些蛋白的反应模式。

采用ELISA法测定IgG总含量，以评价IgG亚类。如上所述，之前用醇溶蛋白、酪蛋白或β-乳球蛋白覆盖并固定的培养皿与患者血清一起孵育过夜。随后，进行四次洗涤，并将IgG1、IgG2、IgG3和IgG4与小鼠抗人IgG1-4单克隆抗体(Sigma-Aldrich，美国)在1:2000稀释的洗涤液中结合2小时进行检测。再进行四次洗涤，然后用1:2000链霉亲和素- hrp在洗涤缓冲液中孵育1小时。最后，经过三次PBS洗涤后，HRP反应与上述方法相似。所有的测量都是四倍稀释，报告的滴度对应于每个样品的平均值。

采用方差分析(ANOVA)和Tukey-Kramer检验评价各组喂养方案的差异，ELISA结果采用NCSS-2007非参数Kruskal-Wallis检验。计算比值比(95% CI)来评估生命第一年喂养方式与之后对麦胶蛋白、酪蛋白和β-乳球蛋白的总IgG免疫反应性之间的关系。P值小于0.05认为有统计学意义。

结果与讨论

健康儿童和T1D儿童接受母乳喂养的比例相同。而T1D患儿的母乳喂养时间平均缩短1.5个月，如表1所示。T1D患者引入牛奶的时间明显更早，平均为1.8个月，而健康儿童的平均时间为5.4个月。根据国际上的建议，对照组的所有健康儿童在4到7个月之间引入谷蛋白，但53%的T1D患者没有。虽然两组的平均值相似(p>0.05)，但T1D组的变异性更大，反映在更大的标准差上。

表1:健康和T1D儿童在生命第一年的喂养制度。

每组的平均值都显示出来了。样本大小。SD:标准差。组间显著差异(p<0.05)用星号(*)表示。

一些研究表明，在婴儿配方奶粉中引入牛乳蛋白的年龄与自身免疫和T1D[4]的发展之间存在关联，这与我们的结果一致。最近，Lamb等人[8]假设通过婴儿配方奶粉喂养早期接触牛乳蛋白会导致胰岛素耐受性的丧失，并促进胰岛素特异性T细胞的出现。然而，他们的结果显示，目前的牛奶摄入量比引入年龄的影响更大，主要是在低/中度HLA风险的儿童。这是一个有趣的发现，因为我们的T1D样本中只有36%的人具有高风险基因型，而64%的人具有低/中度HLA相关风险[9]。

将总IgG估计值与T1D患者的结果进行比较，计算其指标，发现96%(45/47)的患者IgG对麦胶蛋白阳性反应。此外，43%(20/47)的T1D患者IgG抗酪蛋白阳性，32%(15/47)的T1D患者抗β-乳球蛋白阳性。在T1D发病组和长期进化组中，三种蛋白的总IgG阳性比例在统计学上相似。

当评估早期喂养方案与抗麦胶蛋白、酪蛋白或β-乳球蛋白IgG反应之间的关系时，没有发现显著的关联。因此，在小麦引种年龄和IgG抗麦胶蛋白指数较高时，OR值为1.63 (0.4-6.1,95% CI)。同样的结果也出现在对酪蛋白(2.82,95% CI 0.7-10.8)和ß-乳球蛋白(2.5,95% CI 0.4-12.3)的IgG反应性的牛奶中。

在出生后的头几个月里接触牛乳，至少在8岁之前，都与抗牛奶蛋白的IgG亚类抗体滴度升高有关。IgG亚类在不同的时间达到成人水平。IgG1在5-7岁左右，IgG2在10岁左右，IgG3在7-9岁之间，而IgG4水平在生命的前两年呈上升趋势，然后下降，直到13岁左右达到成人水平[10]。这种在整个儿童期逐渐增加的模式反映了婴儿早期饮食接触[11]的长期影响。由于IgG4与粘膜相关，故有研究认为它与自身免疫和T1D[11]的发展有关。

在IgG阳性病例中，通过评估IgG亚类对这些蛋白的反应性，我们可以发现T1D的特定反应模式，检测出与T1D进化时间相关的一些差异，如图1所示。在醇溶蛋白中，发现IgG1、IgG2和IgG4亚类具有显著的反应性，表明IgG2与T1D进化时间有关。IgG3对酪蛋白的反应在T1D发病时显著升高，但在长期T1D组较低。此外，β-乳球蛋白与醇溶蛋白相似，IgG1、IgG2和IgG4水平升高。然而，由于其在95%的>患者中具有较高的免疫反应性，麦胶蛋白在T1D中显示出最高的抗原潜力。

图1:发病时和进化≥2年的T1D儿童与健康对照组相比的醇溶蛋白、酪蛋白和β-乳球蛋白特异性IgG亚类抗体浓度(n=15)。中位数和25- 75%的百分比范围(方框)。组间显著差异(p<0.05)用星号(*)表示。

在T1D儿童中发现的抗麦胶蛋白和抗β-乳球蛋白免疫反应模式以IgG1、IgG2和IgG4浓度的增加为特征，与在患有乳糜泻的青少年中报道的抗麦胶蛋白[12]相似。乳糜泻是另一种自身免疫性疾病，与T1D具有相同的遗传和肠道起源。由于乳糜泻和T1D患者均表现出较高浓度的IgG4亚类，提示Th2反应，这是过敏过程的特征，因此不能将这种反应单独归为Th1反应(主要与IgG1和IgG2有关)。在这方面，IgG4和IgE的产生是平行调控的;Th2细胞的白介素-4可诱导B细胞IgG4和IgE的转换。这可能部分解释了饮食是如何在生命早期调节免疫系统的正常或不成熟的。

综上所述，所有这些发现都支持T1D患者由于饮食和/或其特有的炎症过程而改变了肠道通透性这一事实。这导致膳食蛋白质通过肠上皮。因此，针对它们，不仅发展出一种细胞反应，还发展出一种体液反应。因此，儿童时期的炎症环境，包括pre-T1D和T1D，可能与免疫系统的异常有关，引发不耐受甚至自身免疫。

致谢

这项工作得到了墨西哥科学技术委员会(CONACYT)拨款S0008-2009-01-115212的资助。我们感谢Rene Valenzuela的技术支持。作者声明没有利益冲突。

参考文献

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文章类型:原文

引用:Mejía-León ME, Calderón de la Barca AM(2016)针对1型糖尿病儿童膳食抗原的血清IgG亚型。J Dia Res Ther 2(1): doi http://dx.doi.org/10.16966/2380-5544.115

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出版的历史:

收到日期:2016年1月08

接受日期:2016年1月20日

发表日期:2016年1月26日