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研究文章
从无龋和龋齿活跃的个体中分离出来的菌斑细菌糖发酵的最终pH，在频繁的糖和尿素漂洗后

海达尔哈桑贡纳Dahlen＊Anette Carlen

瑞典哥德堡大学萨尔格伦斯卡学院口腔微生物与免疫学系

*通讯作者:Gunnar Dahlén，瑞典哥德堡大学Sahlgrenska学院口腔微生物与免疫学系，哥德堡，瑞典电话:+ 46-31-7863262;电子邮件:gunnar.dahlen@odontologi.gu.se


总结

本初步研究的目的是评估牙菌斑对酸和碱的适应可能会不同程度地影响牙菌斑的假设在体外从无龋(CF)和龋齿活性(CA)个体分离的耐酸菌斑细菌从糖中形成的酸。从10个CF和10个CA个体中分离得到128个pH为5.2的细菌，分别用10%蔗糖和0.25%尿素溶液每天漂洗5次，前后各1周。对分离菌株进行表型鉴定，并使用微量滴定板测定其在蔗糖、葡萄糖、果糖和乳糖细菌发酵后的pH值< 5,5 -6和>6。在冲洗前后都有非变形链球菌链球菌和链球菌oralis表征CF组，而美国缓和的以及乳酸菌是CA组中最常见的。CF组在糖漂洗后，从糖中形成酸的菌株占pH <5的比例最高，而CA组在尿素漂洗后(尽管没有统计学意义)下降。这些发现符合普遍的观点，即龋齿活跃个体中的菌斑细菌适应酸性环境，因此在开始时比无龋齿个体中的菌斑细菌具有更高的形成酸和保护性氨的能力。这四种糖的模式是一致的，但需要更高的统计能力来证明每种糖的统计显著性。

关键字

酸形成;Supragingival斑块;龋齿;尿素;糖;表型


介绍

龋齿是一种多因素疾病，由糖形成的细菌酸和ph中和碱的形成是通过调节牙齿生物膜生态系统[2]的重要因素。一个不平衡的生态系统，其酸化程度超过碱化程度，可能导致牙齿表面的脱矿。然而，唾液缓冲系统和口腔微生物[4]产生的尿素和精氨酸的碱(氨)可以恢复平衡。

有报道称，与龋齿活跃个体相比，无龋个体的脲酶水平[5]和脲酶活性[3]高三倍，一些研究表明，无龋个体的龈上斑块- ph值更高[5-7]。人们进一步认识到，较高的龋病风险与口腔细菌[3]的低产碱能力有关。

几个在体外研究表明，牙菌斑细菌可以适应频繁接触糖[8]的低pH值。的在活的有机体内也有报道称菌斑细菌对酸性和碱性环境的适应性[6,9,10]。如果细菌分别从龋齿活跃个体和无龋齿个体中分离出来，那么关于细菌对碱性的适应以及它们对酸性和碱性环境的适应能力的报道很少。

在Hassan H等人[11]的研究中，糖发酵产生的龈上斑块pH值在活的有机体内在无龋和龋活跃个体中，分别用糖和尿素频繁冲洗一周，观察菌斑菌群对酸和碱的适应情况。对酸的适应对那些没有龋齿(无龋齿)的人的菌斑ph值有最显著的影响。对碱的适应导致龋齿患者(活动性龋齿)的菌斑- ph值略有增加。

该研究假设，如果菌斑细菌分别从无龋和龋齿活跃个体中分离出来，在酸和碱适应后，菌斑细菌形成的酸的最终pH值会有所不同。这项初步研究的目的是评估(在体外来自无龋和龋齿活跃个体的耐酸龈上菌斑细菌对糖发酵后最终pH值的适应影响。

材料和方法
菌株

该研究包括128个细菌分离株，这些细菌是在pH 5.2的[11]琼脂平板上培养龈上近端菌斑样本后获得的。10名无龋(CF)和10名龋齿活跃(CA)青年(15-21岁)分别在1周的适应期前和1周后，用10%蔗糖和0.25%尿素溶液每天冲洗5次。分离时，分别收集不同形态的菌落，在血琼脂上进行纯度控制，然后在-80℃下置于珠上保存。分离菌株在血琼脂上培养(血琼脂2号cm271;Oxoid，贝辛斯托克，英国，5%脱纤维马血和0.5%乳酸钠)在90%氮的大气中2和10%的公司2选择Mitis salivarius (MS)琼脂(Acumedia, Neogen Corp.， USA)、Mitis Salivarius-Bacitracin (MSB)琼脂[12]和Rogosa SL (RSL)琼脂(Acumedia)生长后，根据革兰氏染色和特征菌落形态进行鉴定，分别鉴定各种链球菌和乳酸菌。最终使用API系统(API 20 Strep, Biomerieux, Marcy l´Etoile, France)确认了链球菌分离株的物种鉴定。

在血琼脂上培养过夜后，接种菌落在脑心灌注肉汤(BHI, Acumedia)中生长，进行发酵试验。在对数期收集细菌，3500rpm离心5分钟，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤2次以消除培养基。将洗过的细菌用PBS稀释至分光光度计测量的光密度(OD)为1 (650 nm)，即109个细胞/ml。

测试溶液和pH指示剂

发酵试验中使用的糖是经过无菌过滤的2%蔗糖(Difco, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA)、葡萄糖(Difco)、果糖(Merck, Darmstadt，德国)和乳糖(Merck)的水溶液。所用的pH指示剂溴甲酚紫(瑞典Svenska Finkemikalier)，在0.3%的水溶液中制备，根据制造商的要求，在pH <5.2时变黄，在pH >6.8时变紫。

发酵试验

微滴度板(96 MicroWell™Nunclon™;试验中使用了nnc, Roskilde, Denmark)，其执行情况如前所述[13,14]。所有的糖都进行了重复测试。每孔加入BHI肉汤50 μl、糖50 μl、菌液10 μl、指示剂10 μl。以PBS孔代替细菌悬液作为对照。平板被实验室塑料箔覆盖，并在36°C的气氛10% CO中培养2N + 90%2．拍摄并保存在孵育24小时后的颜色登记照片，以记录所有测试在同一场合的颜色变化。试验由两名不知道分离株类型、分离株来源(CA或CF)或试验周期(酸/碱适应前/后)的检验员进行并分别进行评估。使用pH棒测试了不同颜色的井，得出的结论是，pH值<5(黄色)、5-6(黄色到紫色之间的颜色)和>6(紫色)的颜色可以被清楚地识别出来。

统计分析

使用SAS 9.1.3 (SAS Institute Inc, NC, USA)和Pearson’s Chi分析了适应前后组间细菌和组内糖酸形成差异的显著性2以及。

结果

总共有68个菌株链球菌，37链球菌oralis， 4变形链球菌,3.链球菌肝病杂志3唾液链球菌和13乳酸菌spp．被确定。非变异链球菌，例如。美国缓和的和美国oralis主导的嗜酸性隔离在CA和CF个人和总128隔离的分别是53%和29%(表1)。需要注意的是,唯一一次这些链球菌并不主宰CA组(4 14隔离)后酸适应(AAA)。此外,乳酸菌在各自的适应期之前(BAA/ BBA)和之后(AAA/ABA)，其他细菌，变异链球菌，年代肝病杂志,唾液链球菌，被隔离得更零星。这一发现在CF和CA个体之间存在显著差异(p<0.05，酸适应前和酸适应后p<0.01)。

细菌种类 CF CA CF CA
BAA * (n = 20) AAA # (n = 20) BAA * (n = 20) AAA #
(n = 14)		 BBA *
(n = 19)		 阿坝
(n = 14)		 BBA *
(n = 10)		 阿坝
(n = 11)
Streptococcusmitis 10 8 10 4 10 11 7 8
Streptococcusoralis 10 12 3. 0 9 3. 0 0
Streptococcusmutans 0 0 2 1 0 0 1 0
Streptococcussanguinis 0 0 1 2 0 0 0 0
Streptococcussalivarius 0 0 0 3. 0 0 0 0
乳酸菌。 0 0 4 4 0 0 2 3.

表1:分别从无龋(CF)和龋齿活性(CA)个体、适应酸前(BAA)和适应酸后(AAA)和适应碱前(BBA)和适应碱后(ABA)获得细菌分离株。
*表明CF和CA个体分离的细菌种类在酸和碱适应(Chi, CA)前有统计学差异(p<0.05)2测试)。
#表明CF和CA个体在酸适应后分离的细菌种类之间有统计学显著差异(p<0.01)2测试)。

图1显示了CF和CA个体中分别在(BAA)和(AAA)酸适应前(图1A和图1B)和在(AAA)酸适应后(图1A和图1B)能形成pH <5或pH 5至6的酸的分离株比例(%)。在两组(CF和CA)中，形成酸/ pH <5的分离菌比例均增加，且CF组的比例最高，但这一模式对所有糖都不具有统计学意义。在两个适应期之前，CA组的比例均高于CF组。适应碱后，在pH <5条件下，CF组蔗糖和葡萄糖的分离株百分比有轻微下降(图1C)， CA组的分离株百分比下降更一致、更清晰(图1D)，但两组中任何糖的分离株百分比都不显著。由于使用了非可比性单位(四种不同的糖)，各组之间没有进行统计分析。

图1:糖发酵后菌株在pH <5、5-6和> -6之间的分布(%)。
从无龋(图A)和有龋(图B)个体中分离出BAA前和AAA后的细菌，从无龋(图C)和有龋(图D)个体中分离出BAA前和ABA后的细菌。由于使用了非可比单位(四种不同的糖)，无法在组间进行统计分析。

讨论

目前单盲在体外研究评估了对酸和碱的适应对耐酸菌斑菌在糖发酵后降低pH的能力的影响。在ph5琼脂[11]培养基上培养无龋(CF)和龋齿活跃(CA)年轻个体的菌斑样本，分离出细菌。

无论是在适应酸和碱之前还是之后，CF个体都以非变异链球菌为特征链球菌和链球菌oralis，以前报道常发现无龋生物膜生态与控制酸性环境[15,16]。CA组的特点是更多的酸性和酸性乳酸菌变形链球菌在酸性环境中茁壮成长的链球菌[17,18]。

特别是CF组，酸性适应后形成pH <5的菌株比例增加，这表明非变异链球菌已经适应了新的环境，变得更加产酸。这与生态斑块假说相一致[16,17,19]，该假说认为糖的频繁摄入可能导致生物膜生态的转变，有利于细菌的酸性和酸性表型。

酸适应对CA组的影响较小，pH <5的分离株形成酸的比例较低。相反，CA菌株在碱适应后形成酸对pH <5的比例降低最为明显。这些发现可能是由于CA菌比CF菌具有更高的耐酸性，同时从一开始就有更高的代谢尿素和产生氨的能力。因此，可以预期CA分离株比CF分离株更容易形成酸和碱。这与CA组在两个适应期之前有更高比例的分离菌从糖中形成酸的比例一致(图1)。所有实验组和所有糖的总体模式都是一致的(图1A-1D)，尽管每种糖的差异没有达到统计学意义。

在最初的研究[11]中获得细菌的个体数量太少，无法在每组糖测试中达到统计学上的显著差异，这是本研究的一个局限性。

结果是在体外研究证实了在活的有机体内酸适应前后龈上斑块ph的变化。Stephan曲线显示CF组ph水平较CA组[11]下降更大。相反，ph值的增加对CA组具有后碱适应作用在活的有机体内，证实了形成酸的细菌比例下降，可将pH降低到<5在体外．

结论

综上所述，研究结果表明，在低pH(<5)环境下，无龋个体在适应酸环境后对糖的发酵能力最大程度地提高，而在适应碱环境后对龋齿活跃个体的发酵能力则降低。

相互竞争的利益

对任何作者来说都没有潜在的利益冲突。本文的内容和写作由作者自行负责。

伦理批准

之前的研究获得了细菌分离株[11]，该研究得到了瑞典哥德堡大学伦理委员会的批准(Dnr 282-10)。

确认

我们感谢Fanny Bjondahl小姐和Richard Olofsson先生执行发酵程序，以及Susanne Blomqvist女士在微生物处理和分析方面提供的出色的技术援助和指导。


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条信息

文章类型:研究文章

引用:Hassan H, Dahlén G, Carlén A(2020)从无龋和龋齿活跃个体中分离的菌斑细菌进行糖发酵的最终pH值。国际口腔卫生6(3):dx.doi.org/10.16966/2378-7090.319

版权:©2020 Hassan H等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

  • 收到日期:2020年12月12日

  • 接受日期:05年3月2020

  • 发表日期:2020年3月12