摘要

背景:通过微穿孔膜的细胞迁移可能有助于处理牙周缺损与周围再生元件的分离，这是使用闭塞膜引导组织再生所造成的问题。膜的宏观穿孔影响其力学特性，并消除其作为牙龈上皮和细胞外基质成分的屏障的作用。

材料与方法:将人牙龈间充质干细胞(Human Gingival mesenchymal stem cells, GMSCs)接种于预制孔径为0.4和3微米的胶原包被聚四氟乙烯(PTFE)孔和预制孔径为8微米的聚碳酸酯孔上腔室。在下房培养液中加入胎牛血清(FBS)相对对照组中的普通媒体。在下隔室计数迁移细胞。扫描电子显微镜成像的下表面穿孔的跨孔膜。

结果：与对照组相比，人牙龈间充质干细胞在胎牛血清趋化组中迁移更为显著。8微米穿孔膜组细胞迁移率高于3微米和0.4微米穿孔膜组，差异有统计学意义。扫描电子显微镜图像证实细胞通过穿孔迁移。

结论:本研究的结果证明，膜微型孔为0.4,3和8微米是适合用于人牙龈间充质干细胞迁移到趋化介质的孔径，并且在阴性对照中闭塞，不影响膜机械或闭塞性能可用于开发具有选择性细胞迁移能力的GTR膜。

关键词

指导组织膜;牙龈间充质干细胞;牙周再生;引导组织再生;牙周袋

介绍

尽管牙周组织[1]具有固有的再生能力，但牙周器械的完全再生很难实现。传统的牙周治疗往往导致肉芽组织和长连接上皮的修复，这意味着功能[2]的丧失。

2009年，Zhang等人从人牙龈组织[3]中分离并鉴定了间充质干细胞(MSCs)。Tomar等比较了人牙龈源性间充质干细胞(GMSCs)与骨髓源性细胞，证明了它们在许多方面的优势[4]。牙龈结缔组织中这种具有多能能力的细胞的存在，促使引导组织再生(GTR)膜的闭塞性进行必要的修改，从而使牙周创伤脱离这种细胞[5]。

Mardas等人的[6]比较了300微米穿孔的透性特氟隆膜囊的骨形成，以控制含有脱矿冻干同种异体骨移植(DBM)的闭塞膜囊，其中在透性和闭塞囊中形成了相似数量的骨。研究人员得出结论，未分化间充质细胞侵入牙周创面是不必要的。

临床上，Gamal和IACONO [7-9]比较了传统的闭塞阻挡膜到穿孔胶原膜。发现口袋深度的统计学显着降低以及两个膜的临床附着和临床骨水平的增加，穿孔膜组比闭塞膜组更多。

有选择地允许间充质干细胞通过GTR膜迁移而不损害膜闭塞性质的最佳穿孔直径尚未探索。在本研究中，对三种穿孔直径进行了实验，其中两种之前从未评估过GMSCs通过穿孔膜的运动动力学雷恩斯。

在Bhattacharya等人的一项研究中，口腔角质形成细胞显示出通过8微米穿孔聚碳酸酯膜[10]迁移的能力。这一数据表明，穿孔大于8微米的膜可能允许牙龈上皮侵袭牙周缺损。

我们所知,本研究将是第一个在科学文献来证明业务迁移的能力通过孔隙直径小至3µm和0.4µm化学引诱物和证明8µm多孔膜是闭塞的缺乏趋化因子的细胞迁移。这一发现揭示了使用合适的趋化剂允许某些细胞系从周围组织迁移到牙周缺损的可能性。

从这项研究中获得的数据将用于开发GTR膜的功能，从仅仅是一个机械屏障，到更适合组织工程的设备，用于细胞归巢技术的细胞过滤。

主要目的是研究GMSCs通过微直径孔向趋化因子迁移的潜力相对普通介质负面控制，作为进一步研究使用不同趋化因素的基础，以吸引特定标记物到牙周伤口的特殊细胞系。

材料和方法

采集人类牙龈组织样本

3例健康成人患者(34、30和43岁)的牙龈组织活检(3 × 2 × 2mm)。健康的牙龈由上皮细胞和下面的结缔组织组成，在美国纽约长岛石溪大学牙周护理诊所的冠延长手术中采集。

该研究由石溪大学(Stony Brook University)和艾茵·沙姆斯大学(Ain Shams University)的人类受试者研究委员会(committee of Research Involving Human Subjects)于2014年10月8日批准，批准号为[575741-1]。获得参与受试者的口头同意;他们被告知在干细胞实验室研究中使用他们丢弃的组织。

牙龈样本被送往纽约石溪大学的生物工程和干细胞实验室。根据Mitrano等人报告的培养技术，在富含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素和两性霉素的α改良Eagle培养基（α-MEM）中[11]。

牙龈间充质干细胞的培养

牙龈组织样品多次用磷酸盐缓冲的盐水（PBS）洗涤，并且使用外科刀片除去上皮。将结缔组织样本切成切片并使用外科手术刀片数15测量约1×2mm的小块。The minced connective tissue specimens were collected in 10 mL tubes and then digested with McCoy’s modified media: in 2 mg/mL Dispase II (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) in 4°C overnight and then in 2 mg/mL collagenase IV (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) for 40 minutes in 4°C [12]. The digestion reaction was inhibited by adding culture media composed of Dulbecco’s MEM enriched with 10% FBS (Gibco, Invitrogen Life Technologies, MA, USA), Penicillin/ Streptomycin (G100 units/mL, 100 µg/mL), and Amphotericin (Fungizone 0.25 µg/mL).

消化后的组织通过40 μm细胞过滤器(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)过滤，获得单细胞悬浮液，然后在10 mL试管中进行1200 rpm 200 RPC离心10分钟。将获得的细胞微球连续移液悬浮在培养基中，收集并以60个细胞/cm的浓度播种²在10厘米组织培养菜肴的选择single-cell-derived殖民地αmem 1 x (Gibco,表达载体的生命技术)补充10%的边后卫(Hyclone实验室,Inc .,洛根,UT,美国),50 U /毫升青霉素G 50μG / ml链霉素,和2.5μG / ml两性霉素B(二性霉素B)湿大气37°C, 5%的公司₂．24小时后，清洗细胞，加入新鲜培养基;每3天喂一次细胞，直到实验结束。

牙龈间充质干细胞的传代培养

观察细胞增殖过程中牙龈间充质干细胞的变化;当原代细胞培养达到90%汇合时进行传代，标记为0代，随后的传代相应标记。

人口翻倍试验

通过群体倍增试验评估增殖能力[13]；以5×10的速度种植GMSCs^3.细胞/厘米²在24孔板中，膨胀至约90%汇合，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA分离；然后进行细胞计数。GMSCs以5×10的速度重新播种^3.细胞/厘米²在24孔板的另一个孔中培养，直到细胞在体外衰老。在每个传代进行细胞计数，使用以下公式计算种群加倍:log₂最后手机号/日志₂种子细胞的数量。

GMSC的最终群体加倍值被认为是在每篇文章中获得三个连续段落的百分比量的总和。

GMSC的塑料粘附、菌落形成能力和表面标记表达

在倒置光镜下观察第五代牙龈间充质干细胞(GMSCs)，发现细胞聚集在50个以上。对细胞形状和测量进行形态学分析，第一个单细胞在第4天检测到塑料粘附，在第7天检测到不规则纺锤形的成纤维细胞形态。

菌落形成单位实验一式三份进行[14]。新鲜消化的牙龈组织以每皿1000个细胞的速度接种在P10平板中，在含有10%FBS的α-MEM中培养，并在增湿空气（37°C，5%CO）中补充₂）.每周更换培养基2次。14 d后，用磷酸盐缓冲盐水冲洗菌落2次，用4%多聚甲醛溶液固定，苏木精和伊红染色计数菌落。

牙龈间充质干细胞的表型鉴定

大约1 × 10⁵用2 μg/ml异硫氰酸荧光素- (FITC-)标记的小鼠CD73及其同型单克隆抗体，别藻蓝素- (APC-)标记的小鼠CD90及其同型单克隆抗体，藻红素- (PE-)标记的小鼠CD146及其同型单克隆抗体(BD Pharmingen，(San Diego CA, USA)和Alexa 555山羊抗小鼠的CD105无偶联小鼠单克隆抗体(DAKO, Carpinteria, CA, USA);它的对照是Alexa 555山羊抗小鼠，没有一种小鼠抗体。使用针对CD14、CD34和CD45的造血干细胞标记物和小鼠单克隆抗体(eBioscience, San Diego, CA, USA)在4°C中保存半小时。在经过离心洗涤和再悬浮两次后，使用美国纽约Stony Brook大学医院BD LSRFortessa细胞分析仪(BD Biosciences)对细胞进行流式细胞术分析。

体外GMSCs的分化能力

龈间充质干细胞(GMSCs)以8 × 10的剂量接种^3.细胞每厘米²6孔板培养，在成骨培养基[15]、成脂培养基[16]和成软骨培养基(Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中培养。28天内，每周更换2次培养基;PBS洗孔2次，4%多聚甲醛固定细胞。通过2%茜素红、油滴油红O和软骨糖蛋白与阿利新蓝(Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA)孵育鉴定出矿物沉积。

MTT细胞增殖试验

细胞接种在分光光度计管中，500µl α-MEM (Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)富含10%胎牛血清(Hyclone Laboratories, Inc.， Logan, UT, USA)。对照组接受无细胞培养基。试管与100µl MTT试剂(Trevigen Inc.， Gaithersburg, MD, USA)在37°C中孵育4小时，直到紫色晶体沉淀;抽吸培养基，每管加入DMSO 1000µl，使福玛赞染料溶解。最后，在波长为595 nm的分光光度计上测定MTT还原为福马赞的程度，该光度与样品内活细胞的数量成正比;这个实验一式三份。MTT评分用对照读数减去GMSCs MTT染色的分光光度计读数计算。

牙龈间充质干细胞的Transwell迁移实验

在transwell趋化室中进行细胞迁移试验[17]，将细胞分为三组。第一组包括孔径为8µm（直径为6.5 mm；美国纽约州康宁市康宁生命科学公司）的多孔聚碳酸酯膜。第二组和第三组包括用于12孔聚苯乙烯板的孔径为3µm和0.4µm的穿孔胶原性涂层PTFE膜（直径12 mm；美国纽约康宁康宁生命科学公司）。使用含有0.05%胰蛋白酶/EDTA的PBS收集细胞，并重新悬浮在无血清αMEM中。上腔的transwell植入物在无血清α-MEM中装载10000个细胞；根据组类型，下腔内容物有所不同：在对照组中，在趋化组的下腔中使用不含FBS的α-MEM，在不含趋化因子的情况下使用α-MEM，并添加10%胎牛血清（Hyclone Laboratories，Inc.，Logan，UT，USA）作为趋化因子。插入板上培养的细胞在增湿空气（37°C，5%CO）中培养₂) 24小时;然后抽吸上、下腔的培养基，PBS冲洗插入物2次，用棉签去除膜上方的细胞。迁移到下侧的细胞用4%多聚甲醛(PFA)固定2分钟，用PBS洗涤2次，用100%甲醇渗透20分钟，用1%结晶紫在80%乙醇中染色(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)，再用PBS洗涤2次。

切断跨孔膜，从插入物中取出，用笔在膜下侧进行标识，每组共6个膜。用40倍放大的倒置光镜在5个不同的代表性视野下计数迁移细胞，并计算每个插入的平均值进行统计学分析;这个实验一式三份。

微孔膜的扫描电子显微镜

用50、70、80、90和100%的乙醇连续稀释，每层膜浸泡10分钟脱水。然后在一个封闭的盒子中-80°C孵育过夜，并涂上金色的飞溅物(SPI-Module;结构探针公司，西切斯特，PA，美国)，并最终在石溪大学工程学院通过扫描电子显微镜检查。

统计分析

采用频率表和直方图检验数据分布的正态性;采用夏皮罗-威尔克检验和柯尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫检验计算平均值、中值和标准偏差。正态分布数据采用t检验和方差分析，然后采用Tukey’s post hoc检验;非参数数据采用Kruskal-Wallis检验，然后采用Mann-Whitney检验和Bonferroni校正。使用SPSS version 22 for Windows (IBM Corp.， Armonk, NY, USA)将显著性水平设置为atp≤0.05。

结果

克隆形成单位分析

表1显示了3次实验的GMSCs菌落的均值和标准差，在P10培养皿中，14天后具有典型的成纤维细胞形态体外培养。

偏差类型	实验1	实验2	实验3
SD	8	5	3.
的意思是	17	11	22

表1:菌落形成单元实验的平均值和标准差。

人口翻倍试验

表2显示了3次实验的GMSCs增殖能力，均表现出较高的分割性能，3次实验的数值接近。

实验	通道1	通道2	通过3	总计
实验1	1.807	1.541	1.328	4.676
实验2	1.417	1.449.	1.439	4.305
实验3	1.391	1.351	1.369	4.111

表2:三个实验的群体倍增结果和每个实验的总结果。

msc标记物的流式细胞术表达

流式细胞术分析用于从通道5中的牙龈组织表征培养细胞。图1显示了表达标记的荧光强度;CD105-Alexa 555为99％，CD73-FITC为98.1％，CD90-APC为99.9％，CD 146-PE为17.2％，显示间充质干细胞3个主要标志物的非常高的信号，而缺乏造血标志物CD14，CD34和CD45的表达。

图1:流式细胞术显示GMSC表面标记物的荧光强度。
菌落形成单位试验的代表图像。

体外multilineage分化能力

用茜素红色染色细胞显示染色的钙沉积物作为橙红色聚集体。在软骨形成培养基中培养的细胞的Alcian蓝色染色显示为蓝色的软骨蛋白，并且使用在脂肪培养基中培养的染色细胞的油红色显示细胞内的红色油滴。使用在常规培养基中培养的相同细胞系的相同染色，可以检测细胞分化沉积物的迹象。图1显示了在分化培养基中培养的细胞的代表性图像及其相应的阴性对照。

MTT试验

表3显示了GMSCs在第5代与普通培养基时的分光光度计读数，其中三次实验的分数没有显著差异。

实验	业务	控制	MTT
实验1	2.604	0.951	1.653
实验2	2.345	0.943	1.402
实验3	2.404	1.291	1.113

表3:用分光光度计对GMSCs MTT染色进行评分，并与普通培养基进行比较。

GMSCs通过微穿孔膜的迁移

8微米穿孔聚碳酸酯膜:表4显示了总GMSCs向FBS化学吸引介质迁移的平均值相对在三个实验中，培养24小时后的普通培养基阴性对照。数据显示为非参数分布，使用Mann-Whitney检验进行的统计分析显示出高度显著的统计学差异（p<0.001）。

8微米聚碳酸酯
实验	的边后卫化学引诱物	控制
实验1	21.8	0．6
实验2	21	０．２
实验3	19.4	1．8

表4:每8µm穿孔膜平均迁移细胞计数值。

0.4微米和3微米穿孔胶原膜:表5和表6显示了作为化学引诱剂的GMSCs向FBS迁移的平均值相对以纯培养基为阴性对照，孵育24小时后，分别通过3µm和0.4µm孔径进行三次实验。数据为非参数分布，采用Mann-Whitney检验进行统计分析，差异有统计学意义(p<0.05)，见图2、表5、表6。

图2:成骨诱导培养基中GMSCs钙沉积的a -茜素红染色。
B-在α-MEM和10%FBS中培养的GMSCs的相同染色，显示无钙沉积。
在成脂分化培养基中培养的GMSCs内油滴的C-油红染色。
d - 10%胎牛血清α-MEM培养的GMSCs同样染色，显示无油滴。
软骨诱导培养基中培养的GMSCs的E-Alcian蓝染色，显示软骨糖蛋白的蓝色染色。
f -在α-MEM(含10%胎牛血清)中培养的GMSCs同样染色，显示无软骨糖蛋白。

3微米胶原涂层聚四氟乙烯
实验	的边后卫化学引诱物	控制
实验1	5	０．４
实验2	7．4	0．6
实验3	3．8	1．8

表5:每3µm穿孔膜平均迁移细胞计数值。

0.4微米collagen-coated聚四氟乙烯
实验	的边后卫化学引诱物	控制
实验1	1．8	0
实验2	1	０．２
实验3	1．8	０．２

表6:每0.4µm穿孔膜的平均迁移细胞计数值。

8µm直径穿孔膜组的细胞迁移值最高，3µm组次之，0.4µm组最小。数据呈非参数分布，Mann-Whitney检验比较三个趋化实验组的迁移细胞计数，发现第一组和第二组、第二组和第三组之间有统计学差异，第1组(8µm孔径)与第3组(0.4µm孔径)差异有统计学意义，见表7和图3。

图3:A-Crystal violet-stained GMSCs迁移通过3µm直径的胶原膜穿孔，FBS趋化组，10倍，标尺:100µm。
穿孔胶原膜b -晶状体紫染色，阴性对照组，未见细胞迁移。
C-Crystal violet-stained GMSCs迁移通过0.4µm直径的穿孔胶原膜，FBS趋化组，10X，标尺:100µm。
d -高倍放大C图，结晶紫染色的单细胞经0.4µm孔径迁移，尺度为40倍，标度为20µm。
E-Sample图像计数细胞迁移到3µm穿孔胶原膜下腔室。

直径	的边后卫化学引诱物	控制	意义
聚碳酸酯(8µm)	20.7 * *	0．8	P.≤0.001
胶原蛋白涂层PTFE(3µm)	5.3 **	0.93	P.≤0.001
胶原涂层PTFE（0.4µm）	1.53 *	０．４	P.≤0.05

表7:8、3和0.4µm穿孔膜迁移细胞计数的比较及其意义。
*高统计差异。
*差异有统计学意义。

扫描电子显微镜

所有实验的扫描电镜分析都显示出多面体成纤维细胞形态，GMSCs的长胞质延伸通过穿孔膜迁移。直径0.4µm组,穿孔collagen-coated聚四氟乙烯膜显示迁移细胞的数量非常有限,只有迁移细胞的技巧可以看到的图片(图4),这证明了细胞会通过细胞膜,而不是通过任何其他方式。

图4:对比GMSCs通过不同微穿孔膜迁移的条形图(蓝色:FBS趋化组;橙色:阴性对照组;0.4u Col: 0.4µm孔径，胶原膜穿孔;3u Col: 3µm孔径，有孔的胶原膜;8u PC: 8µm孔径，多孔聚碳酸酯膜)。

在聚碳酸酯膜上迁移的GMSCs形状较平坦，分布在膜表面;相反，通过胶原蛋白涂层的PTFE膜迁移的细胞看起来更像球根，并被限制在胶原蛋白链内。这表明，在细胞迁移经过的不同材料中，GMSCs的形态不同，如图5所示。

图5:图像A至C显示穿孔胶原膜涂覆膜的0.4μm孔径下表面的SEM，GMSCs迁移通过膜胶原纤维，和FBS趋化性组。图像D至F显示穿孔胶原涂层膜的3μm孔径下表面的SEM，GMSCs通过胶原纤维迁移，FBS趋化性组。图片G至I展示了8微米穿孔多碳酸纤维，FBS趋化性组的下表面的SEM;我们可以注意到GMSCs通过孔（箭头）迁移。

讨论和结论

由于多能细胞数量和血管供应有限，临界大小的牙周骨缺损的再生能力降低;这导致它被更多的增生组织如牙龈上皮或高血管结缔组织[18]侵袭。GTR旨在防止牙龈上皮和结缔组织沿袋牙骨质壁迁移，为稳定血凝块创造空间，使具有再生能力的牙周韧带细胞侵入，实现牙周组织再生[18]。

Reddi等人于1987年首次提出了穿孔GTR膜的概念[19]，其中脱矿同种异体骨移植物被认为通过其骨形态发生蛋白，通过趋化性刺激未分化间充质细胞的迁移，并增加其增殖和分化为软骨母细胞，然后是成骨细胞。有人认为，GTR中使用的闭塞屏障膜可能阻止mi将未分化间充质细胞从附近组织迁移到屏障保护区，从而降低脱矿骨基质（DMB）的骨诱导作用[19]。

在研究Mardas,等人得出的结论是,其结果的主要原因是假定,DBM chemo-attractant间充质干细胞,缺乏足够的证据,除了巨大的孔隙大小将非选择性的成体干细胞;此外，作者没有解释骨细胞如何通过闭塞囊[6]侵入DBM移植物。

Gamal等人最近的一项研究表明，孔径分别为0.2、0.4和0.7 mm。他们实验了成纤维细胞和GMSCs的混合细胞群的迁移;利用扫描电镜，他们报告了Matrigel®Matrix (Cornig Scientific)通过宏观穿孔膜挤压。在他们的[20]研究中没有阴性对照。

在目前的研究中，飞行员体外本实验使用FBS作为化学引诱剂，通过宏观穿孔（400µm、700µm和1mm孔径）transwell模型测试GMSCs的迁移相对作为负面控制的普通媒体。细胞膜失去屏障作用,和所有的细胞在参议院的瘫倒在地上的钱伯斯由于重力的影响实验起始点,一个小时后,未发现细胞在胶原膜在趋化性组和消极的控制,这就解释了为什么Gamal等人最近的研究没有阴性对照组。

SEM分析表明，GMSCs通过不同直径的膜孔进行挤压。趋化组GMSCs呈成纤维细胞样形态，胞浆过程向膜孔内延伸;另一方面，阴性对照实验的下室没有细胞迁移的迹象，这证明在没有化学引诱剂的情况下，细胞膜对细胞是闭塞的。

比较两种膜材料上的细胞形态，可以发现细胞形态特征的差异。在聚碳酸酯膜上，GMSCs形态趋于扁平化，伪足较多，部分伪足呈细长状，而在胶原膜上，细胞表面较为粗糙，趋于符合胶原链的形状。

在本研究范围内，我们可以得出0.4、3和8 μ m直径的微穿孔膜适合于GMSCs的迁移，这可以用于具有合适趋化剂的细胞归巢技术。在不降低膜对不需要的细胞的屏障作用或影响膜的机械性能的情况下。需要更多的研究来测试不同的趋化剂在混合细胞群中吸引某些细胞系。

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条信息

文章类型:研究文章

引用：Al Bahrawy M，Gamal A，Ghaffar Ka，Iacono V（2018）在体外通过微穿孔膜啮合性间充质干细胞的迁移动态。INT J DENT口头健康4（4）：DX.DOI.ORG/10.16966/2378-7090.272

版权:©2018 Al Bahrawy M，等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

收到日期:2018年9月14日,

接受日期:2018年9月28日

发表日期:2018年10月04