摘要

背景：虽然有些证据表明，口腔微生物菌群的变化是常见的正畸治疗期间，但有些证据表明这些改变可能会延长一段时间后。虽然许多研究筛查了龋病病原体水平的变化，但更多的证据积累，以证明这些患者内的牙周病病原体的显着变化。虽然这主要的研究主要是低收入，但牙科学校的正畸诊所筛查了致癌病原体 - 迄今为止为牙周病原体提供多功能筛查。

客观的：这项研究的目的是完成一项对唾液样本的回顾性横断面研究，以筛选是否存在唾液Fusobacterium核，Treponema牙科菌，和牙龈卟啉单胞菌间正畸和非正畸患者（n = 125）。

方法：利用之前收集的唾液样本，利用针对每个感兴趣的病原体的特异性引物进行DNA分离和筛选。组间(正畸组和非正畸组)患病率差异采用卡方分析。

结果:这项分析显示，近一半的正畸患者样本和超过一半的非正畸患者样本中存在这些病原体。这些数据还表明，女性的患病率高于男性，而非正畸样本的总体患病率更高。这可能与较高的平均年龄、较大的体重指数(BMI)、较大的牙周凹陷深度(PPD)和龋齿缺失补牙(DMFT)评分有关。

结论:这些发现表明，迫切需要计划和实施一项前瞻性研究，以确定这些病原体在开始牙齿矫正治疗的患者人群中的基线患病率，以及这些水平如何随时间变化。这可能为口腔健康科学家和当地流行病学家提供更多相关的临床信息，以确定最脆弱的人群，以及预防不良口腔健康结果和与牙周病相关的长期后果的干预的最佳方法和时机。

关键词

牙周病原体;正畸治疗;唾液检测

介绍

虽然在正畸治疗期间的口腔微生物变化的许多研究必须集中在致癌病原体上[1,2]，但是更少的研究已经密切研究了对其他口腔植物的变化，包括牙周病原体[3,4]。研究表明，正畸治疗改变了口腔微生物组，并且可以直接和间接地改变口腔微生物组合物，从而显着增加了致癌和牙周病的可能性[5-7]。最近的证据表明，正畸治疗期间的微生物改变可能比治疗的持续时间保持，并且影响长期口腔健康结果[8-10]。

许多研究表明，口腔生物膜和潜在牙周病原体水平的基线范围和潜在牙周病裂缝，如果稳态被扰乱，可能会引发疾病[11,12]。这些病原体包括梭菌属nucleatum（FN），Treponema德尼西拉（TD），和牙龈卟啉单胞菌(PG)是慢性和持续性牙周炎的主要病因[12,13]。尽管近年来现代材料和正畸技术改善了口腔健康状况，但在许多患者中，当前的所有治疗都在一定程度上与牙周病原体水平的增加有关[14,15]。

近年来，涉及唾液生物标记物的新诊断方法提高了监测口腔和牙周疾病的能力[16,17]。这些进展有助于研究正畸治疗期间唾液筛查口腔微生物变化的研究[18,19]事实上，这所学校的研究已经利用唾液生物标记物来筛选正畸临床患者中的致龋病原体变化，尽管尚未在该患者群体中尝试大规模筛选牙周病原体水平[20-22]。

我们的研究告诉我们，正畸患者的口腔健康状况，尤其是在这个牙齿校本诊所，可能是特别关注的，由于大量低收入和少数病人谁可能面临更大的障碍和挑战，以获得高品质医疗[23,24]。这些致龋病原菌，具有增加的屏障，降低访问护理组合发病率较高，可以解释一些这些观察 - 尽管口腔微生物菌群内变化的全谱的保持不完整的。这些数据作为当前研究的目标，这是屏幕正畸与非正畸患者从此牙科学校门诊，并确定具体的牙周致病菌，如FN，TD和PG相对流行的基础。

材料和方法

人类受试者

方案提交“UNLV- sdm患者人群口腔微生物回顾性调查”(OPRS#762911-1)于2015年8月3日获得UNLV生物医学IRB批准。最初从符合条件的患者的方便样本中收集唾液样本并适当存档。排除标准包括选择不参与的患者，7岁及以下的患者，以及成年口腔癌患者。原研究“UNLV牙科学院儿科和成人临床人群唾液中口腔微生物的流行率”于2013年5月获得研究(人类)受试者研究诚信和保护办公室(OPRS#1305-4466M)的批准。本项目将对其中一些样本(n=125)进行回顾性检查。

唾液收集协议

虽然这是一个回顾性研究，但原始协议涉及临床唾液收集。随着样品被收集，各自为随机生成的独特非重复编号，以保护患者的机密性并防止研究偏差。

患者人口统计学

除了唾液收集外，还从每位患者身上获得了一些人口学数据。这包括性别、年龄和自我报告的种族或民族，以及一些生物特征数据，包括身高和体重等身体质量指数(BMI)参数，以及一些龋齿、缺失牙或补牙(DMFT)的临床观察，以及牙周袋深度(PPD)。

细胞计数和DNA分离

在唾液采集之后，每个样本都被冷却(使用冰)直到处理。如前所述，所有样品均使用标准aliquot(500µL)和来自Amersham Biosciences (Buckinghamshire, UK)的Genomic Prep DNA分离试剂盒进行处理[20-22]。用260/280 nm的吸光度读数测定DNA的质量和数量。

PCR:聚合酶链反应

为了筛选感兴趣的病原体（Fn，Td或pg），使用来自Fisher Scientific（Fair Lawn，NJ，USA）和TD，Fn，PG和The的引物的精确键完全PCR套件使用标准量的分离DNA。人类酶（对照）甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），由SEQWRIGHT（休斯顿，德克萨斯州，美国）制作

TD底漆（前进）;5'-taataccgaatgtgctcatttacat-3'

TD底漆（反向）；5'-CTGCCATATTCTTGTCATGCTCTT-3'

FN引物（正向）;5'-CGCAGAAGGTGAAAGTCCTGTAT-3’

FN底漆（反向）；5'-TGGTCCTCATGATCACACAGA-3'

PG底漆（正向）；5'-TACCATCGTCTTGGT-3'

PG底漆（反向）；5'-CGGACTAAACCGCATACTTG-3'

GAPDH引物（前进）;5'-atcttcaggagcgagatcc -3'

GAPDH底漆(反向);5 ' -ACCACTGACACGTTGGCAGT-3 '

每个PCR反应使用标准化量的DNA（1μg）具有相同的设置。基本参数在94℃下变性三分钟，然后在94℃下使变性为20秒，在不同温度下（基于引物序列）的变性60秒，在72℃下延伸。30秒，最终延伸，在72°C下延长五分钟。使用乙糖苷凝胶（LONZA：ROCZA，MAINE，USA）和UV照明使用乙锭，使用柯达凝胶逻辑100成像系统和1D图像分析软件（Eastman Kodak：Rochester，New Yorks，USA）进行了可视化的图像分析软件（Eastman Kodak：Rochester，USA）。。

DNA标准：GAPDH

利用现有的人类细胞系HGF-1建立了一个DNA标准，以确定相对终点或RE-PCR比较所需的最小细胞数。这允许测定DNA PCR条件,也称为最小周期阈值或CT可视化所需的最小数量的PCR循环一个已知数量的DNA聚合酶链反应和最大周期放大饱和或CS,如以前的工作[20]所述。采用该标准和方法，CT为20个周期(C20)，饱和度为35个周期(C35)。

DNA标准：PG

如下所述，从ATCC（FDC-381; Manassas，VA）购买了卟啉龙，如ATCC（FDC-381; Manassas，VA）。使用过夜生长悬浮液，发现650nm的吸光度读数，光学密度（OD）读数为0. 8°近似10^7.CFU /毫升。该悬浮液稀释后，细胞数为5.0 × 10^6., 10^5., 10^4.10.^3.CFU / ml，代表唾液微生物浓度，其对应于10的疾病风险^6.CFU/mL表示非常高的风险，最高可达10^3.CFU / mL的表示正常或平均风险。阈值或CT为PG被发现需要25个周期（C25）和饱和度被发现是45个周期（C45）。组合从所述GAPD和PG实验数据，CT分别为C20和C25，而CS是C35和C45，分别[20,25,26]。基于该信息，RE-PCR是使用那些范围在C30，这是在检测（CT）和用于两种生物体饱和度（CS）之间的限制内的中间周期执行。

统计分析

最初的样本量是用DNA提取试剂盒中较低的估计DNA回收率(90%)来确定的，以提供最小预期差异0。10.得到p=0的统计幂。80，显著性水平，α=0。05-最小样本量(n=50)为必需[27]。卡方分析用于确定患者人口统计学分类数据(性别、种族/民族)的任何差异，以及组间TD、PG或FN的任何差异(基于性别、种族/民族)。

结果

唾液样本根据最初招募患者的诊所进行分组，包括正畸诊所和（非正畸）主要诊所（表1）。正畸样本反映的总体分布与该诊所人群的总体分布相似。例如，来自正畸诊所（n=54）患者的样本中女性（59.3%）多于男性（40.7%），这与他们在整个正畸诊所中的总体分布大致相似（p=0.1941）。此外，少数民族患者样本的百分比（66.7%）反映了整个正畸诊所中大致相同的百分比（64.9%），无统计学意义（p=0.2330）此外，这些少数民族患者中的绝大多数自我认定为西班牙裔（n=28/36=77.8%）。

表1：患者样本和临床特征

在非正畸或主病区就诊的患者中，女性(50.7%)和男性(49.3%)的样本分布基本均匀，在总主病区人群中所占比例(49.4%，50.6%，p=0.4109)基本相同。大多数患者认为自己是种族或少数民族(60.6%)，这与总体临床患者构成(59.2%，p=0.3677)相似。与正畸诊所样本一样，这些少数民族患者中绝大多数是西班牙裔(n=34/43或79.1%)。

然后对这些相应的患者样本进行DNA分离，然后进行筛选和分析(表2)。这些数据显示回收率为98.4% (n=123/125)，与以前的研究相比具有可比性[20,21,28,29]。DNA浓度平均为474.5 ng/uL，在正畸样本中为578.5 ng/uL，在非正畸患者样本中为393.2 ng/uL。DNA纯度在1.61 - 2.0之间，可以通过PCR进行筛选，证实存在人类(GAPDH)和细菌(16S rRNA) DNA。

表2：恢复和分离DNA

如在材料和方法部分所描述的，产生了DNA的标准来找到阈值和饱和PCR循环（CT，CS）通常用于在相对终点PCR（图1A）相对起始的DNA浓度进行比较。使用这些标准和方法，CT为GAPDH在C20和PG中观测到C25，与对应的CS在C35和C45分别RE-PCR随后在C30完成，比检测下限更高（CT），但仍低于饱和的两者的限制（C35-C45）。

图1：对人（GAPDH）和细菌（PG）细胞进行DNA标准和定量分析PCR循环阈值（CT）或检测极限和循环饱和度（CS），揭示C25和C35之间的最佳筛选周期。PCR信号带强度（SBI）与起始细胞数（R²>0.97)，这将允许从筛选的唾液样本中获得一个近似的起始细胞数。PG (P. Gingivalis.）;GAPDH（甘氨醛-3-磷酸脱氢酶）

标准化的细胞数10的稀释液^6., 10^5., 10^4.10.^3.细胞/mL(人)或CFU/mL(细菌)相应处理。这些数字近似于研究表明唾液微生物浓度和疾病风险之间的关联[20,25,26]:

10.^6.CFU / ml表示风险非常高;

10.^5.CFU / ml表示高风险;

10.^4.CFU/mL提示中度危险;

<10^3.CFU/mL表示正常或平均风险

制备这些系列稀释建立PCR的标准曲线两者GAPDH和PG（图1B）。这些数据表明在周期30（C30），该信号谱带强度（SBI）几乎完美地与两个PG（起始细胞数R相关²= 0.9945）和GAPDH（r²= 0.9797）。

DNA分离后，对所有样本进行检测f . nucleatum（FN），t . denticola（TD）和P. Gingivalis.(PG)处于或高于预先确定的疾病风险水平(>10^3.CFU / mL）如先前的基于唾液的PCR筛选研究所述（图2）[20-22]。这些数据表明，在这些预定水平的52％，41.6％和48％的所有样品中分别存在于或高于这些预定水平的Fn，Td和Pg。更具体地说，正畸样品中Fn，Td和pg的患病率（46.3％，38.9％，44.4％）明显低于对照，非正畸样品（56.3％，43.7％，50.7％）

图2：使用先前建立的DNA标准从唾液中分离的DNA PCR筛选，以确定PCR循环阈值检测标准> 10^4.CFU / ml，发现近一半的样品被发现含Fn，pg和Td。更详细的分析显示，正畸样品具有显着降低Fn（P <0.01）和PG（P <0.05）的普及，以及TD的较低率低（P = 0.07），而不是非正畸样品。FN.(f . nucleatum),道明(t . denticola)；PG.(P.gingivalis)；χ²(Chi平方)，d.f(自由度)

为了确定正畸和非正畸临床样本中FN、TD和PG患病率的差异是否由于其他因素，我们进行了更详细的分析，以评估性别/性别可能产生的影响(图3)。尽管在所有正畸样本中发现了牙周病原体患病率显著降低的一般模式，但特别是在男性正畸患者中，只有FN患病率显著高于预期(p<0.01)。此外，尽管在非正畸(对照)样本中观察到较高的牙周病原体患病率，但性别/性别特异性模式也很明显，女性的所有牙周病原体水平均显著高于男性，但FN和PG水平也比例更高(p<0.01)。然而，在种族或民族类别之间没有观察到显著差异。

图3:对正畸样本进行性别分选的PCR筛查分析显示，除男性正畸患者比例显著高于男性外，其余患者的病原体患病率总体较低(p<0.01)。对非正畸(对照)样本的分析也显示了性别特异性模式，女性的病原患病率显著高于男性(p<0.01)。FN (f . nucleatum），Td.(t . denticola)；PG.(P.gingivalis)；χ²(Chi平方)，d.f(自由度)

对每个患者样本的额外人口统计学和健康数据也进行了分析和审查(表3)。这些信息包括患者年龄、体重指数或BMI、牙周袋深度(PPD)和龋齿、缺失牙和补牙(DMFT)评分，按诊所(正畸或主要诊所)分组，然后按性别和种族分类。本分析显示，正畸患者的平均年龄(24.4岁)明显低于非正畸患者(28.3岁)。虽然正畸样本中男性与女性、少数民族与非少数民族的年龄差异不显著，但与非正畸样本的年龄差异较大。此外，非正畸样本的平均BMI(29.3)也显著高于正畸样本(25.7)，仅在性别或种族和民族之间观察到微小差异。

表3：分析研究样本的人口学和健康参数
*差异有统计学意义(p<0.05);BMI(身体质量指数);牙周凹陷深度;DMFT (Decayed-Missing-Filled牙齿);T(双尾检验T统计量的临界值);SE(标准误差)

有趣的是，与差异很大的正畸样本（3.12）相比，非正畸样本（4.11）的PPD大得多。更具体地说，正畸样本中的男性PPD（4.67）比女性（2.66）大得多，而少数民族PPD（3.67）比白人（2.21）大。在非正畸样本中未观察到这些差异。正如预期的那样，DMFT得分差异显著，正畸样本的得分（10.75）低于非正畸样本的得分（23.56），两个诊所的少数民族的DMFT得分较高。

最后，进行分析以比较本研究的PCR筛选结果与同时收集的健康参数（表4）。由于大多数健康参数在正畸和非正畸样品之间显着差异，这种分析可以揭示这些附加变量与PCR筛选结果之间的关系。例如，尽管正畸和非正畸样品相对于Fn和Pg患病率存在​​显着差异，但这些差异似乎与来自这两组的总年龄或平均BMI显着相关。然而，在测量和牙周病原体检测的临床口腔健康参数之间存在一些重要的关联，例如PPD和TD流行率之间的关联，以及整体DMFT平均值和FN，TD和PG患病率。

表4：健康参数和筛查结果分析
*差异有统计学意义(p<0.05);FN.(f . nucleatum),道明(t . denticola)；pg（p.gingivalis）;YRS（年）;BMI(身体质量指数);牙周凹陷深度;DMFT (Decayed-Missing-Filled牙齿);χ²(Chi平方)，d.f(自由度)

讨论

这项研究的目的是确定与非正畸对照比较的正畸患者的具体牙周致病菌的口腔微生物负担。正如最近的证据表明，改变正畸患者的口腔微生物菌群的许多研究主要集中在致龋病原菌，而较少有研究探讨具体的牙周致病菌相关的潜在变化，如齿状突、核状突和牙龈状突——尤其是在成年患者中。虽然本研究使用的是之前收集的唾液样本，且不是更具体的，且与临床相关的龈沟液(GCF)，但这些方法与之前对该患者群体的回顾性研究[20-22]和其他最近发表的利用现有唾液库的研究[7,16,18]一致。本研究结果清楚地显示了正畸患者与非正畸患者样本之间的显著差异。

与之前对该正畸患者诊所的研究不同，以往的研究显示口腔龋齿致病菌的患病率要高得多[20,22]，本研究的结果发现，与主要患者诊所相比，该患者样本中的牙周致病菌水平明显较低。对这些观察结果的一种可能解释是，在主要诊所人群中，收入非常低的初次牙科患者所占比例过高，这可能与经过多次筛查、卫生和随访预约的正畸患者有很大不同[20,22-24]。此外，目前的研究样本量(n=125)比以往任何研究(n= 52至n=75)都大，这也可能影响了这些发现。有趣的是，这所学校最近的研究发现，在近一半的正畸样本中，主要是龋齿和一种牙周病原体(PG)，这与目前的研究[22]的结果大致相当。然而，先前研究中的非正畸样本显示，只有大约25%的PG处于或高于疾病风险水平，这远远低于当前的研究结果，这表明需要更多的研究来进一步阐明这些结果的不同性质。

本研究有几个局限性，在评估结果和结论时也必须加以考虑。回顾性研究设计可能通过招募团队的选择偏倚或患者参与或自我选择偏倚等其他混杂因素对结果产生了显著影响[20-22]。此外，仅在一次患者来访和时间点收集这些样本表明，从这种类型的横断面研究中观察到的牙周病原体流行情况不能得出暂时的结论。由于对每个患者样本的信息有限，没有试图标准化患者在正畸治疗期间的治疗时间，这可能进一步限制了可以从这些结果得出的总体结论。

由于两组之间存在显著差异，今后对该人群的研究应具有前瞻性，即在治疗开始前采集每个患者的临床样本，并在正畸托槽放置后的各个时间点采集相应的样本。这可能有助于解开这些可能混淆的变量[30]。这种前瞻性、多时间点分析也可以将正畸治疗持续时间作为分析[31]的另一个潜在变量。还可以同时收集其他感兴趣的数据，包括临床卫生评估、口腔卫生和饮食模式调查，以更准确地确定这些组内和组间随时间变化的差异的性质[3,32]。最后，一项前瞻性研究将允许临床唾液样本与来自牙龈沟液(GCF)的样本进行比较，以及直接从牙齿表面或正畸托槽近端不同部位采集的样本，这将允许对这些观察到的现象进行更有力的分析[33,34]。

尽管有这些局限性，这些发现是第一个详细描述这一患者人群中牙周病原体的流行情况以及与各种健康和人口统计因素的潜在联系。这些发现表明，迫切需要计划和实施一项前瞻性研究，以确定这些患者在开始牙齿矫正治疗时PG、FN和TD的基线患病率，以及这些水平如何随时间变化。这可能为口腔健康科学家和当地流行病学家提供更多相关的临床信息，以确定最脆弱的人群，以及预防不良口腔健康结果和急性牙周病相关的长期后果的干预的最佳方法和时机。

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条信息

物品类型：研究文章

引用：(1)正畸患者口腔微生物患病率与牙周病致病菌的关系。国际牙科口腔健康2(6):doi http://dx.doi.org/10.16966/2378-7090.210

版权:©2016 Jolley D等人。这是一篇根据知识共享署名许可证条款发行的开放获取文章，允许在任何媒体中不受限制地使用、发行和复制，前提是原始作者和来源均已获得授权。

出版历史记录：

收到日期:2016年5月02

接受日期：2016年6月21日

发表日期:2016年6月27日