摘要

作品简介:纳米硫酸钙是一种物理性能增强的新型支架材料。据报道，使用纳米材料制备功能性支架/生长因子递送系统比传统尺寸结构的优势在于，纳米材料增加了生长因子吸附和细胞附着的表面积。最近关于人血小板裂解液的报道表明，它是一种可靠的成骨生长因子来源，并能够增强成骨细胞活性的强劲增长。重要的是要确定释放的生长因子的含量以及它是否仍然具有生物活性。用生长因子处理纳米材料可能会产生新的可再生微/纳米环境，这可能对骨组织工程应用有用。

材料与方法:纳米硫酸钙与人血小板裂解液混合制备支架。量化生长因子在不同时间点从支架中释放的量，并通过测量植入支架后48小时内产生的间充质干细胞和人成骨细胞的活性来评估系统的生物相容性。

结果和结论:载人血小板裂解液的纳米硫酸钙支架对间充质干细胞和人成骨细胞的培养均产生显著的刺激作用。这表明支架系统释放的生长因子含量保持了其生物活性，也提供了额外的证据，表明纳米硫酸钙是一种高效的载体，能够传递生物活性分子，增强参与骨形成的关键细胞类型的活性。这些结果支持了功能性支架/生长因子输送系统的发展潜力，该系统可用于颅面骨缺损的治疗。

关键字

纳米硫酸钙;人类血小板溶解产物;血小板源生长因子;间充质干细胞;人类成骨细胞的细胞

缩写

nCS:纳米硫酸钙;hPL:人血小板裂解物;PDGF:血小板衍生生长因子;间充质干细胞;人成骨细胞:HOBs

介绍

在骨组织工程和牙科医学中，利用生物材料治疗人体骨性缺损是一个迅速兴起的研究领域。自体骨移植是最常见的骨增强和修复手术之一。然而，这种手术的临床成功和美容效果受到颅面骨缺损的大小和严重程度的限制。自体骨移植也与许多术后并发症有关，包括慢性疼痛、感染风险，以及额外的移植手术的潜在需求[1]。此外，由于患者可用的移植物材料体积相对较小，因此对于临界大小的颅面骨缺损的治疗，有必要采用其他方法。

生物相容性支架作为种植/移植的替代品在口腔医学中受到越来越多的关注，并代表了一种很有前景的治疗方法来替代自体骨移植治疗颅面骨缺损。理想的骨组织工程支架应具有良好的生物相容性、足够的机械强度和足够的孔隙率。最近，我们研究了纳米级硫酸钙(nCS)作为一种新型的物理性能增强的支架，如增加了生长因子吸附表面积和成骨细胞附着[3]。

目前骨科治疗性骨再生的研究主要集中在生物相容性支架的开发上，该支架可作为成骨生长因子控制释放的有效载体。已知血小板含有多种与骨形成有关的生长因子，如血小板衍生生长因子(PDGF-BB)、转化生长因子β (TGF-β)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)[4]。鉴于此，临床应用富血小板血浆(PRP)治疗骨缺损有许多好处，包括改善骨再生，同时减少术后疼痛和感染[5]的风险。

然而，尽管在再生医学中使用PRP作为生物材料的治疗辅助剂的许多研究报道了令人鼓舞的结果，但其在治疗颅面骨缺损的临床适用性尚未得到充分证实。可能导致报道的PRP临床疗效差异的一个因素是不同的制备方法。最近综述了制备PRP的各种技术，但它们的应用在临床医生中引起了混淆，因为每种制备方法会导致不同的产品(液体和凝胶)，具有不同的生物学和潜在用途[7-8]。目前，不断扩大的人血小板裂解液(hPL)的使用是基于其在增强间充质干细胞(MSC)活性方面的成功报道_年代)[9 - 11]。此外，Dozza及其同事2011年的一项研究报告称，将MSCs和血小板溶解物合并到胶原蛋白或纤维蛋白支架中，可以促进非骨水泥髋关节假体周围的新骨形成，并增强骨-假体界面[12]的骨整合。

在本研究中，我们选择重点研究hPL与MSCs以及人成骨细胞(HOBs)相关的成骨潜能。以前，我们报道过硫酸钙(CS)是提高HOBs活性的生长因子的有效载体在体外[13]。考虑到nCS相对于CS的物理特性增强，我们的研究旨在确定nCS是否可以作为生长因子在hPL中可控释放的合适载体，以及是否可以作为生物相容性支架，增强MSCs和HOBs的活性。

材料和方法

人血小板裂解液(hPL)购自Zen-Bio公司(Research Triangle Park, NC)。所有其他试剂均购自Sigma-Aldrich (St Louis, MO)，除非另有说明。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)，根据布法罗大学IACUC批准的协议(He et al .， 2012)从6-8周龄大鼠骨髓中制备，由Shuying Yang[14]博士慷慨提供。

人成骨细胞(HOBs)从人颅骨的原代培养物中获得，并从商业供应商scicell Research Laboratories (San Diego, CA)购买，并根据供应商的指导进行培养，除了细胞在α -minimum essential medium (MEM，Gibco, Life Technologies, Grand Island, NY)添加10%胎牛血清(FBS)。

nCS的制备及nCS- hpldiscs的制备

我们按照Park和同事[3]的程序编写了nCS。简单地说，采用低温真空法将二水硫酸钠转化为脱水的纳米硫酸钠，再经烘干制得半水合硫酸钠。采用辉光放电处理对产品进行消毒。然后将100 mg nCS与100µL hPL混合，制备了负载hPL的nCS(nCS-hPL)光盘。在聚乙烯硅氧烷(PVS)模具中，合成的膏体被加工成尺寸为3毫米、厚度为1毫米的圆盘形圆柱形颗粒。椎间盘需要在室温下大约2.5小时的孵育期才能硬化。

累积生长因子释放剖面

为了确定nCS是否能够以可控的方式在hPL中释放生长因子，我们测量了nCS-hPL光盘在37℃无补充培养基中培养96小时后释放的PDGF-BB的数量。鉴于其对HOBs生长的刺激作用，我们选择PDGF-BB作为hPL[15]的代表生长因子。在我们的实验中，首先将nCS-hPL光盘置于96孔组织培养板中。每孔加入200µL培养基。在4个不同的时间点(2、24、48、96小时)收集并储存介质。然后将椎间盘重悬于200µL的新鲜培养基中并孵育至下一个时间点。96小时后，使用ELISA试剂盒(R and D Systems, Minneapolis, MN)和酶标仪对收集的培养基样品中PDGF-BB的总量进行定量。

额外的生长因子释放研究

为了确定nCS是否能有效释放除PDGF-BB外的生长因子，我们还测量了在37°C无补充培养基中培养48小时的nCS- hpl培养皿中释放TGF-β和bFGF的数量。两个独立的实验，每个实验的设置与我们刚才详细描述的PDGF-BB研究完全相同。然而，在这些实验中，我们只收集了一次培养基，在48小时后。在这一点上，使用ELISA试剂盒(R and D Systems, Minneapolis, MN)和酶标仪对nCS-hPL光盘释放的TGF-β或bFGF总量进行定量。

nCS-hPL光盘的生物相容性评价

采用四唑盐(MTT)试验评估nCS-hPL相对于两种不同类型的细胞:MSCs和HOBs的生物相容性。在我们的研究中，首先将nCS-hPL椎间盘置于96孔组织培养板中。每孔加入200µL细胞悬浮在fbs补充的培养基中(10% v/v)。进行了三个独立的实验。首先，将MSCs接种于含hPL、稀释hPL (50% v/v)或不含hPL的nCS盘。第二种方法是在培养基中不植入nCS盘，或者在hpl补充的培养基中植入nCS盘(10% v/v)。第三组hob用nCS- hpl光盘或介质中的nCS光盘进行播种。在每个实验中，以100 mg nCS/ 100µL MEM的比例将未装载hPL的nCS光盘与未添加培养基混合，作为对照组。37℃孵育48小时后，将MTT试剂添加到细胞中2小时，并按照之前详细描述的[16]进行检测。

结果与讨论

生长因子释放实验表明，nCS能够控制PDGF-BB的释放。在最初的2小时潜伏期后，PDGF-BB的释放率在随后的每个时间点逐渐下降(图1)。在96小时，PDGF-BB的总含量(≈2500±10 pg mL)约为15%(340±40 pg mL-1)^－1)在每个nCS-hPL光盘被释放到媒体。除了PDGF-BB, nCS- hpl光盘也显示释放TGF-β和bFGF，从而进一步表明nCS是生物活性分子释放的有效载体(表1)。

表1:48小时后，负载hpl的nCS释放额外的生长因子;平均值±SEM;N =每组8个样本。

图1:装载hpl的nCS的累积PDGF-BB释放谱;平均值±SEM;n = 8样本。

通过测定48小时后植入nCS-hPL椎间盘的MSCs显示的活性来评估nCS-hPL椎间盘的生物相容性。对间充质干细胞进行了两次实验。在第一个实验中，比较了nCS-hPL培养皿与nCS培养皿和nCS培养皿中加入稀释hPL溶液(nCS-50% hPL)的MSCs的活性。与其他处理组相比，接种nCS- hpl光盘的MSCs组表现出显著更高的活性(图2)。进行第二个实验是为了控制nCS本身对MSC活性的潜在影响。当测量无nCS盘培养的MSCs活性时，与无hPL培养基中nCS盘培养的MSCs活性相比，没有显著差异(图3)。然而，当nCS盘培养的MSCs在有hPL的培养基中孵育时，他们表现出明显比其他治疗组更活跃。

图2:MTT细胞活性测定N =每组3-4个样本;* =与其他治疗组有显著差异;= p < 0.05方差分析。

图3:nCS盘培养的MSCs在含hple培养基中的MTT细胞活性;N =每组4个样本;* =与其他治疗组有显著差异;= p < 0.05方差分析。

在48小时后，通过测量植入nCS-hPL椎间盘的HOBs显示的活性来评估nCS-hPL椎间盘的生物相容性。在实验中，比较了nCS- hpl圆盘和nCS圆盘的HOBs活性。与其他治疗组相比，植入nCS-hPL光盘的HOBs组表现出更大的活性(图4)。

图4:负载高效液相色谱质粒的HOBs细胞MTT活性研究平均值±SEM;N =每组8个样本;* =与nCS盘培养的细胞有显著差异;= p < 0.05方差分析。

在这项研究中，我们证明了nCS-hPL椎间盘是一种生物相容性支架，允许以可控的方式释放生长因子，并通过增强MSCs和HOBs的活性提供了一种有吸引力的策略来改善骨再生。在之前的一项研究中，我们证明当使用等量的水重组人PDGF-BB (rhPDGFBB)制作nCS和CS椎间盘时，nCS比CS在20天内释放更多的rhPDGF-BB在体外[3]。在临床上，rhPDGF-BB与同种异体骨移植混合使用已被证明可促进牙周骨缺损[17]的强健骨再生。然而，由于成本和监管问题以及骨组织再生的自然物理化学过程的内在复杂性，临床使用人重组生长因子变得越来越令人望而却步。因此，与重组蛋白相比，PRP代表了一种更实用的用于牙科治疗的生长因子来源，因为它是一种自体制剂，因此消除了对免疫原性反应或疾病传播[19]的担忧。

然而，正如最近回顾的牙科文献，关于prp治疗的好处是不确定的，人类试验显示冲突的结果[6]。例如，Marx和他的同事在1998年对患有下颌骨连续性缺损的患者进行的一项研究中发现，与单纯使用[20]的患者相比，使用混合PRP的骨移植的患者骨再生更快、更好。另外，在2005年Thor和同事的一项研究中，涉及需要增加牙槽嵴以实现钛种植体的放置和整合的受试者，没有明显的PRP对种植体存活率和植骨愈合的积极作用可以被证明[21]。

在使用成骨生长因子功能化生物材料方面，Leotot等人在2013年对骨缺损小鼠的一项研究中发现，与单独使用HA/β-TCP支架的小鼠相比，使用hpl涂层的HA/β-TCP支架的小鼠显示出更好的骨形成和更致密的骨形成。反过来，我们的研究进一步表明了功能性支架/生长因子传递系统的发展潜力。此外，与HA/β-TCP相比，nCS具有纳米结构，增加了比表面积和孔隙率等物理特性。因此，在使用hPL制造nCS椎间盘时，成骨生长因子在支架系统的整个结构中扩散，保护它们不被降解，并帮助保持其局部水平不变。

结论

建立了负载hPL的nCS作为功能性支架/生长因子传递系统的潜力。支架释放PDGF-BB、TGF-β和bFGF，具有足够的生物活性，可以直接或间接增强MSCs和HOBs的活性。这项研究进一步证明了nCS是生物活性分子可控释放的有效载体。此外，我们的结果表明，nCS-hPL支架产生了新的可再生微/纳米环境，可能有助于骨组织工程应用。

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条信息

文章类型:研究文章

引用:Barone A, Morrell A, Dziak R(2016)纳米硫酸钙和人血小板裂解液作为生长因子传递系统的制备和表征。国际牙科口腔健康2(4):http://dx.doi.org/10.16966/2378-7090.172

版权:©2016 Dziak R，等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

收到日期:2015年11月09

接受日期:2016年1月11日

发表日期:2016年1月15日