摘要

在美国，牙齿矫正治疗在青少年中已经成为常规，在成年人中也在增加。尽管有这些积极的发展，牙齿矫正治疗经常与口腔环境的改变有关，这可能增加疾病的风险。虽然许多研究已经证明变形链球菌和龋齿病变之间的因果关系，但最近的证据表明，它只是更大的口腔微生物群落的一部分。最近的几项研究表明，存在一种新特征的致龋病原体，厌氧革兰氏阳性斯卡多via wiggsiae。这项回顾性研究之前收集的唾液样本来源于一个方便的儿童和成人患者样本，之前从内华达州大学拉斯维加斯分校牙科医学院(UNLV-SDM)诊所招募。本研究选取49例成人正畸患者和52例非正畸患者的唾液样本，共100余份。从这些样本中提取的所有DNA随后通过PCR进行筛选，发现了变形链球菌(SM)、牙龈链球菌(PG)和wiggsiae (SW)的存在，它们在非正畸和正畸患者中的患病率不同。在非正畸患者中，几乎所有pg阳性和sw阳性的样本也是sm阳性的样本。然而，在正畸患者中，没有一个sw阳性的样本是SM或pg阳性的。此外，对人口统计学变量的进一步分析显示，龋齿-缺失-补牙(DMFT)评分、牙周袋深度(PPD)、年龄、性别和BMI在组间没有差异，这表明需要继续在这一领域进行研究来阐明这些发现。

关键字

金丝桃龋齿；正畸学

介绍

正畸治疗已成为常规，在美国，大约有1%的年轻人（30岁以下）和近20%的青少年在任何特定时间接受某种形式的正畸治疗[1,2].尽管在美国正畸治疗的普及率方面取得了这些令人印象深刻的进步，但在改善服务不足人群（包括少数民族、投保不足和未投保人群）获得正畸治疗的机会方面仍存在许多差距[3-5]。许多正畸和其他牙科专业计划目前正在积极寻找低收入、少数群体和服务不足的人群，以期不仅改善口腔保健的获得，而且促进提高口腔健康意识、教育和其他资源[6-8]。

尽管取得了这些积极进展，并朝着改善口腔接触的方向迈出了一大步，但正畸治疗往往与口腔粘膜、牙龈和微生物群落的变化有关，这可能会增加疾病风险[9,10]。更具体地说，许多研究已经产生并评估了正畸治疗期间龋齿损害风险增加的证据，这可能对这些服务不足、低收入和少数民族人群产生不成比例的影响[11-13]。事实上，在过去几年中，该研究小组促进了少数民族的口腔健康研究，并在儿科、成人和正畸人群中开展了服务不足的研究，这些研究清楚地表明，由于接触障碍、健康知识水平较低，这些患者可能会增加口腔并发症的风险，预防性牙科护理的普及率降低，致龋、牙周病和其他口腔病原体的负担增加[6,7,14-16]。

尽管许多研究已经证明变形链球菌和龋齿病变之间存在因果关系，但最近的证据表明，变形链球菌等致龋病原体，当少量成分失衡时，构成更大口腔微生物群落的一部分，可能不成比例地影响龋齿风险，这一过程称为生态失调[17,18]。其中许多微生物种类是众所周知的，并已在致龋过程中进行了广泛的研究，包括链球菌、乳酸菌、细孔菌和放线菌[19]。然而，最近的一些研究表明，存在一种新特征的致龋病原体，厌氧革兰氏阳性斯卡多维亚wiggsiae[20-22]。

尽管龋齿研究的范围很广，但这些最近的研究表明，这些以前未被发现的(新的)致龋病原体，如美国wiggsiae，可能存在于口腔，可能带来额外的风险，并可能改变目前对龋齿筛查的理解[23-25]。然而，只有少数的初步研究关注这种新发现的生物，以及该生物在正畸治疗中可能造成的致龋潜力，而致龋风险可能相对较高[23,25]。基于证据的缺乏，本研究的目的是筛选成人正畸患者的唾液，以评估患病率美国wiggsiae与一组未使用矫正器的成人患者进行比较。收集的数据可能是评估该生物在公立牙科学校的正畸人群中存在的第一个数据，该学校主要服务于少数民族和服务不足的患者。

材料和方法

人类被试

这项回顾性研究先前收集的唾液样品的命名为“拉斯维加斯内华达大学口腔医学院（UNLV）牙科医学（SDM）儿科和成人临床人群中的口腔微生物患病率”（议定书15502-5068）于2015年2月6日由UNLV研究对象保护办公室（OPR）机构审查委员会（IRB）审查和批准。

研究设计

这项回顾性研究之前收集的唾液样本来源于一个方便的儿童和成人患者样本，之前从UNLV-SDM诊所招募。简而言之，所有参与者在收集人口统计信息和唾液样本之前都提供了知情同意。排除标准包括拒绝参与的患者(或其指定的监护人)。

唾液采集

在最初的研究方案中，同意的牙科患者被给予一个50毫升的无菌唾液收集容器，用于收集一个样本。样本被储存在冰上，直到转移到生物医学实验室进行筛选和分析。每个样本都被给予一个唯一的、随机生成的编号，以防止研究偏差和任何识别信息n。还收集了患者人口统计和健康信息，并给出了随机生成的匹配数字，用于分析目的，但随后没有任何研究团队成员可获得患者特定的识别信息。

细胞计数和DNA分离

在本研究中,所有以前收集唾液样本,含有脱落上皮细胞和细菌细胞,离心10分钟2100 g (RCF)和颗粒洗1 x磷酸盐(PBS)(美国犹他州Hy克隆:洛根)和resuspended 5毫升1 x PBS。使用台班蓝(Fisher Scientific: Fair Lawn, New Jersey, USA)、Zeiss Axiovert 40倒置显微镜(Carl Ziess, Inc: Thornwood, New York, USA)和血球计(Fisher Scientific: Fair Lawn, New Jersey, USA)测定上皮细胞数量。以确定是否有任何样品含有引起龋齿的病原体-美国wiggsiae或SW，使用基因组准备DNA分离试剂盒(Amersham Biosciences:白金汉郡，联合王国)和制造商推荐的血液和组织程序从唾液样本中分离DNA，该程序建议至少3.5 × 10⁵细胞(14 - 16)。将DNA重悬于50µL DNA水合溶液中(Amersham Biosciences: Buckinghamshire, United Kingdom)， 4℃保存。DNA纯度通过260和280 nm的吸光度比值计算(A260/A280比值介于1.59和2.0之间)。

聚合酶链反应(PCR)引物

然后使用Fisher exACTGene complete PCR试剂盒(Fisher Scientific: Fair Lawn, New Jersey, USA)和Mastercycler梯度热循环仪(Eppendorf: Hamburg, Germany)对每个样本的DNA进行PCR，使用以下引物美国wiggsiae，变形链球菌，牙龈链球菌、16S rRNA和甘油醛- 3-磷酸脱氢酶

(GAPDH) (SeqWright: Houston, Texas, USA) [14,16,20,21]:
GAPDH正向引物ATCTTCCAGGAGCGAGATCC;
GAPDH反向引物ACCACTGACACGTTGGCAGT;
16S rRNA通用引物ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT;
16S rRNA通用引物GGGACTACCAGGGTATCTAAT;
S. mutans前引物，GCCTACAGC TCAGAGATGCTATTCT；
S. mutans反向引物GCCATACACCACTCATGAATTGA;
牙龈P.向前引物TACCCATCGTCGCCTTGGT;
牙龈P.反向引物CGGACTAAAACCGCATACACTTG;
S. wiggsiae正向引物GTGGACTTTATGAATAAGC;
wiggsiae反引物CTACCGTTAAGCAGTAAG;

DNA标准:GAPDH

从标准化对照细胞、人牙龈成纤维细胞（0.3-0.5×10）获得的DNA标准⁶细胞/mL)，接近唾液样品中观察到的细胞浓度范围，用于建立校准和使用相对终点PCR (RE-PCR)进行浓度比较所需的最小阈值(CT)和饱和(CS)周期。背景或CT以上的GAPDH信号检测至少需要10个周期(C10)，在C50处观察到饱和或CS。

DNA标准:SM和PG

此外，从ATCC (Manassas, VA)中也获得了口腔细菌细胞系变形链球菌(S. mutans或SM) (NCTC-10449)和牙龈卟啉单胞菌(P. gingivalis或PG) (FDC-381)。简而言之，根据制造商[14]协议，将细胞解冻、划线并在Difco (Sparks, MD)的各自琼脂平板上培养。然后将每个菌落放置在胰酶大豆琼脂上，在37C条件下生长过夜;SM平板添加5%去纤维羊血，PG平板添加1%酵母提取物。然后选择单个平板菌落接种到液体肉汤培养中;为SM添加胰蛋白酶大豆汤，为PG添加胰蛋白酶大豆汤，然后在37℃下孵育过夜。随后用等量的菌悬液接种生长标准。使用分光光度法在650 nm处测量光密度(OD)并计数菌落形成单位(CFU)绘制标准曲线[14,24]。

浊度导致的外径为0.8对应于5.0 × 10⁷CFU/ mL用于两种细菌细胞系。连续稀释，最终浓度为5.0 × 10⁶, 10⁵, 10⁴和10^3.CFU/mL建立SM和PG的RE-PCR标准，与目前作为疾病(包括龋齿)风险生物标志物的微生物唾液浓度的最新理解相一致，这些标准为:10⁶CFU/mL=非常高风险；105 CFU/mL=高风险；10⁴CFU/mL =中度风险，< 10^3.CFU/mL =正常或平均风险[14,26,27]。SM和PG信号检测或CT高于正常或平均风险至少需要25个周期(C25)，饱和或CS在C45观察。根据C10位点GAPDH和C25位点SM、PG的CT数据，在C30位点进行RE-PCR，高于检测下限(CT)，但低于观察到的饱和下限(C45-C50)。

聚合酶链反应(PCR)

每个反应用一µg的模板DNA。初始变性步骤在94°C下运行3分钟。共运行30个扩增周期(C30)，包括94℃变性30秒，58℃退火60秒，72℃延伸30秒。最后延长在72°C下运行5分钟。PCR反应产物使用Reliant 4% NuSieve®3:1 Plus琼脂糖凝胶(Lonza: Rockland, Maine, USA)通过凝胶电泳分离。采用溴化乙硫染色凝胶的紫外照明显示条带，并使用柯达Gel Logic 100成像系统和1D图像分析软件(Eastman Kodak: Rochester, New York, USA)捕捉条带。

统计数据

为了确定这种使用唾液提取的DNA进行微生物组成的PCR筛选的适当样本量，使用了样本有限步骤DNA提取的回收率(90-95%)，以确定最小预期差异为0.10或10%[28]。采用显著性水平α= 0.05，幂函数p = 0.80，最小样本量为50 (N = 50)[29]。对样本总体进行描述性统计，卡方(χ²)分析以确定样本组和临床人群之间在人口统计学方面的任何显著差异。

结果

我们从49名成人正畸患者和52名非正畸患者中选取了100多份唾液样本纳入本研究(表1)。所有样本合并后的人口统计学分类几乎相等，男性和女性(51.5%，49.5%)，非少数民族(白人)和少数民族(西班牙裔，黑人，亚洲/其他地区)(55.4%，44.6%)。对正畸门诊的分布进行更详细的分析发现，样本中女性(61.2%)多于男性(38.8%)，这与正畸门诊人群的总体分布非常相似(p=0.9482)。一项对种族和民族人口统计资料的评估显示，近一半的样本来自非少数民族患者(48.9%)，这明显高于整个正畸门诊人群(35.1%)，具有统计学意义(p<0.0001)。

表1：研究样本的人口学分析

在成人非正畸样本的比较或对照组中，女性(42.3%)少于男性(47.5%)，这与她们在主要临床人群中的分布基本相同有所不同(p<0.0001)。此外，本分析显示大部分样本来自非少数民族(61.5%)，这与主要临床人群不同，也具有统计学意义(p<0.0001)。

每个选择的唾液样本都经过处理，以分离DNA，用于后续的PCR筛查(表2)。使用之前建立的方案和方法，从所有正畸和非正畸唾液样本中成功分离DNA，回收率为100% (n=101)。根据生产商的要求，其DNA回收率在可接受范围内(95-100%)，且与之前的研究结果相似[14-16,24]。DNA浓度范围从正畸样本的平均163.1 ng/uL到非正畸患者样本的平均172.4 ng/uL。DNA纯度通过260和280 nm的吸光度比值(A260/A280比值)计算，其范围为1.59和2.0。所有样品的PCR处理显示存在人类(GAPDH)和细菌(16S rRNA) DNA。

从这些样本中提取的所有DNA随后通过PCR进行筛选，发现了变形链球菌(SM)、牙龈链球菌(PG)和wiggsiae (SW)的存在，它们在非正畸和正畸患者中的患病率不同(图1)。正畸患者中SM患者的比例(69%)明显高于对照组(58%)。在PG中观察到类似的结果，显示PG的正畸患者(55%)明显高于非正畸患者(25%)。然而，SW筛查的结果显示，在正畸患者样本中(14%)患病率低于非正畸对照组(19%)。样本组(正畸组、非正畸组)间差异有统计学意义(p<0.05)。

为了进一步分析这些结果，对每个样本进行交叉引用，以确定是否有任何样本对所评估的一种或多种（多重阳性）病原体呈阳性（图2）。这些结果表明，在58%的非正畸（对照）患者中SM检测呈阳性的样本中，21%的样本SM和PG同时呈多重阳性，另外15%的样本SM和SW呈阳性，一小部分SM-PG-SW呈阳性（图2A）。几乎所有的PG阳性和SW阳性样本都是在SM阳性样本中发现的（图2B），这表明近三分之二（58%中的36%）显示多个阳性结果。

相比之下，正畸样本中SM检测阳性的比例要高得多(70%)，尽管也只有一小部分(22%)为多阳性(图2C)。此外，正畸样本中pg阳性样本的比例要高得多(55%)，只有部分与sm阳性样本重叠。令人意外的是，没有一个sw阳性的样本是SM-或pg阳性(图2D)。

表2:DNA的分离与回收

图1:

为了确定与其他人口统计学和健康变量的关联和关系，根据PCR筛查结果对数据进行分类（表3）。该分析显示，来自非正畸和正畸样本的SM、PG或SWFT阳性样本之间的龋齿缺失充填牙（DMFT）得分没有显著差异。此外，在比较这两组SM、PG和SW阳性样本时，牙周袋深度（PPD）之间没有发现显著差异。然而，进一步分析表明，与SM-或多阳性样本相比，PG阳性样本的DMFT评分和PPD均较高，无论样本来自正畸或非正畸样本。最后，SW阳性样本的DMFT评分高于SM、PG和多阳性样本的DMFT评分，PPD评分高于SM或多阳性样本。其他变量，包括年龄、性别或BMI，与总体样本人口统计数据无显著差异。

讨论

本研究的目的是筛选成人正畸患者的唾液，以评估SW的患病率，并与一组未使用正畸器具的成人患者进行比较。本研究结果清楚地表明，在这两例患者样本中，口腔病原菌的患病率存在显著差异——在正畸样本中，SM和PG的患病率相对较高。有趣的是，在正畸样本中，SW的患病率明显较低——这一发现可能与直觉相悖，基于关于龋齿微生物的现有信息[22,25]。

进一步分析显示，在非正畸组中，许多样本呈多阳性，检测到几种不同的病原体组合。此外，绝大多数PG-或SM-阳性的样本也被发现是SM-阳性的，只有一个主要的、单阳性的组携带SM。然而，与正畸样本的结果相反，SWpositive样本中没有发现SM-或PG，而且PG阳性样本中没有SM-或PG的比例要高得多。当这组人中SM和PG的总体比例更高时，这些数据可能表明，整个口腔生态系统的破坏可能会促进特定类型的口腔微生物的过度生长，与之相对应的是竞争生物的总体流行率下降。

最后，数据显示，PG-和sw -阳性样本的DMFT评分和PPD高于SM-和多阳性样本。以往的数据表明，DMFT评分和PPD往往是口腔健康状况较差的指标，在服务不足和少数族裔患者中可能更高，从这项研究中收集的数据可能有助于加强和加强口腔保健提供者的决心，以提高对这些重要问题的知识和意识，并降低获得牙科服务和护理的障碍[5-8]。虽然数据不建议矫正内SW患病率的增加人口,这些可能是最早发现矫正疗法可能足以破坏口腔生态和生态系统足以创造条件,支持一个主要类型的生龋齿的生物体,如SM或SW -而不是两个。该数据尤其有价值，因为它有助于评估公立牙科学校正畸人群中SW的存在，该学校主要为少数和服务不足的患者提供服务[6,7,14,15]。

图2:

表3:与其他人口统计学和健康变量的关联和关系

迄今为止，大多数关于SW的其他研究都涉及从患有严重早期儿童龋齿(SECC)的儿童中识别或检测这种微生物[20-22]。此外，最近的SW研究涉及直接从龋病病灶中检测SW[23,30,31]，而迄今为止，只有一项其他研究包括使用正畸器械[25]的患者。然而，这项研究评估了SM和SW的存在以及与白斑病变(WSL)的关联——白斑病变是龋齿发展的已知危险因素，但没有提供任何数据来分析个体患者SM或SW的存在。目前的研究是迄今为止唯一提供任何证据来描述单个sw阳性正畸患者口腔微生物组成的研究，这提供了一些证据，以建议一种新的，这种口腔生态的破坏可能足以创造有利于SM或SW生长的条件，但不是两者。

虽然这些发现可能是第一种在正畸和非正畸患者中筛选W.giggsia的方法，但对于这种性质的未来研究仍有一些局限性。首先，现有唾液库的使用限制了基于回顾性的这些观察得出的一些结论。研究设计。此外，尽管原始收集方案包括正畸和非正畸患者，但这些研究依赖于自愿参与者的便利样本，这些样本不是随机选择的，因此可能存在内隐的自我选择偏差[12,14]此外，这些患者样本是在单个时间点采集的，这表明无法就观察到的口腔微生物流行率得出暂时结论。

尽管基于研究设计存在这些限制，但这些发现是新颖的，可能具有临床意义，这表明计划和实施前瞻性研究以评估这些人群中的任何时间变化。能够阐明这一现象并描述随时间变化的任何时间变化的数据是最重要的作为已知的第一个此类研究，使用现有唾液样本的试点研究设计是在该患者群体中提供初始基线筛查的最佳选择，并提供了关键证据，表明需要在该领域继续研究。

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文章信息

Aritcle类型:研究文章

引用：Streiff j . j .， Seneviratne M .， Kingsley K .(2015)成人正畸和非正畸患者唾液样本中新型致龋病原体韦氏Scardovia wiggsiae的筛查和患病率。国际牙科口腔健康1(6):doi http://dx.doi.org/10.16966/2378-7090.159

版权：©2015 Streiff BJ等人。这是一篇根据知识共享署名许可证条款发行的开放获取文章，允许在任何媒体中不受限制地使用、发行和复制，前提是原始作者和来源均已获得授权。

出版的历史:

收到日期:2015年9月22日

接受日期：2015年11月28日

出版日期：2015年12月7日