摘要

目的:卡式肺是一种致病性真菌，可在免疫功能低下的患者中引起严重的间质性肺炎。接受移植手术的病人倾向于p .卡式肺肺炎(PJP)，尤其是正在接受免疫抑制治疗或有移植排斥反应的患者。我们在这里描述了两个肾移植病例的PJP，并证明了分子生物学在诊断和流行DHPS基因突变的重要性。

材料和方法:的诊断卡式肺采用常规技术:直接检测，用MUSTO修饰的GomoriGrocott染色(GG)、May-Grünwald Giemsa染色(MGG)和直接免疫荧光(DIF) MONOFLUO^™卡式肺IFA Biorad测试。分子诊断采用real-time PCR (Liferiver^™卡式肺^®)和聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)。

结果:对于这两个样本，MGG, GG和DIF染色无法检测到囊性或营养形态。实时PCR结果显示，两种样品的DNA数量分别为每毫升103拷贝和每毫升104拷贝。DHPS基因扩增显示该基因未发生突变。在使用磺胺甲恶唑/甲氧苄啶治疗14天后，患者的一般情况有所改善。

结论:我们的研究表明，PCR是一种比染色技术更快、更灵敏的技术。目前，实时PCR提供了一种定量和定性方法，检测阈值非常低，这使得区分简单定植和感染成为可能。

关键字

卡式肺；肺炎;实时聚合酶链反应;肾移植

介绍

肺囊虫病是一种机会性真菌病卡式肺1980年[1]. 0被分类为真菌。高达45%的人类免疫缺陷病毒(HIV)患者患有肺孢子虫肺炎(PJP)。此外，由于糖皮质激素、化疗或其他免疫抑制药物的使用，非艾滋病患者的PJP病例也在增加[1-3]。此外，这在移植患者中是一个日益严重的问题:在美国，高达25%的移植患者患有PJP[3]。

PJP的微生物学诊断通常基于呼吸道标本中的真菌染色方法的显微镜显示。分子生物学技术的发展极大地提高了诊断水平[4-6]。分子法比微生物法更具有敏感性和特异性[7,8]。此外，通过定量PCR (qPCR)，可以确定标本中真菌的数量，甚至患者的状态[4,9,10]。

这种疾病的预防和治疗以磺胺类药物为基础，特别是甲氧苄啶-磺胺甲恶唑联合用药(TMP-SMX)或复方新诺明。因此，选择了具有磺胺类药物靶点“二氢翼酸合成酶(DHPS)”突变的耐药病例[11,12]。

我们在此描述了两例肾移植患者的PJP，并证明了分子生物学在诊断和DHPS基因突变流行中的重要性。

方法

例描述

案例1:一名53岁女性，患有多囊肾病引起的肾功能衰竭，2016年接受肾移植，在霉酚酸酯-他克莫司-强的松龙偏硫苯甲酸钠治疗时出现慢性排斥反应。她因一般情况改变入院，包括虚弱、厌食、39°C发热和呼吸急促。实验室检测C反应蛋白(CRP) 355mg/ml, Hb=9.2g/dl, WBC=7800/mm^3.、PLT = 181000 /毫米^3.，尿素=14.5mmol/l，肌酐=303µmol/l, K=4.2mmol/l，血清钙=2.53 mmol/l。胸片示双侧肺泡间质综合征。血清学的念珠菌和曲霉菌是消极的;痰液中BK检测阴性。巨细胞病毒(CMV) PCR检测阴性。微生物学检查显示为尿路感染大肠杆菌和积极的p .卡式肺实时PCR。患者先服用他唑西林-环丙沙星-磺胺甲恶唑/甲氧苄啶，然后服用头孢他啶和磺胺甲恶唑/甲氧苄啶。一般情况下，一周后复查呈阴性p .卡式肺PCR。

案例2:一名男子，62岁，2002年开始接受肾移植手术。2018年移植物活检穿刺显示特发性外膜性肾小球肾炎，使用环孢素和高剂量皮质类固醇后复发。入院时临床检查发现体温38℃，下肢水肿。胸部x光片显示肺泡间质综合征。

血清学的念珠菌和曲霉菌是负的。尿、痰中BK检测阴性。血、尿培养均为阴性。CMV PCR阳性，为1136copies/mL。同时,聚合酶链反应p .卡式肺是正面的。患者接受Cymevan、augmenin和磺胺甲恶唑/甲氧苄啶治疗，减少免疫抑制药物的剂量。

在第14天进行第二次PCR后，一般条件得到了改善p .卡式肺负的。

微生物方法

呼吸道标本(两例患者痰液)6000g离心10min。部分悬浮颗粒(约200µl)用于显微镜检查(MGG、GG染色)，200µl用于实时PCR检测和定量p .卡式肺DNA和PCR-RFLP用于检测DHPS基因突变p .卡式肺菌株。

传统techniques-microscopy

MGG染色突出囊内小体和/或滋养体p .卡式肺．Giemsa染色所有肺孢子虫生活史阶段的细胞核呈紫色，但不染色细胞壁，而GG染色的包囊壁p .卡式肺黑色棕色，绿色背景。

DIF使用MONOFLUO试剂盒^™卡式肺IFA Test (Biorad)允许通过免疫标记突出病原体(囊肿或营养形态)的存在。根据制造商的使用说明，病原体附着在荧光素标记的抗体上使其呈苹果绿色。

分子诊断

利用生命河进行实时PCR^™卡式肺^®允许检测和定量p .卡式肺DNA。采用PCR-RFLP进行DHPS位点分析。

结果

对两个样本，MGG和GG染色不允许检测囊性或营养形态。DIF技术也保持阴性。Real-time PCR结果显示，两份样品分别为103拷贝/毫升和104拷贝/毫升。

(图1)显示了的量化p .卡式肺DNA。(图2)为常规PCR扩增DHPS基因在370bp处的结果。PCR RFLP显示两例患者该基因均未发生突变(图3)

图1:实时荧光定量PCR检测PJ DNA的曲线。
我:放大曲线;A1 ~ A6: DNA浓度为107 ~ 10 2 copies/µl的标准品;A1 (107)， A2 (106)， A3 (105)， A4 (104)， A5 (103)， A6(102)，案例1:被测样本;-: -控制。
2:由Cp(交点)值构成的标准曲线与log DNA拷贝数/(范围=107 ~ 102拷贝/µl)。

图2:琼脂糖凝胶电泳常规PCR产物p .卡式肺DHPS基因370pb。
道:M (100 bp DNA大小标记);1(案例1);2(例2);P(积极的控制);N(-控制)。

图3:RFLP-PCR产物琼脂糖凝胶电泳p .卡式肺DHPS基因由accI和HaeIII基因表达。
道:M (100 bp DNA大小标记);1和2(AccII限制后的病例1和病例2);I和II(经HaeIII限制后的案例1和案例2)。

在使用Bactrim治疗14天后，患者的一般情况有所改善^®是指出。甚至是实时pcrp .卡式肺之后的间隔是负的。

讨论

目前，由于使用抗肺囊虫药物，hiv感染者肺囊虫病的病例呈下降趋势卡式肺化学预防(1,4,13)。然而，在过去15年里，在其他易感免疫缺陷[1]患者中，尤其是移植受者中，[1]的发病率显著增加[14-17]。在我们的研究中，我们诊断出p .卡式肺在两名肾移植患者中，非艾滋病毒感染者Magne等报道了805例PJP，包括264例(33%)非hiv, 86例接受了移植，其中37例肾移植。

在我们的研究中，病例1有慢性排斥的概念。病例2为巨细胞病毒感染。病例1从移植到发病的中位时间为18个月，病例2为16年。一些危险因素已被确定为PJP移植患者的易感因素，最明显的是免疫抑制治疗、移植物排斥反应、巨细胞病毒感染和年龄较大[3,19]。Bostnar等报道13/601(2.2%)的移植患者出现了PJP。从移植到发病的中位时间为17个月[4]。3例患者在移植后一年内出现PJP, 3例发生移植排斥反应，6例发生巨细胞病毒感染。新的研究表明，大剂量、长疗程皮质激素免疫治疗和抗淋巴细胞抗体治疗是肾移植[20]后PJP的特殊危险因素。

PJP以干咳伴进行性呼吸困难为特征，常在双侧发热情况下发生低氧间质性肺病。我们的病人有发热、咳嗽和肺泡间质综合征。

两份标本Real-time PCR均为阳性，常规方法未检测到包囊和滋养体。染色技术对支气管肺泡灌洗标本的敏感性可接受(89-98%)，但对抽吸和痰标本的敏感性较低(35-78%)[1,5]。在Bossart等人的研究中，所有31个pcr均为阳性，其中30个DIF阳性。唯一的结果不一致的病人是慢性阻塞性肺疾病[4]。显微镜方法缺乏灵敏度的原因是当样本是非侵入性或浅表时，很难阅读。事实上，分子生物学技术在PJP诊断中的引入提高了PJP的检测灵敏度p .卡式肺(86-100%)无论样本是支气管肺泡灌洗、抽吸或痰标本[6]。实时PCR的主要优点是扩增和检测步骤在封闭系统中同时进行，这降低了污染的风险。Real-time PCR阳性对照也有明确的定量(10⁷毫升^－1副本)。此外，它允许检测DNA，即使是少量的DNA，也可以确定是简单的定殖还是感染，从而确定患者的状态[5,4]。

的出现p .卡式肺最近，编码二氢翼酸合成酶(DHPS)的基因突变提示了耐药。Jarboui等人发现，在21例免疫缺陷患者中，只有17例(81%)DHPS扩增阳性。只有2例患者与野生型和突变型[21]相关。然而，Besser等人并未从瑞典患者中检测到DHPS基因的任何突变。同样地，我们在两例患者中均未检测到DHPS基因的任何突变，也未检测到[11]治疗14天后患者一般情况的改善。突变的缺失是仅使用磺胺甲恶唑/甲氧苄啶作为PJP一线治疗的结果[11,22]。

结论

PJP是一种严重的机会性呼吸道感染，可使许多免疫抑制相关疾病的病程复杂化。总之，我们的结果表明，实时PCR比传统技术更敏感，可以添加到每个专业实验室的诊断武库。另一方面，如果在HIV患者身上进行研究，DHPS突变的频率可能更高。事实上，他们目前接触到的磺胺类药物会导致对这些分子的耐药性。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

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条信息

文章类型:病例报告

引用:Nawel B, Latifa M, Hana S, Imen K, Yosra S, et al. (2021)卡式肺肺炎:两例肾移植患者的分子诊断和抗菌药物敏感性。临床病例6(2):dx.doi.org/10.16966/2471-4925.220

版权:©2021 Nawel B，等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

收到日期:2021年4月20日,

接受日期:2021年5月04

发表日期:2021年5月11日