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文章类型:研究文章

引用:Crochiere男，Senapedis W，卡什亚普T，Rashal T，麦考利d，等。（2016）核出口化合物，Selinexor，抑制NF-κB，诱导抗非小细胞肺癌活性不管p53状态的的选择性抑制剂。诠释J癌症研究分子机甲2（2）：DOI HTTP：//dx.doi。组织/ 10.16966 / 2381-3318.126

版权:©2016 Crochiere M等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

收到的日期：07年4月2016年

接受日期:2016年4月27日

发表日期:2016年4月29日(

摘要

非小细胞肺癌（NSCLC）的预后不良，甚至与不同的治疗方案。不幸的是，电阻迅速发展和需要的新疗法。Exportin-1（XPO1）在许多类型的癌症中上调核输出蛋白。通过selinexor XPO1的抑制（KPT-330），核出口（SINE）的化合物，导致肿瘤抑制蛋白（TSP的），细胞周期阻滞和癌细胞死亡的核积累的口服选择性抑制剂。Selinexor在I期和在许多不同的癌症适应症II期临床试验（参见clinicaltrials.gov的详细信息），包括肺癌（NCT02351505）被评估。迄今为止，selinexor已经给予> 1400例患者，并表现出与管理的副作用良好的耐受性。在这项研究中对非小细胞肺癌细胞的生长和细胞凋亡selinexor的影响在体外进行了评价和在活的有机体内．无论遗传背景（EC50：25-700nm）抑制硒氧杂交抑制肿瘤细胞生长和致克隆形成和诱导细胞循环滞留和细胞凋亡。XPO1蛋白P53，P21，IκB，E2F4和Survivin在4至24小时处理后，用Selinexor进行了强烈的核定位，然后进行细胞凋亡（即PARP，Caspases-3和-8裂解）。Selinexor改变了A549中NF-κB抑制剂IκB的定位和NC-κB的功能评估，NCI-H1299揭示了与在细胞增殖测定中测量的抑制类似的EC50值的转录镇压。用硒化合物处理的小鼠中的A549异种移植物显示出明显更大的肿瘤生长抑制（在20mg / kg硒向氟醚vs载体的％Tgi = 81％，P <0.0001）与顺铂处理的小鼠（在5mg / kg顺铂的5mg / kg Cisplatin Vs与车辆相比，车辆，P = 0.06）。使用IHC对石蜡嵌入式组织，处理过的肿瘤显示细胞增殖（KI67），同时诱导P53，P21，FOXO1，Survivin，NF-κB和IκB的核积累。在NSCLC中，Selinexor迫使TSP的核保留，抑制肿瘤生长和NF-κB转录活性，并且无论p53状态如何，都会诱导细胞死亡。这些数据显示了治疗NSCLC的治疗潜力。

关键字

XPO1;非小细胞肺癌;Selinexor;茶匙;出口;癌症

介绍

肺癌是美国癌症相关死亡的主要原因。非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)包括腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌，约占所有肺癌的85%[1,2]。目前，手术、化疗、放疗、靶向治疗等现有方案获益有限，晚期患者5年总生存率≤10%，1期患者>为70%。新型、有效和耐受性良好的药物的设计，被涉及各种类型的非小细胞肺癌发生的复杂的、尚不清楚的分子机制所混淆。此外，大多数肺癌表现为播散性疾病，并含有多种突变，使它们在最初或迅速对现有疗法产生耐药性。在非小细胞肺癌中，肿瘤组织的基因组研究表明p53状态可能是治疗结果的预后指标。由于p53通路参与了化疗或放疗DNA损伤后启动细胞周期阻滞和凋亡，NSCLC患者中p53突变(42%)或多态性(42%)或p53抑制剂MDM2过表达可能会降低标准治疗[3]的疗效。因此，对于NSCLC来说，不依赖于功能性p53的治疗是非常必要的。

肺癌细胞转化的主要要求是肿瘤抑制蛋白(tsp)如p53[4]的失活和细胞存活途径如NF-κB信号[5]的异常激活。正常的TSP和NF-κB信号通路可以通过灭活突变和/或这些通路中蛋白的亚细胞定位改变(如p53、FOXO、IκB等)来实现[6-8]。蛋白质通过核孔复合物的运输是由一种称为核细胞蛋白的蛋白质家族完成的;importins将含有核定位信号的货物运输到细胞核中，而exportins将货物蛋白(以及通过RNA结合蛋白运输的特定RNA分子)与核输出信号从细胞核运输到细胞质中[9-11]。大多数tsp调控转录，需要核定位才能实现其肿瘤抑制功能。此外，核内IκB保留可抑制NF-κB[7]的转录活性。因此，TSPs和IκB的核输出是中和其功能、促进肿瘤细胞生长的有效途径。

目前已知的核输出蛋白有7种，其中出口蛋白1 (XPO1;染色体区域维持1;CRM1)，被认为是大多数tsp的核转运体，如p53[12,13]、FOXO[14]、pRB[15]，以及>200其他cargos[16]。在包括肺癌在内的多种癌症中均发现XPO1蛋白过表达，且与预后不良相关[17,18]。leptomycin B (LMB)是一种高效、天然的XPO1抑制剂，对XPO1的抑制抑制了肺癌细胞的生长，并诱导了p53野生型(wt)和p53突变型肿瘤的细胞毒性，而对正常支气管上皮细胞[13]的影响较小。尽管这些数据表明，靶向XPO1治疗肺癌可能有用，但LMB (elacocin)在临床中被证明无效，因为在人类中存在明显的毒性，而这些毒性被认为与XPO1抑制无关[19,20]。最近，强效小分子选择性核出口抑制剂(SINE)化合物selinexor (KPT-330)对XPO1的抑制显示出广泛的临床前抗癌活性和特异性[21]，目前正在多个不同癌症适应症的I期和II期临床试验中进行评估(看到clinicaltrials.gov)，包括肺癌(NCT023515050)。据报道，另外的SINE化合物KPT-185和KPT-276在体外诱导对非小细胞肺癌(NSCLC)的选择性抗癌细胞毒性在活的有机体内[22]。然而，机械的和在活的有机体内selinexor对非小细胞肺癌的作用尚不明确。在这里，我们提出了selinexor对非小细胞肺癌的作用，并证明XPO1是治疗这种恶性肿瘤的潜在靶点。

材料和方法

细胞培养和试剂

细胞株在含有10%热灭活胎牛血清(FBS, Gibco)、100单位/mL青霉素、100 μg/mL链霉素(Gibco)和1X谷氨酰胺(Gibco)的rmi -1640培养基中培养，置于37℃、5% CO的湿化培养箱中₂．NCI-H226、NCI-H520、NCI-H889、NCI-H1299、A549、NCI-H2122和NCI-H2030均来自ATCC (Manassas, VA)。Selinexor由Karyopharm Therapeutics, Inc. (Newton, MA)合成。

细胞效价96^®水单细胞增殖实验

在96孔平底培养板上，每孔100 μl的对数相培养细胞约10000个。将浓度不断上升的selinexor添加到井中，并在37°C、5% CO的湿化培养箱中培养₂72小时(一式三份)。每孔加入100µl MTT(3,4,5 -二甲基噻唑基)- 2,5 -二苯基溴化四唑5mg/mL, Promega)， 37℃孵育4h。每孔加入100µl/孔的增溶液，含DMSO和Sorenson缓冲液。在染料完全溶解后，在570nm酶联免疫吸附仪上读取平板。计算每组重复的平均光密度(OD)±SD。整个过程重复了三次。细胞生长抑制率按公式计算:%生长抑制率=(1-OD提取液处理)/OD阴性对照× 100[23]。

单独生存分析

NCI-H1299和A549细胞在12孔板中以5000细胞/孔的方式被镀(Cell Treat)。第二天用DMSO (Sigma)处理细胞，NCI-H1299用1µM selinexor, A549用5µM selinexor。分别于0、4、6、8天固定细胞，用龙胆紫(RICCA Chemical Company)染色，数码相机(Sony Cybershot)成像。然后细胞在10%醋酸(Fisher Scientific)中溶解，OD值在590 nm处测量。

流式细胞术

根据生产商的方案，使用BrdU Flow Kit (BD Pharmingen)进行细胞周期谱分析。简单地说，NCI-H1299、A549和NCI-H2030细胞被放置在6孔板中，第1天50万细胞/孔，第3天20万细胞/孔。用DMSO或1µM selinexor处理NCI-H1299, 5µM selinexor处理A549, 10µM和60µM selinexor处理NCI-H2030。采集前，NCI-H1299和A549细胞与10µM BrdU孵育2小时，NCI-H2030细胞与10µM BrdU孵育4小时。根据制造商的方案固定细胞并进行BrdU和7-AAD染色。然后在Dana Farber癌症研究所(Boston, MA)的BD LSRFortessa (BD Biosciences)上分析细胞，随后使用FCS Express 4软件(De Novo software)分析数据。

免疫印迹

将NCI-H1299和A549细胞在6孔板中以375,000个细胞/孔涂覆，并在通过胰蛋白酶化收集之前24和48小时用DMSO（0）或30,100,300,100,000或3000nM溶质物处理。从补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂（Roche）的皮尔斯撕裂缓冲液（Thermo Scientific）中的细胞中萃取蛋白质。通过皮尔斯BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Scientific）测定蛋白质量，并将样品归一化，使得每套道10μg总蛋白质的总蛋白质。通过在Novex Nupage 4-12％BIS-TRIS凝胶（寿命技术）上加载蛋白质并用Novex iBlot凝胶转移堆（Life Technologies）转移到硝酸纤维素。以下初级抗体用于免疫斑分析：PARP（细胞信号传导），β-肌动蛋白（SANTA CRUZ），Caspase 3（ABCAM），Caspase 8（Cell Signaling），Caspase 9（Cell Signaling），XPO-1（Santa Cruz），P53（Santa Cruz），P21（ABCAM），E2F4（SANTA CRUZ），FOXO3A（细胞信号传导），Survivin（ABCAM），NF-κB（细胞信号传导）和IκB（ABCAM）。用红外线连接物种特异性二抗检测蛋白质信号（Li-Cor Biosciences）。用奥德赛红外成像系统（Li-Cor Biosciences）检测Western污染图像。

免疫荧光

NCI-H1299和A549细胞放置在6孔板的37.5万个细胞/孔玻璃覆盖层(BioCoat, BD Biosciences)上，并生长过夜。用1µM selinexor处理细胞4小时检测p53和IκB, 24小时检测p21、E2F4和survivin。处理后，用1X PBS(磷酸盐缓冲盐水)冲洗盖玻片，然后在3%多聚甲醛缓冲液(3%多聚甲醛/2%蔗糖/1X PBS)或100%冰甲醇中固定15分钟，然后用1X PBS冲洗。用0.1% Triton X-100/1% BSA/1X PBS (PFA固定)或0.1% Tween 20/0.3 M甘氨酸/1% BSA/1X PBS(甲醇固定)渗透细胞至少30分钟。用1X PBS洗涤3次后，用1%BSA/1X PBS稀释后的相应抗体列表过夜染色。采用物种特异性Alexa Fluor 488二抗(Invitrogen)检测蛋白信号，DAPI染色(Invitrogen)检测DNA。尼康Eclipse Ti倒置荧光显微镜(尼康)和单色相机(ANDOR)观察蛋白质定位。

动物模型

SCID小鼠购自新加坡国家癌症研究所（Shin Leng博士）。所有动物实验均按照《动物福利指南》的指导方针并经IACUC批准进行。六十（60）只雌性CB-17 SCID小鼠（查尔斯河实验室菌株代码236），年龄5～6周。治疗前平均体重为16.3克。小鼠左侧皮下接种4×10德赢vwin首页网址⁷A549细胞。A549 (ATCC#CCL-185) NSCLC细胞取自ATCC。当肿瘤平均体积达到98.5 mm时开始治疗^3.(SD = 21.2毫米^3.).将小鼠分为六（6）组，每组十（10）只小鼠，每组的平均肿瘤体积在95至104 mm范围内^3.．小鼠分别以10或20 mg/kg剂量给药、护理标准药物/阳性对照药物(顺铂)或selinexor (KPT-330)。Vehicle和selinexor在周一、周三和周五的治疗计划开始于第1天，顺铂在第1天和第15天通过IP注射。每天记录动物的体重和状况，并在周一、周三和周五测量肿瘤。肿瘤体积数据的分析通过测量每个肿瘤的平均曲线下面积(Mean Area Under the curve, AUC)进行，并采用单因素方差分析进行组间比较。

免疫组织化学

来自异种移植研究的肿瘤被固定并被石蜡包埋。切片并常规免疫组化(IHC)。简单地说，通过二甲苯和醇系列脱芳烯烃，然后用3%的过氧化氢处理。使用细胞标记检测系统(Cell Marque)提取抗原。通过将载玻片装载到Biogenex I6000自动免疫染色器(Biogenex Laboratories)上，对每种适当的抗体进行检测。简单地说，这个程序包括20分钟的背景阻断剂，一次PBS冲洗，15分钟的Biogenex Avidin阻断剂，另一次PBS冲洗，接着15分钟的Biogenex生物素阻断剂，一次PBS冲洗，20分钟的Biogenex Power阻断剂，然后将玻片上的阻断剂吹干净。应用一抗，室温孵育1小时，PBS冲洗。然后使用细胞标记检测系统应用生物素化Link，孵育20分钟，然后用PBS冲洗。接下来贴上链霉亲和素标签，孵育20分钟，然后用PBS冲洗。最后，应用Cell Marque AEC染色剂孵育5分钟，然后用去离子水冲洗两次，用PBS冲洗一次。 Slides were transferred to tap water, counterstained in Hematoxylin for 10 dips, and then rinsed with tap water, followed by application of bluing reagent for 10 dips and rinsed with tap water. Cell Marque aqueous mounting media was added and slides were allowed to dry at room temperature overnight or for 20 minutes in an oven. Coverslips were mounted after a quick dip in xylene once dry. Antibodies used for detection of proteins by IHC were the following: Ki67 (Cell Marque), p53 (Santa Cruz), p21 (Cell Signaling), FOXO1 (Cell Signaling), survivin (Abcam), NF-κB (Santa Cruz), and IκB (Abcam).

NF -κB活动分析

NCI-H1299和A549细胞以200,000个细胞在12-孔平板/孔铺板并如上所述培养。将细胞用连续稀释的预处理（开始于30μM; 1：3稀释）selinexor 1小时，然后暴露于20纳克/ ml的TNFα（派普泰克公司制），用于在无血清培养基4小时。处理后，将细胞用PBS洗涤并用RIPA缓冲液裂解。NF-κB在细胞中的转录活性根据制造商的说明用化学发光转录因子测定试剂盒（Thermo Scientific）进行测定。简言之，将1.5毫克/毫升的RIPA裂解的全细胞提取物来自每个处理是在96孔板中与NF-κB结合的生物素化的孵育-共有序列。结合于共有序列的活性NF-κB转录因子与NF-κBp65的初级抗体一起温育，然后与次级HRP共轭的抗体。化学发光底物加入到孔中并使用光度计检测所得到的信号。的XLFit模型205来计算IC₅₀曲线。

结果

Selinexor抑制NSCLC细胞系的生长

在一期临床研究中，晚期实体肿瘤患者的剂量为3-85 mg/m²（2-50 mg），c_马克斯血清中selinexor的含量范围为30-1373 ng/mL[24]。为了检测selinexor是否在临床相关浓度下抑制肺癌细胞的生长，我们选择了7个NSCLC细胞系，评估它们的增殖能力和对死亡的敏感性。在改良的MTT细胞毒性试验中检测的7个细胞系中，5个是敏感的(NCI-H2122, NCI-H226, NCI-H520, NCI-H889, NCI-H1299;电子商务₅₀<400 nM)， 1有中等灵敏度(A549;电子商务₅₀400 ~ 1000 nM)， 1株耐药(NCI-H2030;电子商务₅₀此外，selinexor的敏感性与NSCLC的亚型以及p53或KRAS的突变状态无关。所有细胞的EGFR和AKT均为野生型(表1)。这些结果与其他NSCLC细胞的研究结果一致，这些细胞对selinexor的敏感性与常见的遗传异常[25]无关。

表1:XPO1抑制诱导非基因型NSCLC细胞系的细胞毒性

为了进一步研究selinexor对增殖和细胞活力的影响，一种敏感的NSCLC细胞系，p53缺失NCI-H1299 (EC₅₀p53野生型A549 (EC₅₀: 410-700 nM)，两者都携带KRAS突变，被选择用于后续分析。根据nci -海军医学肿瘤科，NCI-H1299的特征是形态上来源于淋巴结[26]的非小细胞肺癌上皮细胞，而A549是腺癌肺泡基底上皮细胞系[27]。

采用克隆生成实验[28]评价selinexor对肿瘤细胞生长的抑制作用。selinexor对非小细胞肺癌克隆和细胞生长的影响在8天的培养过程中进行了测试。完整的细胞生长抑制selinexor了敏感NCI-H1299和在中间敏感A549细胞株(图1)。治疗1µM NCI-H1299 selinexor(图1)和A549 5µM selinexor(图1 b) 8天导致完成增长抑制以及由视觉检查贴壁活细胞龙胆紫染色的光谱定量分析。相比之下,车辆控制治疗NCI-H1299 A549细胞正常生长,直到一天6时成为支流和开始减少由于过度拥挤和死亡(图1)。低浓度的selinexor还测试了两个细胞系在单独分析产生相似的结果(数据未显示)。

图1:Selinexor抑制非小细胞肺癌细胞系的细胞生长。
A) NCI-H1299和B) A549细胞以5000细胞/孔的比例被培养，用DMSO(对照)或1µM selinexor (NCI-H1299)和5µM selinexor (A549)处理。分别于0、4、6、8天用龙胆紫染色并成像。NCI-H1299和A549的对照细胞正常生长，直到第6天它们变得过剩。用10%乙酸溶解细胞并在590 nm处测量OD值，测定两种细胞类型的相对生长。颜色检测的缺失表明selinexor处理抑制NCI-H1299和A549细胞的生长。

selinexor的生长抑制可能通过多种机制实现。为了更好地理解这些机制，我们对载体和selinexor处理的NCI-H1299和A549细胞进行了细胞周期分析。这些分析,NCI-H1299 A549 1和5µM selinexor处理,分别为1和3天,并在那里进行评估,等待BrdU合并和DNA含量,流式细胞术(图2)。应用selinexor敏感p53零NCI-H1299细胞减少,但没有消除S期,诱导G1逮捕,并以时间依赖性的方式增加了子g1种群(图2A)。相比之下，用selinexor处理p53野生型A549细胞完全消除了S期，诱导了明显的G2和G1阻滞，并增加了亚G1(凋亡)细胞，尽管在selinexor处理的NCI-H1299细胞中观察到的程度不同(图2B)。亚g1细胞数量的增加与细胞死亡的增加相关，说明NCI-H1299细胞的死亡程度高于A549细胞。这些数据提高了p53参与A549细胞中观察到的显著G2阻滞的可能性。

图2:Selinexor诱导NSCLC细胞系生长阻滞和细胞死亡。A) NCI-H1299和B) A549细胞用对照(不含药物)或1µM selinexor (NCI-H1299)或5µM selinexor (A549)处理，并与BrdU孵育2小时，然后收集并固定在培养的第1天和第3天。固定细胞染色BrdU和7-AAD掺入，然后用流式细胞仪评估每个细胞类型的细胞周期曲线。

另外，对最具耐药性的NSCLC细胞系NCI-H2030（EC）进行流式细胞术检测₅₀10µM selinexor处理3天耐药NCI-H2030细胞株的细胞周期曲线分析显示，S期减少，G1期适度增加，无明显细胞死亡(补充图1A)。60µM selinexor治疗NCI-H2030细胞2天可以减少S期和G1期，增加G2期和细胞死亡(亚G1期)(补充图1B)。第3天，60µM selinexor致所有NCI-H2030细胞死亡(数据未显示)。这些结果表明，在耐药NCI-H2030细胞中，与敏感NCI-H1299和中敏感A549细胞中，高剂量selinexor以时间和剂量依赖的方式诱导细胞周期阻滞和细胞死亡。

Selinexor通过凋亡诱导细胞死亡

克隆形成分析和流式细胞术分析的结果表明，Selinfor诱导NSCLC细胞死亡。为了确定Selinfor是否诱导NSCLC细胞凋亡，通过Western blot分析凋亡标记物。NCI-H1299和A549细胞用0、30、100、300、1000或3000 nM Selinfor处理24或48小时（图3）.在NCI-H1299细胞中，用>300 nM的Selinfor处理24小时可导致全长caspase 3和PARP的减少以及其裂解产物的增加。在A549细胞中也可看到这种模式，但caspase 3和PARP裂解需要更高的Selinfor浓度，这与其他分析的结果一致然而，在内源性和外源性凋亡途径之间观察到差异，其中，A549细胞中的半胱氨酸蛋白酶8（外源性）的裂解产物比NCI-H1299细胞中的更为显著，并且使用Selinfor处理后，两种细胞类型中的全长半胱氨酸蛋白酶9（内源性）水平均降低（图3）这些结果表明，Selinfor在NSCLC细胞中诱导了外源性和内源性凋亡途径，最终导致细胞死亡。此外，Selinfor诱导的凋亡与p53无关，这与正弦化合物对实体瘤和淋巴瘤模型中凋亡的影响一致[29,30]。

图3:Selinexor通过凋亡诱导细胞死亡。用0、30、100、300、1000或3000 nMselinexor处理A549和NCI-H1299细胞的全细胞裂解液，24小时(PARP和相应的肌动蛋白)和48小时(caspases 3、8、9和肌动蛋白)。CL =裂开，FL =全长。

Selinexor诱导多个tsp的核定位

免疫荧光显微镜用于阐明Selinexor对关键TSP和细胞周期调节剂核积累的作用。相反，在用1μM硒基处理的NCI-H1299细胞中提高了载体处理细胞中的细胞质定位，IκB，E2F4和Survivin的核定位（图4A）。因为NCI-H1299是p53零细胞系（表1），不能用或没有塞里宁xor治疗检测P53和P21（在P53依赖性和依赖性转录控制中）。A549，P53野生型细胞系，在用1μM硒网治疗时，基本上增强了测试的TSPS-P53，P21，IκB，E2F4和存活素的核定位（图4B）。这些结果表明，无论p53状态和诱导细胞凋亡，通过阻塞细胞周期调节剂（如核心），均匀诱导凋亡的核定位。

图4:Selinfor在两种NSCLC细胞系（A）NCI-H1299和B）A549中诱导多个TSP和转录调节因子的核定位。在固定和随后的免疫荧光显微镜检查之前，NCI-H1299和A549用1µM Selinfor治疗4小时（p53和IĸB）或24小时（p21、E2F4和survivin）。

Western blot分析selinexor对tsp和其他细胞周期调节蛋白水平的影响。增加selinexor处理NCI-H1299和A549细胞24小时，分析tsp和其他转录调节因子的蛋白水平。虽然观察到的剂量依赖性降低XPO1 A549和NCI-H1299与selinexor预期和对治疗的反应符合先前发表的结果[22],FOXO3蛋白质的摄入量有关减少是意想不到的,而不是以前观察到在其他细胞系A549细胞中(图5)。p53、p21蛋白水平增加类似于图4的剂量依赖性的方式而不是蛋白质中检测出NCI-H1299细胞(图5)。E2F4 A549细胞中蛋白质含量没有影响selinexor NCI-H1299细胞治疗而略有降低,处理selinexor浓度高。在selinexor处理的两种细胞中，survivin蛋白水平均未发生改变(图5)。这些数据表明，selinexor可以调节蛋白定位和表达，以抑制细胞周期进展和诱导凋亡。

图5:Selinexor诱导两种NSCLC细胞系中几种TSP和转录调控因子的蛋白表达变化。用0、30、100、300、1000或3000 nMselinexor处理A549和NCI-H1299细胞的全细胞裂解液24小时的免疫印迹。

Selinfor与NF-κB通路

NF-κB/IκB通路因其在肿瘤表现和进展中的作用而被广泛研究。结果表明，selinexor处理诱导了核内IκB的积累体外（图4）评估了Selinfor对体外NSCLC细胞NF-κB活性和蛋白表达水平的影响（图6）。NCI-H1299和A549细胞用连续稀释的Selinfor预处理1小时，然后用TNFα刺激4小时，然后在NF-κB活性测定中评估NF-κB p65亚单位结合一致结合序列的能力。在本试验中，确定Selinfor具有NF-κB IC₅₀在NCI-H1299细胞中有0.78µM, IC稍高₅₀在较不敏感的A549细胞中为1.19µM(图6A)。在随后的western blot分析中，0、30、100、300、1000或3000 nM selinexor处理24小时后，A549和NCI-H1299细胞中NF-κB p65和IκB蛋白水平均呈剂量依赖性降低(图6B)。因此，Selinexor可能通过在细胞核中保留IκB来抑制NF- κB通路的激活，从而中和NF- κB的转录活性，从而阻止NSCLC细胞中下游的促生存事件。

图6:在A549和NCI-H1299细胞系中，无论p53状态如何，Selinexor调节NF-ĸB活性，并降低NF-ĸB和IĸB的蛋白表达。A)用0.12,0.37,1.1,3.3,10和30µM selinexor处理NCI-H1299和A549细胞1小时，然后加入20 ng/ml TNFα 4小时，检测NF-ĸBIC50。NF-ĸB的IC50值由在NF-ĸB结合试验中评估NF-ĸB活性的总细胞裂解液计算得出。B)用0、30、100、300、1000或3000 nM selinexor处理A549和NCI-H1299细胞48小时的全细胞裂解液的免疫印迹。

selinexor对NSCLC细胞的影响在活的有机体内

接下来评估selinexor的效果在活的有机体内在小鼠异种移植模型中中敏感NSCLC细胞系A549的生长。小鼠皮下接种A549细胞，一旦肿瘤达到平均体积~100 mm^3.，按表2所示处理。与顺铂相比，Selinexor 20 mg/kg组的最大平均抑制率为81%(图7A)，而顺铂的最大抑制率为13%。测量并报告了肿瘤体积的平均变化，见图7B。该分析表明，对照剂组与服用10 mg/kg (p=0.001)和20 mg/kg (p<0.0001)的selinexor组之间有统计学显著差异。

图7:在A549异种移植模型中，selinexor治疗降低了平均肿瘤体积。A.根据长度和宽度测量计算平均肿瘤体积。计算组均值，并用误差棒表示每组的SEM。B.曲线下面积(Area Under The Curve, AUC)采用本研究中每个动物测量的肿瘤体积进行梯形规则变换计算。计算组均值，并用误差棒表示每组的SEM。采用单因素方差分析对各组进行比较，车辆控制组与服用10 mg/kg (p=0.001)和20 mg/kg (p<0.0001)的selinexor组之间的差异具有统计学意义。

表2:A549异种移植研究组

为了更好地了解selinexor在小鼠异种移植模型中如何抑制肿瘤生长，在第31天采集肿瘤并进行免疫组化(IHC)。图8显示了每个对照和selinexor治疗的肿瘤的代表性图像。苏木精和伊红(H&E)染色显示了有和没有selinexor治疗的肿瘤的总体结构(图8A)。与载体治疗的肿瘤相比，Selinexor治疗的肿瘤表现出更多的间质(纤维化)和更少的肿瘤细胞。通过减少Ki67染色可见，与载体治疗的肿瘤相比，selinexor治疗降低了细胞增殖(图8A)。虽然与对照剂治疗的肿瘤相比，selinexor治疗的肿瘤中p53和p21的染色没有什么不同，但与对照剂治疗的肿瘤相比，selinexor治疗的肿瘤显示FOXO1和survivin的核聚集增加(图8B)。由于在体外NSCLC中selinexor处理诱导了IκB的核定位，调节了NF-κB活性，并降低了NF-κB和IκB的表达(图4和6)，因此我们也在体内评估了selinexor处理对这一通路的影响。在selinexor治疗的肿瘤中，与对照治疗的肿瘤相比，NF-κB和IκB的核定位都增加了(图8C)。NF-κB和IκB的核共同定位与NF-κB活性的抑制有关[7,8]，这与selinexor对体外NF-κB的影响一致(见上文)。综上所述，这些发现表明selinexor在体外和体外诱导了蛋白质的核积累在活的有机体内并调节导致非小细胞肺癌细胞周期阻滞和死亡的多条通路。

图8:A549异种移植组织学。B) FOXO1和survivin的核聚集;C) NF-ĸBand IĸB的核聚集(40x)。
补充图1:nci - h2030细胞在A) 10µM处对selinexor有抗性，而在B) 60µM处无抗性。图2描述了流式细胞术对细胞周期的分析。EC50浓度selinexor(10µM)处理的耐药NCI-H2030细胞S期减少，G1期适度增加，无明显细胞死亡。第3天，60µM selinexor致所有NCI-H2030细胞死亡。

讨论

XPO1，核输出蛋白和karyopherin-β家族的成员，已被证明在各种不同类型的癌症中过表达。许多研究报道，XPO1核出口通过SINE的抑制化合物中的TSP的核积累，细胞生长的抑制和细胞凋亡[10]的诱导的结果。临床SINE化合物，selinexor，目前正在治疗晚期实体瘤，包括肺癌（NCT02351505）评估，并且迄今已证明可接受的安全性和临床受益[24]。这里介绍的临床前数据支持的抗肿瘤活性和selinexor的非小细胞肺癌的潜在治疗效果。在体外，selinexor诱导的细胞周期停滞和细胞凋亡以剂量和时间依赖的方式诱导细胞质到的TSP的核定位和细胞周期调节，也不管组织学分型和突变型材调制的NF-κB途径。在活的有机体内在小鼠异种移植模型中，selinexor是一种比顺铂更有效的治疗方法，其组织学特征与体外数据一致。这些结果表明selinexor是一种有效的非小细胞肺癌抑制剂。

这项研究直接询问了在非小细胞肺癌中，selinexor的抗癌活性是否需要TSP p53。与在其他癌症类型中报道的SINE化合物的观察结果一致[22,30,32]，selinexor在非小细胞肺癌中发挥抗癌作用，无论p53状态如何，在p53缺失的NCI-H1299和p53野生型A549细胞株中也看到了类似的结果。这表明，尽管p53已被证明在细胞周期调控和诱导凋亡中发挥重要作用[33,34]，但这些事件并不是由selinexor介导的

虽然selinexor治疗NCI-H1299和A549的结果相似，但更仔细的检查显示，随着时间的推移，他们对化合物的反应有明显的差异，这可能反映在他们对药物的不同敏感性上。通过比较不同类型细胞在使用selinexor处理后的细胞周期曲线，可以发现细胞周期不同阶段的积累差异。与A549细胞相比，NCI-H1299细胞出现更大的亚g1凋亡比例，这反映了NCI-H1299细胞对selinexor更敏感。随着时间的推移，selinexor处理的A549细胞的亚g1细胞数量预计会增加。然而，在A549细胞中G2阻滞增加，而在NCI-H1299细胞中没有观察到，这表明每个细胞系对selinexor的反应不同。尽管如此，当使用selinexor处理时，两种细胞类型最终都实现了细胞死亡，这在克隆原性分析和PARP切割和caspase活性的western blot分析中得到了证明。

大多数tsp的主要细胞周期检查点功能需要核定位。肿瘤细胞过表达XPO1和其他辅助因子，导致关键的tsp，包括p53、FOXO蛋白、p27和其他导致tsp功能失活，并有助于肿瘤细胞对凋亡的抵抗。此前已有研究表明，抑制XPO1会导致多种不同的tsp在细胞核中积累;出口被阻止，但从细胞质进口不受影响[12-15]。sin化合物治疗癌细胞作用的一个显著特征是参与癌症进展的许多蛋白质的核积累[29,32,35-38]。Survivin是凋亡抑制家族(IAP)的成员之一，在多种癌症[39]中高表达。Survivin在细胞质[40]中具有增殖活性，其强制核保留可能导致其泛素化和蛋白酶体降解[41]。有趣的是，据报道，当观察到survivin核定位时，骨肉瘤、膀胱癌、乳腺癌和肺癌患者的预后良好[42,43]。本研究结果表明，selinexor介导的survivin核包埋在体外在活的有机体内与癌细胞死亡有关

除了survivin外，selinexor处理还诱导转录因子E2F4的核积累。E2F4是一种细胞周期调节器，通过XPO1输出到细胞质，使细胞进入细胞周期[44]。当E2F4局限于细胞核时，它与三种TSP结合：p107、p130和pRb，其结合对激活它们的肿瘤抑制活性至关重要。Selinfor还通过减少磷酸化pRB的核检测（未显示）诱导pRB活性，并且仍需确定p107和p130是否也被激活。与survivin和E2F4类似，selinexor诱导p53及其下游靶点p21的核积聚。p21结合并抑制cyclinCDK2和cyclin-CDK4复合物，因此将细胞阻滞在细胞周期的G1期[45]，如FACS分析所示（图2）。

尽管其机制尚不完全清楚，但已有报道称，在许多不同类型的癌症中，SINE化合物可增加NF-κB和IκB的核定位，并抑制NF-κB活性[32,35,38]。在细胞质[5]中，转录因子NF-κB通常与其抑制因子IκB结合。激活后，NF-κB从IκB中释放并降解，NF-κB进入细胞核，上调细胞周期进展及炎症[46]相关基因表达。在负反馈循环机制中，IκB(本身是NF-κB调控基因)进入细胞核，阻止NF-κB介导的基因进一步激活[47]。虽然NF-κB和/或IκB尚未被确定为XPO1 cargos，但之前的体外研究表明，LMB处理可诱导NF-κB/IκB复合物的核保留，并抑制NF-κB活性，这归因于IκBα的n端识别的核输出信号[7,8]。在我们的研究中，selinexor通过诱导IκB的核积累来抑制NF-κB通路在活的有机体内，以及NF-κB和IκB蛋白水平的下降，可能是由于其自身转录的负反馈环路。与A549细胞相比，在更敏感的NCI-H1299细胞中，较低浓度的selinexor可抑制NF-κB活性，这与A549细胞中IκB基线表达/定位增加一致。selinexor如何破坏NF-κB通路的潜在机制目前正在研究中。

在NSCLC细胞系中具有正弦化合物的先前临床前研究结果与本研究中的研究结果一致。临床候选硒络合物的早期类似物的正弦化合物KPT-185和KPT-276的评价，显示出NSCLC细胞系和小鼠异种移植物中的抗癌活性[22]。然而，与在此报告的结果不同，前一项研究报告对NF-κB或IκB表达没有影响。虽然它导致肿瘤生长降低，但用临床无关剂量的正弦复合KPT-276处理小鼠。与Sun等人在NSCLC中的KPT-330（Selinexor）的临床前工作。[25]没有检查NF-κB途径，也没有调查效果在活的有机体内KPT-330的组织学分析。在本研究中，与以前的研究相比，对临床相关的XPO1抑制剂selinexor的细胞周期曲线进行了更广泛的评估(3天vs 24小时)，对NF-κB通路进行了研究，在小鼠模型中测试了临床相关药物剂量，并对selinexor治疗的肿瘤进行了全面的组织学分析。无论测试的SINE化合物或评估的NSCLC细胞系，数据都一致支持SINE化合物具有有效的抗癌活性。

非小细胞肺癌是肺癌的主要形式，其特点是预后差和治疗选择非常有限。尽管目前的靶向治疗NSCLC[4]的生存率仍然很低。selinexor对XPO1的抑制作用在活的有机体内这导致了本研究最令人兴奋的方面，即在A549小鼠异种移植模型中，平均肿瘤体积的巨大减少。与顺铂阳性对照相比，治疗耐受性良好，平均肿瘤体积显著减少。Selinexor目前正在进行I期和II/IIb临床试验，作为单一药物或与其他疗法联合治疗各种实体和血液恶性肿瘤(Clinicaltrials.govNCT01607892和NCT01607905)。I期临床研究的结果以及在活的有机体内本文提供的数据表明，XPO1抑制剂selinexor是一种有前途的治疗非小细胞肺癌的新药物。

补充图

补充图1:NCI-H2030细胞在A) 10µM处对selinexor有抗性，而在B) 60µM处无抗性。流式细胞术对细胞周期分析的描述见图2。EC处理的耐药NCI-H2030细胞₅₀selinexor(10µM)浓度降低S期，G1期适度增加，细胞无明显死亡。第3天，60µM selinexor致所有NCI-H2030细胞死亡。

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