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Aritcle类型:研究文章

引用:Dasari SR，Velma V，yedjou CG，Tchounwou PB（2015）急性暴露细胞白血病管理低剂量顺铂的临床前评估。INT J CANDER REM MOL MECH 1（3）：DOI http：// dx.doi.org/10.16966/2381-3318.113

版权:©Dasari SR. et al。这是一篇开放存取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

收到日期:2015年9月7日

接受日期:2015年10月13日

发表日期:2015年10月15日

摘要

顺铂(cis - diamminedchloroplatinum, II)(顺铂)是目前应用最广泛的各种癌症化疗药物，但其疗效受肿瘤细胞耐药及严重副作用的限制。由于高水平的顺铂对癌细胞和正常细胞都有细胞毒性，本研究的目的是探索长期低剂量的顺铂治疗白血病的有效性。为了达到我们的目标，我们用不同剂量(1、2或3 μ M)的顺铂处理人白血病(HL-60)细胞24、48、72和96小时。MTS法检测细胞活力。氧化应激损伤和遗传毒性分别通过抗氧化剂、脂质过氧化和彗星试验进行评估。MTS试验获得的数据表明，顺铂治疗通过直接杀伤细胞或通过剂量和时间依赖的方式简单地降低细胞增殖率来减少存活的肿瘤细胞数量。脂质过氧化结果显示，丙二醛水平随顺铂剂量的增加而显著升高(p<0.05)。超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的检测结果显示，与对照细胞相比，顺铂处理的细胞抗氧化酶活性逐渐增加。Comet试验产生的数据显示，顺铂治疗导致的DNA损伤的基因毒性显著增加，呈剂量依赖关系。综上所述，我们的研究表明，顺铂诱导HL-60细胞的细胞毒性至少部分是通过诱导氧化应激和氧化损伤介导的。

关键字

顺铂;HL-60细胞;细胞生存能力;氧化应激;氧化损伤

介绍

顺铂，即顺二胺二氯铂(II)，是一种著名的化疗药物，是治疗各种癌症最广泛使用的药物之一[1,2]。临床证明顺铂可以对抗不同类型的癌症，包括肉瘤、软组织、骨骼、肌肉和血管的癌症。近年来，此类癌症的化疗治疗取得了较好的预后，从而降低了这些疾病对生命的威胁。从分子角度来看，顺铂代表了一个完美的例子，即化学结构的微小改变可以显著影响靶细胞的生物活性。目前世界上有9种铂类似物正在进行临床试验[4,5]。

已知顺铂能结合DNA和蛋白质等细胞成分，并与DNA和蛋白质分子交联形成DNA和蛋白质加合物，阻碍转录和翻译机制[6,7]。这些DNA加合物影响细胞周期进程检查点，并在修复机制[8]的帮助下决定细胞是否必须死亡或存活。除了形成DNA加合物外，顺铂还能诱导氧化应激，调节钙信号传导和细胞凋亡[9,10]。它还调节许多在细胞周期调控和信号转导中起主要作用的蛋白质的表达[8,11,12]。顺铂还介导丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和jun氨基末端激酶(JNK)通路，协调各种细胞外信号，调节细胞生长、生存和凋亡[13,14]。

此外，顺铂诱导的氧化应激除了引起DNA损伤外，还可能引起细胞死亡。氧化应激是通过靶向线粒体膜电位诱导毒性的重要过程之一，最终由于线粒体蛋白巯基的缺失导致钙摄取受到抑制。氧化应激诱导程度与暴露时间和药物剂量[15]有关。巯基(- SH)分子在维持细胞内氧化还原稳态方面发挥着重要作用。在诱导条件下，硫醇自由基与分子氧相互作用，产生活性氧簇。如果细胞不能控制活性氧的生成，它们最终可能会破坏细胞膜并触发细胞凋亡的内在和/或外在途径。然而，部分患者的细胞并非进入凋亡通路，而是由于药物摄入减少或药物被动扩散而对顺铂产生耐药性[17,18]。

虽然顺铂的一些生化效应已经得到了很好的研究，但其在低剂量下潜在治疗作用的详细模式尚未阐明。目前研究的目的是评估顺铂对HL-60细胞的低剂量效应并阐明其细胞毒性机制。我们的研究结果为确定对减少癌细胞增殖有最大影响的顺铂最低剂量提供了科学依据，从而最大限度地减少其对正常/非癌细胞的副作用。因此，在本研究中，我们研究了低水平暴露于HL-60细胞时顺铂的细胞毒性、氧化应激、脂质过氧化和遗传毒性潜能。

方法和材料

细胞培养，化学试剂

顺铂取自密西西比大学医学中心(Jackson, MS)。Iscove的改良Dulbecco培养基(IMDM)和HL-60细胞购自美国型培养收集(ATCC) (Manassas, VA, USA)。胎牛血清(FBS)和青霉素-链霉素购自Sigma (St. Louis, MO, USA)。IMDM含有4mm L-谷氨酰胺、4500mg /L葡萄糖、1500mg /L碳酸氢钠，并添加10% (v/v)胎牛血清和1% (W/ v)抗生素。活细胞在37℃5% CO中培养₂培养箱(Thermoscientific, Waltham, MA, USA)。

细胞治疗

对照组和处理组各设3个重复。细胞密度均匀为1 × 10_6.细胞/mL维持在所有处理和对照组。细胞用顺铂1、2或3 μ M处理或不处理，并在37℃5%湿润CO中培养不同时间(24、48、72或96小时)₂培养箱(Thermoscientific, Waltham, MA, USA)。

细胞增殖实验

细胞活力评估如前所述[19]与CellTiter 96^®Promega (Madison, WI, USA)的单水溶液细胞增殖检测试剂盒。简单地说，将100µL处理或未处理的细胞悬液接种到96孔聚苯乙烯组织培养板中，每孔添加20µL的检测试剂。37℃孵育60分钟后，用BMG LABTECH GmbH (Ortenberg，德国)的96孔板阅读器在490 nm处读取吸光度。

脂质过氧化作用分析

使用脂质过氧化测定试剂盒（Abcam，Cambridge，Ma，USA），丙二醛（MDA）浓度被定量如前所述[20]。在每种处理后，收集细胞悬浮液，以1,230rpm离心5分钟以使细胞沉淀物，将电池沉淀悬浮在细胞裂解缓冲液中。在13,000g离心10分钟后，根据脂质过氧化测定试剂盒方案测定200μL等分试样的MDA水平。用来自BMG Labtech GmbH（Ortenberg，Germany）的96孔板读卡器，在532nm中读取样品的吸光度。从标准曲线确定MDA的浓度。

超氧化物歧化酶(sod)和过氧化氢酶测定

如前所述[21,22]进行了SOD和过氧化氢酶测定，并分别使用了市售的SOD测定试剂盒和过氧化氢酶测定试剂盒(Abcam, Cambridge, MA, USA)。每次处理后，收集对照和处理后的HL-60细胞。根据制造商的方案，对细胞裂解液中SOD和过氧化氢酶的活性进行定量。使用BMG Labtech GmbH (Ortenberg，德国)的96孔板阅读器在450nm处测定SOD和570 nm处测定过氧化氢酶的最终吸光度。

单细胞凝胶电泳

使用Trevigen (Gaithersburg, MD, USA)提供的用于单细胞凝胶电泳的Comet试剂盒，通过碱性单细胞凝胶电泳(Comet)分析处理和未处理HL-60细胞的顺铂遗传毒性。所有的预防措施都是为了避免紫外线对DNA的影响。低熔点琼脂糖在沸水中熔化，冷却至37°C。每次处理取75 μL琼脂糖与细胞混合物(比例为1:10)置于彗星玻片上，4℃固化。裂解液4°C裂解细胞30分钟，37°C碱液变性DNA 40分钟。将制备的载玻片在TBE(三硼酸EDTA)缓冲液中进行电泳(1伏/厘米)10分钟。电泳后用70%乙醇固定细胞，SYBR绿色染色。采用Epifluorescent显微镜(Olympus BX51 TRF, USA)观察彗星载玻片。使用DNA损伤分析软件(Loats Associates Inc.， USA)对数据进行评估。

统计分析

实验共进行3个重复，数据以平均值±SDs表示。为了检验实验组之间和实验组之间的差异，使用杰克逊州立大学RCMI环境健康中心生物统计学核心实验室提供的SAS软件分别进行了单因素方差分析(ANOVA)和学生t检验。p值小于0.05的数据被认为具有统计学意义。

结果

顺铂抑制HL60细胞增殖

与相应的对照组相比，用1、2或3 μ M顺铂处理的HL60细胞在24、48、72和96 h的孵育期中测量了细胞存活率(图1)。结果表明，随着顺铂剂量和孵育期的增加，细胞存活率降低。1 μ M顺铂处理24、48、72和96 h细胞存活率分别为92.0±1.7%、81.0±3.8%、59.0±2.2%和38.0±1.9%。2 μ M顺铂治疗24、48、72和96 h的记录数据分别为89.0±2.2%、74.0±4.0%、52.0±3.9%和41.0±2.8%。3 μ M顺铂处理24、48、72、96h细胞存活率分别为84.0±3.1%、66.0±1.8%、48.0±3.3%和34.0±3.6%。与1 μ M处理相比;3 μ M顺铂处理24、48、72和96h后，细胞存活率分别下降8%、15%、11%和4%。总的来说，与对照细胞相比，顺铂治疗细胞显著的剂量和时间依赖性降低(p<0.05)。

顺铂可提高HL60细胞的SOD和过氧化氢酶活性

用1、2、3 μ M顺铂处理或未处理的HL60细胞24、48、72和96 h，测定SOD和过氧化氢酶活性。SOD和过氧化氢酶的结果分别如图2和图3所示。SOD和过氧化氢酶活性随顺铂剂量或时间的增加而增加。最低浓度1 μ M顺铂处理24、48、72和96 h时，与对照相比，SOD活性分别提高23%、30%、62%和82%，过氧化氢酶活性分别提高29%、33%、41%和58%。在顺铂处理的2 μ M细胞中，24、48、72和96 h，与对照相比，SOD活性分别提高41%、47%、67%和86%，过氧化氢酶活性分别提高37%、39%、40%和57%。与对照相比，3 μ M顺铂最高浓度处理24、48、72和96h时，SOD活性分别提高61%、68%、73%和110%，过氧化氢酶活性分别提高41%、45%、49%和75%。顺铂处理的细胞中SOD和过氧化氢酶活性的升高均显著高于对照(p<0.05)。

图1：顺铂对HL-60细胞的细胞毒性作用。将细胞用1,2和3μm的顺铂处理24小时，48h，72h和96h。通过在490nm处的分光光度计通过细胞增殖测定测试细胞活力。数据与控制有一个。结果表示为三个独立实验的手段±标准偏差。小于0.05的p值被认为是统计学意义。

图2：顺铂对HL-60细胞SOD活性的影响。用顺铂1、2、3 μ M刺激HL-60细胞24h、48h、72h、96h，检测细胞SOD活性。处理后，细胞裂解并测定SOD活性。在450nm处测量每个样品的吸光度，结果如图所示。数据归一化，对照为1，表示为三个独立实验的平均值±标准差。小于0.05的p值被认为是统计学意义。

图3:顺铂对HL-60细胞过氧化氢酶活性的影响。将HL-60细胞与1,2和3μm的顺铂一起温育24小时，48h，72h和96h。在每次处理之后，使用570nm的分光光度计估计过氧化氢酶活性。结果以Nmol / min / ml表示。数据与控制归一化为1.数据表示为三个独立实验±标准偏差的平均值。小于0.05的p值被认为是统计学意义。

顺铂诱导HL60细胞脂质过氧化

评估氧化应激的最佳方法之一是估测脂质过氧化的副产物丙二醛。测定顺铂处理HL-60细胞的MDA浓度。数据显示在图4中。如图所示，估计的MDA水平以剂量和时间响应的方式逐渐增加。1、2和3 μ M顺铂处理HL-60细胞96 h后，与相应的对照相比，诱导MDA增加39、48和64%。在其他时间段里也发现了类似的趋势。因此，所有检测浓度和时间段的MDA水平均显著高于各自的对照组(p<0.05)。

图4:顺铂对HL-60细胞脂质过氧化的影响。用不同剂量的顺铂处理HL-60细胞或不处理24h、48h、72h和96h。在处理和未处理的细胞中测定MDA水平。在532 nm处测定MDA含量(nmol/ml)。数据归一化，对照组为1。结果以三次独立实验的平均值±标准差表示。小于0.05的p值被认为是统计学意义。

顺铂诱导HL60细胞DNA损伤

顺铂以1、2或3 μ M剂量处理HL60细胞，持续24、48、72和96小时，显示出与DNA损伤的剂量和时间响应关系。图5展示了HL-60细胞的代表性Comet检测图像，显示在较高水平的顺铂暴露下，DNA损伤显著增加。使用DNA损伤分析软件(Loats Associates Inc.， USA)对这些定性数据进行了三次重复的定量分析。而1 μ M顺铂处理24 h DNA损伤水平最低。1µM暴露24、48、72和96 h DNA损伤百分率分别为1.6±0.12%、2.8±0.51%、3.6±0.47%和5.7±0.23%。2 μ M暴露24、48、72和96 h，分别为3.4±0.19%、3.60±0.38%、6.1±0.46%和7.1±0.28%。在顺铂3 μ M最大剂量下，24、48、72和96 h DNA损伤率分别为5.9±0.09%、6.5±0.12%、6.7±0.39%和10.5±0.16%。所有检测浓度的DNA损伤均显著高于各对照(p<0.05)。

讨论

本研究旨在研究顺铂对HL60细胞的细胞毒性、氧化应激和遗传毒性。本研究的主要目的是研究低剂量顺铂的抗癌潜力，以尽量减少对非肿瘤细胞的影响。我们评估了细胞毒性的细胞活力，抗氧化水平和氧化应激的脂质过氧化，以及基因毒性的彗星试验。

顺铂是一种中性无机化合物，通过抑制DNA加合物的形成和随后诱导细胞凋亡而诱导细胞毒性。顺铂要表现出毒性，必须与水分子水解，成为活性分子，并与细胞内各种大分子相互作用[17,24]。顺铂活性依赖于内源性亲核试剂，包括谷胱甘肽、蛋氨酸、金属硫蛋白和其他细胞成分[2,25]。内源性亲核试剂作为一种防御机制，在较低水平暴露时对抗顺铂诱导的毒性。

图5:代表彗星试验图像HL-60细胞暴露于顺铂0,1,2,或者3µM 24, 48岁,72年,和96 h。处理和未经处理的细胞进行单细胞凝胶电泳,用SBGR染色,分析在材料和方法部分描述。

在本研究中，用1、2或3 μ M顺铂处理HL60细胞不同时间。研究结果显示，在所有试验剂量中均有显著的细胞毒性效应(图1)。与对照组相比，最低剂量1 μ M顺铂抑制了近60%的细胞增殖。顺铂的抗增殖或抗癌特性与之前报道的顺铂在各种癌症中抑制细胞增殖的研究结果一致[26-28]。

细胞增殖或细胞毒性的最终抑制可能是顺铂诱导的氧化应激、遗传毒性和其他细胞反应的集体机制的结果。因此，我们确定了氧化应激是否在顺铂诱导的HL60细胞毒性中起关键作用。我们发现，顺铂处理的细胞中SOD和过氧化氢酶等抗氧化酶活性明显高于对照细胞。酶活性的增加是剂量和时间依赖性的(图2和3)。

超氧化物歧化酶催化超氧阴离子分解为过氧化氢(H₂O₂）和h₂O₂成为过氧化氢酶的底物。在本研究中，这两种酶的诱导可以被认为是对抗顺铂暴露引起的活性氧的一种适应性机制。本研究中抗氧化水平的剂量和时间依赖性增加与之前关于顺铂诱导活性氧形成的浓度和时间依赖性[15]的报道一致。由于抗氧化剂在氧化应激反应中升高，我们观察到顺铂处理的HL60细胞显著诱导脂质过氧化副产物丙二醛(MDA)(图4)。此前已有报道称，脂质过氧化产物的释放增加了蛋白质的羰基化，诱导细胞膜的氧化损伤，这些事件可能导致细胞死亡的开始[29-33]。

除氧化应激外，顺铂还可诱导基因毒性，这可能是抑制细胞增殖或细胞周期进展最有效的方法。有报道称，活性顺铂可与蛋白质和DNA中的巯基等功能残基发生反应，特别是与DNA中嘌呤的亲核位点发生反应，形成DNA蛋白和DNA-DNA链间或链内交联[34-37]。在本研究中，报道的DNA损伤是剂量和时间依赖性的(图5和6)。1µM的DNA损伤几乎是5%，而3µM的DNA损伤几乎比各自的对照高10%(图6)。这些发现与顺铂诱导的氧化应激(图2和3)和脂质过氧化(图4)在剂量和时间依赖的方式一致。诱导的DNA损伤可能是链间和链内交联的结果，或氧化应激和DNA交联的顶峰。目前的发现与以往的报道一致，顺铂与DNA嘌呤碱基相互作用，形成DNA加合物诱导毒性[8,38]。

也有报道称顺铂可诱导p53野生型和p53缺失型肝癌细胞株[39]的凋亡和细胞周期进程的改变。HL60细胞缺乏p53蛋白，而野生型p53细胞与p53缺陷细胞[40]相比，对顺铂更敏感。这些研究表明p53活化可使细胞对顺铂毒性敏感。有报道称，顺铂通过p53依赖和独立途径诱导细胞凋亡[39,41,42]。与我们的研究结果一致，有人指出顺铂通过阻滞细胞周期G1期[43]不可逆地抑制细胞增殖。然而，还需要更多的研究来阐明顺铂诱导癌细胞生长抑制、氧化应激、细胞周期调节和遗传毒性的分子机制。

结论

在本研究中，我们在低水平的暴露（1,2和3μm）和各个时间段（24,48,72和96h）下调查了顺铂诱导的细胞毒性，氧化应激和遗传毒性。顺铂显着抑制细胞增殖，也显着诱导抗氧化剂水平和脂质过氧化，即使在1μm的最低剂量下也是如此。此外，顺铂在所有治疗剂量上显着诱导HL60细胞中的DNA损伤。一起服用，低剂量的顺铂对HL-60细胞显示出显着的活性，因此，可以与三氧化砷（ATO）组合使用以改善治疗，减少急性早幼粒细胞白血病患者的潜在副作用。然而，需要额外的研究来研究顺铂和ATO的综合作用，以确定其在APL化疗中使用的潜力。

图6:用0、1、2或3 μ M顺铂处理HL-60细胞24、48、72和96小时的DNA损伤。数据代表三次独立实验中DNA损伤的百分比±标准差。小于0.05的p值被认为是统计学意义。

确认

本出版物中描述的这项研究之所以成为可能，部分原因是美国国立卫生研究院(NIMHD-G12MD007581)通过杰克逊州立大学的rcmi环境健康中心提供的拨款，部分原因是密西西比州INBRE提供的拨款(NIGMSP20GM103476)。

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