摘要

作品简介:在O型血受试者的恶性细胞中有不相容A抗原表达的报道。虽然在10-20%的O型血患者中观察到这种现象，但A抗原表达不相容的遗传机制仍不清楚。

材料和方法:从7例已在肿瘤中表达不相容A的患者对应的22个乳腺蜡块中提取基因组DNA作为模板土著居民的采用荧光、双链SSP-PCR进行基因分型。下一代测序(NGS)也对ABO血型基因的第6、7外显子进行了测序。

结果:4/7例患者正常DNA和肿瘤DNA O/O分型，3/7例患者正常DNA O/O分型和肿瘤DNA A/O分型。新移码突变320菲律宾人质被发现创建终止密码子的等位基因外显子6 o .在3/7例肿瘤组织表达抗原的不相容,删除320删除,终止密码子结果不再存在,阅读框没有改变,因此糖基转移酶是合成。

结论:在O型患者中表达的不相容抗原来自于320位O等位基因缺失，该等位基因由一种与外显子6和7中的A转移酶类似的功能免疫反应蛋白产生。尽管A抗原在肿瘤生物发生中的生物学功能尚不清楚，但在肿瘤细胞表面表达A抗原可使其在临床上作为肿瘤预后的生物标志物。

关键字

ABH抗原;乳腺癌;不兼容的抗原;非deletional O;320年菲律宾人质

介绍

ABH抗原的合成需要转移酶的表达土著居民的基因[1,2]。这个基因位于人类第9号染色体的远端长臂上。它由7个外显子组成，编码一个354氨基酸糖基转移酶。A、B、O型和亚型是基因内遗传变异的结果，这些变异影响酶的表达或活性，导致在红细胞(rbc)表面检测到的血型抗原的质量和/或数量的变化[3-6]。

据报道，基因修饰在几种源自上皮细胞的癌症中很常见[7,8]。乳腺癌经常引发发生在膜糖缀合物中的糖基化状态的变化，如BRCA1、BRCA2和Thomsen-Friedenreich唾液酸刘易斯抗原，这些都与癌症的发展有关。在糖缀合物中，组织血型ABH抗原也被认为与各种癌症有关[9-12]。

一些研究表明，当恶性过程发生时，正常表达ABH抗原的细胞可能会部分失去ABH表达。A和B抗原的表达已被确定为一个良好的预后因素，因为它们的减少或完全缺失与预后不良的[13]相关。新创在包括结直肠癌在内的一些实体肿瘤中也观察到与胚胎生命相同的ABH抗原表达[6,14-16]。一些红细胞血型O表型的受试者可能在其恶性细胞[17]中表达不相容的A抗原。

目前很少有研究探讨不相容A抗原的合成机制。Clausen和他的同事认为点突变可能发生在O等位基因，恢复阅读框，导致a样转移酶的产生[18,19]。

然而，问题出现了，一个特定的突变如何可能是不同个体的不同类型癌症的共同特征。还提出了其他假说，如在染色体中使用第二个起始密码子On -截短的部分酶活性蛋白的产生或伪基因的激活。此外，还会发生选择性剪接，删除携带c.261G缺失的外显子6，生成缺失135个碱基对的转录本和缺失33个氨基酸[20]的蛋白。

随着发现O缺乏常见缺失的等位基因(O03)，频率为7.3 - 8%，推测该等位基因参与了不相容a抗原的表达。

我们筛选了7例红细胞表型为O的乳腺癌患者，通过免疫组化检测发现肿瘤中有A血型抗原的表达，以探讨A不相容表达的机制。

材料和方法

道德的声明

这项研究是根据《赫尔辛基宣言》进行的，由拉巴特大学医学院的拉巴特生物医学研究伦理委员会(CERBR)评估和批准。

组织样本

选择7例红细胞表型为O型的乳腺癌患者，免疫组化显示肿瘤中表达不相容的A抗原。样本，即患者配对的正常(N)/肿瘤(T)组织，来自Ibn Rochd大学医院(卡萨布兰卡，摩洛哥)病理科的乳腺肿瘤切除术或乳房切除术。所有样本均用福尔马林固定，石蜡包埋，含有肿瘤和邻近正常乳腺组织的代表性部分，分别表达A和H抗原。

从福尔马林固定和石蜡包埋组织中提取DNA

对于每个样本，将肿瘤和邻近的非癌组织圈起来，用手术刀刮拭，放入微管中，用二甲苯和无水乙醇脱蜡。

使用QIAamp DNA FFPE tissue MinElute®试剂盒(Qiagen)手册从固定乳腺组织中提取基因组DNA，该试剂盒由制造商提供的“组织”协议推荐。提取的DNA用60 μL TE Buffer洗脱，-20℃保存后使用。

土著居民的采用荧光、双链SSP-PCR进行基因分型

核苷酸位置c.261(PCR 1)和c.703(PCR 2)土著居民的基因分析荧光,双sequence-specific底漆(ASP) - PCR(表1)。PCR反应进行最后的反应量10µL 1 x HotStarTaq PCR反应混合液(试剂盒),0.4µM的底漆,0.5µM的普遍U-FAM引物(表1)和2µL纯化基因组DNA。

聚合酶链反应	Theoric大小(pb)	等位基因 特异性	引物
			序列(5 '→3 ')
1	243	一个或B	ABO_261G_F一个	GTTTCTTCAGCCAAAGGTCTGACACCCCGGAAGGATGTCCTCGTGGTGA
	222	O	ABO_261X_F一个	GTTTCTTGTGGAAGGATGTCCTCGTGGTAC
	-	-	ABO_261C_RuFb	GTCGTAGTCGACGACCGTTAAATGTCCACAGTCACTCGCCACT
2	153	B	ABO_703A_F一个	GTTTCTTGTGGAGATCCTGACTCCGCTCCTCGGCACCCTGCACCACA
	133	一个或O	ABO_703G_F一个	GTTTCTTGTTCGGCACCCTGCACCCGG
	-	-	ABO_703X_RuFb	GTCGTAGTCGACGACCGTTAGAAATCGCCCTCGTCCTTGG
-	-	-	U-FAM	6-FAM-GTCGTAGTCGACGACCGTTA

表格1：荧光双向PCR-SSP引物
^一个特异性正向引物，基因分型序列为GTTTCTT(下划线)。
^b常用的反引物含有单序列GTCGTAGTCGACGACCGTTA(下划线)。

PCR扩增产物(0.5µL)与GeneScan™500 ROX™(Applied Biosystems)混合在去离子化甲酰胺Hi-Di™(Applied Biosystems)中。产品在95°C下变性5分钟，然后放在冰上5分钟。单链DNA片段在3130xl基因分析仪(Applied Biosystems)中通过毛细管电泳分离，所得的电泳图用GeneMapper®软件进行分析。通过对PCR 1和2的扩增结果进行解释，最终确定基因型。

土著居民的测序

第6和第7个外显子土著居民的用从正常和肿瘤细胞中提取的基因组DNA进行测序

我们获得了最小的覆盖深度9X，这为分析SNPs提供了足够的深度。深度毯>5X显著。将获得的序列与参考基因组进行比对，并使用NCBI数据库和ENSEMBL进行分析，以确认新突变对蛋白质的影响。我们在数据库中查找突变是否已经被描述过。我们还对每种突变的文献进行了研究。

在这里，我们只报道了正常和肿瘤DNA之间的不同突变。基于pcr的Sanger测序证实了突变。

结果

土著居民的采用荧光、双链SSP-PCR进行基因分型

7例中，4/7为基因分型O/O在正常和肿瘤dna中，3/7是基因分型的O/O在正常DNA中一个/O(表2)。

样品标识	组织	组织表型(包含IHC)	基因型一个	核苷酸职位b
				c.261	c.320	c.740
1 2 3 4	正常的	H	O / O	G / delG	A /菲律宾人质	A / G
	肿瘤	一个	O / O	G / delG	A /菲律宾人质	A / G
5、6、7	正常的	H	O / O	G / delG	A /菲律宾人质	A / G
	肿瘤	一个	一个/ O	G / delG	一个/一个	一个/一个

表格2：7例O型血A抗原表达不相容患者正常和肿瘤组织的基因型表现型
^一个采用荧光、双链SSP-PCR检测基因型。
^b通过测序确定的核苷酸位置。
变化有下划线,德尔:删除。

土著居民的外显子测序和SNP过滤

土著居民的7例肿瘤中表达不相容A抗原的患者的基因测序显示存在两种新的不同的突变，据我们所知，在数据库和文献中都没有报道过。第一个突变是外显子6的单个碱基缺失，即c.320delA，这可能会导致缺乏催化活性位点的非功能性产品(p.Glu107GlyfsX12)的产生。

第二个突变是第7外显子的单碱基替换，即c.740A>G，它被认为是一个甘氨酸残基(p.Glu247Gly)取代谷氨酸残基。

这两个SNPs存在于7例患者的正常DNA中(即病例1/N ~ 7/N)，以及4/7例患者的肿瘤DNA中(即病例1/T ~ 4/T)。相反，在3/7例患者(即5/T至7/T病例)中，320位A核苷酸未缺失，且肿瘤DNA中缺失c.740A>G突变(表3)。

此外，所有患者的DNA中均存在O等位基因261delG的共同缺失。

情况下数量	土著居民的基因型	c.320delA	c.740A > G
1 / N	O / O	+	+
1 / T	O / O	+	+
2 / N	O / O	+	+
2 / T	O / O	+	+
3 / N	O / O	+	+
3 / T	O / O	+	+
4 / N	O / O	+	+
4 / T	O / O	+	+
5 / N	O / O	+	+
5 / T	A / O	-	-
6 / N	O / O	+	+
6 / T	A / O	-	-
7 / N	O / O	+	+
7 / T	A / O	-	-

表格3：7例患者中第6和第7外显子突变。
+:突变的存在;
-:没有突变。

讨论

不相容的A抗原只存在于肿瘤中，而看起来正常的邻近乳腺组织没有标记抗A，也没有显示酶活性，证实不相容抗原表达与癌症有关，而不是与个体有关[21-24]。

4/7例患者在正常和肿瘤中为O/O基因型，3/7例患者在正常和肿瘤中为O/O基因型。这一结果与David L的研究不一致，David L的研究表明，所有表达A抗原的病例都是基因型O/O，共同缺失261delG[25]。

为了研究导致A抗原表达的可能突变，并回答A抗原来自非缺失O等位基因的假设，我们对ABO基因的最后两个外显子6和7进行了测序。对7例患者的正常和肿瘤DNA进行测序，发现261delG公社缺失和2个新突变，分别位于第6外显子的320位(c.320 delA)和740位(C.740 A>G)。

我们的结果表明，261,320和740的正常DNA基因型O/O是杂合子。261的一个等位基因是缺失的，320的第二个等位基因是缺失的。320缺失所产生的终止密码子将产生一个截断的蛋白，不能赋予糖基转移酶活性a或B，因此正常组织只表达O抗原。而在表达A抗原的肿瘤组织中，261中肿瘤DNA杂合，删除缺失320，终止密码子不再存在，阅读框不改变，合成糖基转移酶A(图1)。

图1:一个病例的电泳图显示正常DNA基因型O/O(上)和肿瘤DNA基因型A/O(下)(显示样本ID)。

相比之下，4/7例基因型O/O患者的肿瘤DNA有相同的缺失c.320 delA和c.740>g与肿瘤组织表达相应的不相容抗原A。通过分析H抗原在正常和肿瘤组织中的表达，我们在1/4例患者中观察到H抗原在肿瘤组织中保留了强烈的表达，80%的细胞表达了H抗原，而40%的细胞表达了不配伍的A抗原。在这种情况下，测序结果可能取决于样本组织中DNA的比例或数量。其余患者(3/4)肿瘤组织上未表达H抗原。另一种分子机制可能与不相容的A抗原有关。

另一方面，Maaf-Hosseini等人[26]指出，非缺失O等位基因经常出现，虽然不常见，但在血清学和基因分型方面存在严重的错误解释风险。同一小组研究了一个血型为A型低凝集，基因型为A1/O1的献血者。一个O等位基因缺乏常见的c.261delG突变，呈突变322C>T，在107氨基酸后产生一个立即终止密码子，已被分型为A1等位基因。这种等位基因被认为完全不能产生非活性酶，但事实并非如此。事实上，终止密码子的存在并不一定意味着酶是不活跃的(图2)。

图2:O型等位基因和a型等位基因突变的示意图模型。

人们提出了两种假设。可能有另一个独立的基因能够启动生物合成转移酶作为基因转换。此外，重组事件可能发生在骨髓或骨髓外的体细胞克隆中，并在同一人体内造成双种群[24,27]。

另外，我们没有观察到表达a样抗原的病例与其他病例在临床和病理特征上的显著差异。作者认为，不相容的A抗原表达可能是由于对非自身[28]血型抗原的抗体的自然产生而对癌细胞的排斥。

典型的例子是一个小p血型的胃癌患者，其肿瘤组织表达不相容的p抗原。Levine认为，输血P不相容刺激了anti-P、P2和pK的合成，从而使患者对P不相容抗原[29]产生免疫反应，从而使患者完全康复。

据调查，O型血生育O型血孩子的女性与O型血生育a型血[30]不相容孩子的女性相比，结直肠癌的发病率较高。O型腺癌患者的低发病率提供了一个证据，证明不相容抗原A的表达作为对癌细胞免疫监测的触发器的重要性。

我们的发现表明了相同的假设，因为抗原A存在于所有病例的细胞质中。人们已经认识到，在癌症中诱导免疫应答的大多数肿瘤抗原是内源性合成的胞质蛋白，并在胞质中降解为与主要组织相容性复合体1类相关的小肽[31,32]。

结论

我们的研究结果表明，在42.86%的O表型患者中，不相容的A抗原来源于320位O等位基因缺失，该等位基因是由一种与外显子6和7中的A转移酶类似的功能免疫反应蛋白产生的。尽管A抗原在肿瘤生物发生中的生物学功能尚不清楚，但在肿瘤细胞表面表达A抗原可使其在临床上作为肿瘤预后的生物标志物。如果表达A抗原的肿瘤被识别并被免疫系统抑制，那么它可能是免疫治疗的一个有趣的潜在靶点。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

所有作者都已阅读并批准了手稿的最终版本。

确认

我们非常感谢Pr S. ZAMIATI为我们进入病理科提供了便利。

参考文献

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条信息

文章类型:研究文章

引用:Zouine S, Bakhchan A, Zaid N, Zaid Y, Kojok K, et al.(2016)非缺失的O参与乳腺癌中不相容的A表达。J Blood Disord Med 2(1): doi http://dx.doi。org/10.16966/2471 - 5026.113

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出版的历史:

收到日期:2016年11月02

接受日期:2016年11月14日

发表日期:2016年11月18日