摘要GydF4y2Ba

肽质量指纹图谱(PMF)通常被认为是可行的蛋白质消化后广泛分离。鸡肉肌肉包括两种基本的肌肉类型——通常被称为黑肉和白肉。使用从鸡肌肉胰蛋白酶消化液中提取的高分辨率PMF，肌球蛋白重链的使用明显不同。此外，糖酵解酶和其他丰富的肌肉蛋白的较小的折叠变化可以被检测到。LC-MALDI-TOFTOF实验证实了这些变化背后的肽。因此，用最少的准备步骤就可以区分肌肉准备中丰富的蛋白质使用情况，这在对人体肌肉活检样本进行分类方面可能是有用的。GydF4y2Ba

关键字GydF4y2Ba

肽质量指纹图谱，PMF, MALDI，肌肉，肌球蛋白GydF4y2Ba

缩写GydF4y2Ba

aa;氨基酸(年代);德勤:二硫苏糖醇;HCCA: -氰基羟基肉桂酸;HPLC:高效液相色谱;MALDI:基质辅助激光解吸电离;MS/MS:串联质谱;MYH:肌球蛋白重链;M /z:质量与电荷比;PCA:主成分分析; PMF: Peptide Mass Fingerprinting; ppm: parts per million; SDS: sodium dodecyl sulfate; TOF: time of flight; 1D: 1-dimensional; 2D: 2-dimensional

介绍GydF4y2Ba

当实验的目标是确定复杂生物样品中区分一个样品和另一个样品的蛋白质时，生物化学家传统上使用1D SDS凝胶或2D等电聚焦/ SDS凝胶来揭示表达模式的定量变化。最近，质谱技术已经发展到从SDS凝胶检测的数十种蛋白质扩展到数千种蛋白质，通常通过使用添加重原子标记的合成肽来提高定量[1,2]。然而，这些质谱测量通常需要大量的蛋白质和/或肽分离鉴定[3-8]。这些分离要求可能会引入可变性，降低吞吐量并增加分析的费用。GydF4y2Ba

另一个极端是不分离的质谱分析，其谱峰对应于最丰富和易于检测的肽段。在蛋白质制备的胰酶消化的情况下，大多数MALDI峰对应于含精氨酸的多肽。根据科学文献，在复杂的蛋白质混合物上尝试肽质量指纹(PMF)是不可行的，因为从任何特定的蛋白质中期望得到的肽太少了。然而，最近MALDI质谱仪的进步使得精确的质量测量可以达到百万分之几。质量准确性的提高显著降低了能描述每个峰的肽序列的数量，从而增加了PMF[9]的有用性。GydF4y2Ba

这份手稿旨在表明PMF可以正确地识别复杂混合物中的主要蛋白质。利用鸡肌肉的胰蛋白酶作为模型系统，也有可能正确区分密切相关的蛋白亚型，如肌凝蛋白重链，并确定丰富蛋白的一些数量变化。为此，我们采用了针对MALDI MS数据进行优化的PMF程序。该程序明确地利用了精氨酸包含的多肽[10]的高检测能力，高质量准确度，可以获得与当今的质谱仪，以及质量列表的峰值强度。复杂混合物的典型质谱在同位素团簇还原为单同位素质量后，在m/z 800和4000之间有几百个峰。在第一轮PMF中，最丰富的蛋白质被识别出来，这产生了一套可以用于内部校准的质量。在这个阶段，应该利用样品的生物学信息来确保选择合适的蛋白质进行校准。在鸡的肌肉样本中，根据生物学，最丰富的蛋白质是肌动蛋白。在肌动蛋白肽的内部校准之后，质量公差可以被收紧，从而能够识别额外的蛋白质。利用这些方法，我们证明，只要肽中含有精氨酸，并且是胰蛋白酶的最终消化产物，仅基于两个肽就可以识别小蛋白质。GydF4y2Ba

之所以选择鸡肉肌肉系统，是因为鸡肉肌肉样品在杂货店很容易买到。如果PMF在鸡肉上成功，那么它也应该适用于人类肌肉活检样本。肌凝蛋白重链亚型的模式在肌肉病理过程中发生改变，通常是由于肌纤维使用[11]的改变。然而，当处理人体组织时，在实验之前必须遵循严格的临床准则。德赢vwin首页网址在鸡肉体系中，众所周知有两种肉，白肉和黑肉。特别是，白肉(如胸大肌)有更多的快肌纤维，而深肉(如浅内收肌和腓肠肌外侧)有更多的慢肌纤维[12-15]和更多的肌红蛋白，这些被认为是肉[16]颜色的直接原因。此外，在蛋白质组学分析中，通常认为获得新鲜切除的组织是无价的，因为蛋白质分解可能会混淆蛋白质鉴定过程[17]。如果PMF的蛋白质鉴定证明从食品杂货店的鸡肉开始是可行的，那么鉴定过程应该足够健壮，这样在人类肌肉活检样本中发生的任何降解都不会成为亚型鉴定的限制因素。最后，鸡的蛋白质组是[18]，这是PMF成功的必要条件。GydF4y2Ba

实验程序GydF4y2Ba

从肌肉提取物中制备胰蛋白酶消化剂GydF4y2Ba

四份鸡大腿深色肉(浅内收肌和腓肠肌外侧)和三份白肉(胸大肌)样本从当地超市获得。GydF4y2Ba

每个样本都来自肌肉的中间部分，而不是软骨、肌腱或皮肤附近。样品(约100 mg)均质于1 mL含有1% SDS和10 mM二硫苏糖醇(DTT)的100 mM Tris pH 8.0溶液中，加热至90°C几分钟，冷却至室温，并用25 mM碘乙酰胺烷基化。过量的烷基化剂用100mm巯基乙醇淬火。大约10%的样品在丙酮中沉淀，丙酮能将大部分的盐、核酸和脂质移到上清液中。干燥后的颗粒在37℃下用牛胰蛋白酶(Sigma)在约200:1底物蛋白:胰蛋白酶条件下消化过夜。GydF4y2Ba

只要大多数底物蛋白被消化，只要胰蛋白酶自动消化肽在MALDI光谱中不可见或几乎不可见，胰蛋白酶与蛋白质底物的比例就不是关键。在这些条件下，含蛋氨酸的肽主要以还原的蛋氨酸形式被回收，而酪氨酸裂解产生的类糜蛋白酶污染的肌动蛋白肽是无法检测到的。如果通过适当的消解方案调整达到了这两个目标，就可以简化光谱解释。GydF4y2Ba

MALDI光谱的收集GydF4y2Ba

酶切物稀释到5 mg/ml α -氰基羟基肉桂酸(HCCA)中，溶解在含有0.1%三氟乙酸的75%乙腈中，并在MALDI平板上重复标记。光谱在肌动蛋白的主要胰蛋白酶肽上进行内部校准，在任何未分离的骨骼肌蛋白的胰蛋白酶消化中，肌动蛋白是最强烈的。最高质量的光谱通常是在肽消化的中间稀释时获得的，其目标是获得具有最大可能集的良好分辨同位素簇的光谱。GydF4y2Ba

在定制的MALDI反射器仪器上获得光谱，在维珍仪器中制造的7.5米飞行管，并重复收集。使用2.4的激光脉冲电流和1500道尔顿的聚焦质量，每1NS以1kHz的激光频率收集数据每1ns的每1ns收集数据。扫描速度为1 mm / s的质量范围为10-2200道尔顿（35-530微秒）。将分析仪区域泵送到2×10-8托的压力。5000-6000激光镜头的典型平均光谱如图1所示。该平均过程几乎没有额外的MS采集时间，但提高了次要峰的质量准确性和同位素包络强度。GydF4y2Ba

图1：GydF4y2Ba白肉和黑肉光谱的比较。上面的两条轨迹显示质量在m/z 900和2000之间。七个突出的肿块在所有光谱中都是强烈的:A，肌动蛋白;MYL:肌球蛋白轻链;MYH，肌球蛋白重链(在大多数亚型中共享)。较低的痕迹突出了由于肌球蛋白重链多态性而具有显著差异的区域。在3GydF4y2Ba^{理查德·道金斯GydF4y2Ba}微量，峰值在1384.74对应一个肌凝蛋白重链肽诊断白肉。深色肉中相应的肽含量为1398.76。在1391.85和1382.65的峰值对应于烯醇化酶(在白肉中更丰富)和广泛共享的肌凝蛋白重链肽。在顶谱中，1373.69峰主要对应肌球蛋白重链。热休克蛋白B1的质量峰值(1373.74)在黑肉中更为突出。GydF4y2Ba

及GydF4y2Ba

所有PMF实验的第一阶段均使用Virgin Instruments SimulTOF软件。该软件内置了平均和峰列表去同位素功能。它还具有一个内置的基于ChemPlex软件[19](VChemplex)的PMF程序。首先，每个理论肽根据其序列和侧翼残基被分配一个化学分数。含精氨酸的多肽没有缺失的裂解和没有妥协的侧边残基(例如，酸性残基)评分为20分，而不含精氨酸的赖氨酸多肽的最高评分为2分。VChemplex首先筛选含有至少一个含精氨酸的胰肽的蛋白质，没有遗漏的裂解，映射到100个最强烈的峰中的任何一个的4ppm以内。这种质量精度要求内部校准。当一个蛋白质通过第一个限制时，下一步程序要求至少匹配一个额外的肽，使其在10ppm内包含从完整的峰列表中缺失的最多一条裂解。所计算的蛋白质得分与可由蛋白质解释的峰值强度的百分比成正比，与所绘制的预期胰蛋白酶肽的百分比成正比，其中每个肽都有一个基于其序列和侧翼残基的数字得分进行匹配，与匹配[19]的强度加权平均PPM成反比。 The initial list of proteins and matched peptides, often containing thousands of proteins, is then filtered to include only proteins that have matched peptides whose total chemistry score accounts for least 20% of the total possible chemistry score for all of the peptides in the protein. This drastically reduces the proteins to be considered further. The remaining list of proteins is sorted by decreasing overall score, and the protein list undergoes a process termed iterative subtraction. The score of each protein is recalculated but the masses in the peak list become unavailable for matching by lower ranking proteins, if there is a match to a credible peptide from a higher ranking protein. The iterative subtraction process ensures that when multiple isoforms of a protein (like myosin) are present that share common peptides, there will always be one ‘winning’ isoform. Each peak list, which typically contained about 400 deisotoped peaks, was searched against a combined Swiss-Prot and TrEMBL database containing 15148 protein sequences. This combined database was downloaded from the UniProt web site (http://www.uniprot.org/), and reconfigured into a sqlite3 database for use with VChemplex. The input for VChemplex is the MALDI spectrum displayed to the user (using the SimulTOF viewer), and is dependent on the peak detection settings selected by the user. The deisotoping function within the SimulTOF viewer maps the area of each isotope cluster to the mono isotopic mass in the peak list. Online Resource Table S1 contains a list of all of the settings used here for protein identification.

为了解决假阳性的问题，每个光谱还使用PMF，使用一个数据库，其中包含人类和斑马鱼的序列，除了鸡(204,304蛋白质序列)。当这个更大的数据库被搜索时，1400个查询(来自14个样本的100个峰)，只有678个肽段被正确分配(见列“相同的MSMS”)，而当较小的数据库被搜索时，有776个肽段被正确分配。令我们惊讶的是，PMF鉴定出27种鸡多肽，这些肽与在较小的鸡数据库中搜索时未被识别的MS/MS数据一致(在“SeqLarge”列中以蓝色突出显示)，大概是因为人类或斑马鱼的蛋白质“拿走”了一些原本会与错误的鸡肉蛋白质相匹配的物质。从这些结果来看，这些鉴定大部分是正确的，而质谱/质谱数据为确定正确的鉴定提供了有用的手段。GydF4y2Ba

及数据库GydF4y2Ba

通过MS/MS鉴定了大量的鸡多肽(见下文)后，sqlite3蛋白数据库中的一些序列被改变，以对应众所周知的化学计量学化学修饰。这有助于PMF随后对肽和蛋白质的识别，因为如果存在预期的修饰，VChemplex程序将对特定的蛋白质亚型进行更高的评分，如果没有预期的化学修饰，则评分降低。因此，鸡肌肉主要蛋白的n端预期的变化，如成熟蛋白的n端由于乙酰化(肌动蛋白和肌球蛋白)和信号序列的去除而发生的变化，被输入到蛋白序列中。根据Swiss-Prot数据库的注释和MS/MS鉴定，肌动蛋白和肌球蛋白重链中的一个组氨酸残基在所有重要的异构体中都类似地转化为甲基组氨酸。GydF4y2Ba

用HPLC分离肽GydF4y2Ba

用150 × 0.3 mm Prot 200 C18 5µm柱(the Nest Group, Southboro, MA)将消化后的肌肉样品分别注入高效液相色谱系统(HPLC)，梯度洗脱。缓冲液A为2%乙腈/ 0.1%TFA，缓冲液B为85%乙腈/ 5%异丙醇/ 10%水/ 0.1%TFA。流速为4µl/min时，梯度分为3段，分别为2-10%缓冲液B > 5 min、10% - 45%缓冲液B > 60(或130)min、45% - 100%缓冲液B > 10 min。加入基质(4µl/min, 5 mg/ml HCCA in 75%乙腈/0.1% TFA, 10皮摩尔/合成肽标准品)，每5秒在384点板上进行点析。注意，这些分离仅用于支持MS/MS分析。GydF4y2Ba

MALDI光谱的获取GydF4y2Ba

质谱在7.5 m飞行管的原型质谱仪上采集，m/z为每ns 10 ~ 2200(~ 35微秒~ ~530微秒)，频率为1 kHz。由于数字化仪的容量，采集从10 m/z开始，因此需要2200的m/z上限。从m/z 500(甚至800)处开始可以获得光谱，这将导致PMF匹配更多的峰。通常，5000个光谱一起被平均，结果是35000个分辨率。用肌动蛋白对内标定光谱。在源电压为1 kV和第二源电压为2 kV的SimulTOF-300上采集MS/MS谱图。通常情况下，每个前体采集5000 - 20000个针剂，每个斑点最多采集10个前体。GydF4y2Ba

信息学GydF4y2Ba

利用SimulTOF软件中内置的VChemplex程序进行指纹识别。搜索参数元数据和峰值列表，肽和蛋白质鉴定下载到SQLite3数据库。为了提高SQL查询的速度，首先将理论质量和峰值m/z映射到它们最近的质量库，计算方法是将质量四舍五入除以1.0005。这使第一次通过基于整数的对齐成为可能。GydF4y2Ba

PCA分析:GydF4y2Ba

为了进行PCA分析，数据必须被组织成一个质量特征矩阵与适当归一化的样本。执行以下步骤来获得这个矩阵。为了进行本文所述的实验，我们从七个不同的肌肉消化酶中获得了两个光谱。在PMF之后，输出存储到SQLite3数据库中，然后导入到Microsoft Access中。符合标准或非肽的物质根据其质量缺陷被去除。然后每个峰被分配到每个光谱的强度等级。然后将得到的1400个质量表(表S2)分组到质量仓中，并确定每个质量仓的标准差。在这个数据集中，有7个质量箱子被手工分成两个质量特征，因为质量的标准偏差大于0.025。在这个阶段，对合并的质量列表进行过滤，以包含在14个样本中至少遇到3次的质量特征。在这些数据中，这导致了157个质量特征，质量范围在m/z 800和2115之间。 To prepare the mass features for PCA, the 157 peaks and their raw intensities were copied into excel, and then doubly normalized, first by column, and then by row (converting each intensity into a percentage). A comma delimited file consisting of these data was imported into R (see Table S3, columns “Peak” and columns “1a-7b”), and PCA analysis was performed using the prcomp function in the R statistical package (http:// www.r-project.org/). The principal component table from R was then exported back into excel for plotting purposes.

结果GydF4y2Ba

肉提取物的消化光谱GydF4y2Ba

从这些光谱中可以看出，大多数强峰是共有的。插图显示了m/ z1362到1410之间的区域。有些峰在一个光谱中很强，但在另一个光谱中很弱或几乎没有;例如，峰值在1384.74(白肉强度高)，峰值在1398.76(深色肉强度高，白肉强度低)。图1中插图所显示的差分峰强度并不局限于这个特定的质量区域。为了建立这些模式的重现性，额外的样品从白肉和黑肉在不同的时间从不同的旅行到杂货店准备。在所有情况下，白肉和黑肉之间的差异很明显，表明某些蛋白质的丰度在白肉和黑肉之间存在显著差异。后续实验包括三份白肉和四份黑肉样品，每一份样品在MALDI平板上都有重复的斑点，产生14个光谱，下面详细描述。GydF4y2Ba

IdGydF4y2Ba一种GydF4y2Ba	样本GydF4y2BaB.GydF4y2Ba	类别GydF4y2BaCGydF4y2Ba	山峰GydF4y2BaD.GydF4y2Ba		前GydF4y2Ba100年的峰值GydF4y2BaE.GydF4y2Ba
			及GydF4y2BaFGydF4y2Ba		正确的GydF4y2BaGGydF4y2Ba	二甲基砜GydF4y2BaHGydF4y2Ba
1GydF4y2Ba	1GydF4y2Ba	W.GydF4y2Ba	420GydF4y2Ba	58GydF4y2Ba	53GydF4y2Ba	72GydF4y2Ba
2GydF4y2Ba	1 bGydF4y2Ba	W.GydF4y2Ba	420GydF4y2Ba	61GydF4y2Ba	58GydF4y2Ba	74GydF4y2Ba
3.GydF4y2Ba	2GydF4y2Ba	W.GydF4y2Ba	414GydF4y2Ba	54GydF4y2Ba	50GydF4y2Ba	67GydF4y2Ba
4.GydF4y2Ba	2 bGydF4y2Ba	W.GydF4y2Ba	420GydF4y2Ba	53GydF4y2Ba	47GydF4y2Ba	70GydF4y2Ba
5.GydF4y2Ba	3GydF4y2Ba	W.GydF4y2Ba	420GydF4y2Ba	56GydF4y2Ba	52GydF4y2Ba	74GydF4y2Ba
6.GydF4y2Ba	3 bGydF4y2Ba	W.GydF4y2Ba	420GydF4y2Ba	53GydF4y2Ba	50GydF4y2Ba	68GydF4y2Ba
7.GydF4y2Ba	4GydF4y2Ba	D2GydF4y2Ba	420GydF4y2Ba	66GydF4y2Ba	55GydF4y2Ba	76GydF4y2Ba
8.GydF4y2Ba	4 bGydF4y2Ba	D2GydF4y2Ba	420GydF4y2Ba	58GydF4y2Ba	50GydF4y2Ba	75GydF4y2Ba
9.GydF4y2Ba	5GydF4y2Ba	D1GydF4y2Ba	415GydF4y2Ba	59GydF4y2Ba	52GydF4y2Ba	71GydF4y2Ba
10GydF4y2Ba	5 bGydF4y2Ba	D1GydF4y2Ba	420GydF4y2Ba	61GydF4y2Ba	55GydF4y2Ba	73GydF4y2Ba
11GydF4y2Ba	6GydF4y2Ba	D1GydF4y2Ba	381GydF4y2Ba	58GydF4y2Ba	52GydF4y2Ba	74GydF4y2Ba
12GydF4y2Ba	6 bGydF4y2Ba	D1GydF4y2Ba	395GydF4y2Ba	63GydF4y2Ba	52GydF4y2Ba	71GydF4y2Ba
13GydF4y2Ba	7一个GydF4y2Ba	D2GydF4y2Ba	385GydF4y2Ba	66GydF4y2Ba	62GydF4y2Ba	76GydF4y2Ba
14GydF4y2Ba	7 bGydF4y2Ba	D2GydF4y2Ba	357GydF4y2Ba	63GydF4y2Ba	60GydF4y2Ba	78GydF4y2Ba
平均数GydF4y2Ba			407.6GydF4y2Ba	59.2GydF4y2Ba	53.4GydF4y2Ba	72.8GydF4y2Ba
总和GydF4y2Ba			5707GydF4y2Ba	829.GydF4y2Ba	748GydF4y2Ba	1019GydF4y2Ba

表1:GydF4y2Ba样品GydF4y2Ba
样品GydF4y2Ba^{一种GydF4y2Ba}ID，样本的索引号。GydF4y2Ba^B.GydF4y2Ba样本，关键描述生物摘要。GydF4y2Ba^CGydF4y2Ba类别，通过PCA分析得出样本所属的类别，如图2A所示。GydF4y2Ba^D.GydF4y2Ba峰数，PMF指纹图谱中使用的峰数。如果在每100个amu增量中有30个峰值，则达到最大420个。GydF4y2Ba^E.GydF4y2Ba100强峰:GydF4y2Ba^FGydF4y2BaPMF，无论是否有MS/MS数据支持，与表S4中列出的前10个蛋白相匹配的前100个峰的数量。GydF4y2Ba^GGydF4y2Ba正确，这些峰的数量与质谱/质谱分析一致。GydF4y2Ba^HGydF4y2Ba通过液相色谱/MALDI分析鸡肌肉胰蛋白酶消化酶后进行的MS/MS分析，可以推断出前100个峰的数量。MS/ MS能够识别的多肽比PMF单独正确分配的多肽更多，这些多肽在表S2的M列突出显示。GydF4y2Ba

及分析GydF4y2Ba

表2显示有53个峰与肌球蛋白相匹配，12个峰与肌动蛋白相匹配(列PepI)。51和10的山峰(Pep)列映射到肌球蛋白和肌动蛋白通过标准判断适合迭代减法因为他们映射到终端消化tryspin产品,或者错过了乳沟肽侧翼残留物,胰蛋白酶是低效率的裂开[20]。相应地，在计算表中排名较低的蛋白质的分数之前，将相应的质量从峰值列表中删除。表2还列出了在所有峰值都可用的情况下，蛋白质从初始列表开始得到的分数(ScoreI)。以排在第三位的蛋白质为例GydF4y2Ba^{理查德·道金斯GydF4y2Ba}和7GydF4y2Ba^thGydF4y2Ba在表中，匹配的峰值越少得分越高，因为其余的峰值匹配得越准确，因此影响得分的强度加权PPM匹配平均值略低。在表2中，蛋白质名称是根据蛋白质类别进行着色的，强调顶部的蛋白质击中对应的是肌动蛋白和肌凝蛋白亚基。表S4是表2所示PMF分析的扩展版本。它包含从每个质谱中鉴定出的前25个蛋白(总共14 × 25个蛋白，许多冗余)。在检查本表中排名较低的蛋白质名称时，很明显，经过10轮迭代减法后，大多数排名较低的蛋白质是不正确的，因为它们与已知的丰富蛋白质(按类别着色)不对应，很明显，随机的蛋白质从密切相关的样本中出现。尽管如此，根据MS/MS数据，11- 25范围内的偶尔蛋白质可能是正确的。表S2列出了14个光谱(匹配1400个峰)的前100个峰所对应的序列。经过100轮迭代减法,大部分的山峰被映射到一个蛋白质,但少数仍未赋值的因为质量不能映射到任何胰蛋白酶的肽产生一种蛋白质至少有一个终端arginine-containing肽相匹配的前100名群众在4 ppm。将各序列对应的蛋白质按照表S4的方法染色。GydF4y2Ba

表2GydF4y2Ba:从一个质谱图中得出的10大蛋白质来自白肉样品1。GydF4y2Ba^{一种GydF4y2Ba}Rank是蛋白质鉴定的优先顺序，根据列评分进行排序。GydF4y2Ba^B.GydF4y2BaPep，经过迭代减法后映射到峰值列表的肽的数量。GydF4y2Ba^CGydF4y2BaPepI，在迭代减法之前，映射到峰值列表的肽的初始数量。GydF4y2Ba^D.GydF4y2Ba得分，蛋白质的得分，迭代减法后。GydF4y2Ba^E.GydF4y2BaScoreI，没有迭代减法的分数。GydF4y2Ba^FGydF4y2BaPCM，化学分数百分比匹配肽（迭代减法），将其映射到蛋白质。GydF4y2Ba^GGydF4y2Ba皮姆，与蛋白质匹配的强度百分比。GydF4y2Ba^HGydF4y2BaPpw，测量的峰质量与计算出的肽质量之间的强度加权平均PPM偏差。GydF4y2Ba^{一世GydF4y2Ba}长度，aa中蛋白质的长度。GydF4y2Ba^jGydF4y2Ba符号，蛋白质的缩写，与用来表示编码蛋白质的基因的命名有关。GydF4y2Ba^K.GydF4y2Ba蛋白质名称，一个方便的蛋白质名称，调整为清晰。红色的蛋白质名称表示肌动蛋白或肌球蛋白亚基;绿色表示糖酵解，蓝色表示MS/MS确认的其他丰富的肌肉蛋白。GydF4y2Ba

PMF结果的MS/MS确认GydF4y2Ba

为了验证PMF蛋白鉴定的结果，并验证我们的PMF工作流程的有效性和准确性，我们在LC分离后收集了700多个不同肽段的MS/MS数据。通过研究完整的蛋白序列，14个指纹图谱中排名前10位的蛋白可以合并到26个蛋白亚型(表3)。在这26个蛋白亚型中，21个通过MS/MS谱验证，至少有3个不同的MS/MS鉴定。这21种蛋白均对应丰富的肌肉蛋白(柱状MSMS)。其他5个中的4个接近列表的底部(>=7)，并且是最可能是虚假的单例识别，因为它们不能被识别为丰富的肌肉蛋白。剩下的单例鉴定是肌凝蛋白重链异构体(MYHg，心房)，经检查不包含MS/MS支持的任何多肽，这些多肽也不能归属于至少一个其他肌凝蛋白重链。因此，6条肌凝蛋白重链由MS/MS数据支持，这些数据基于4个或更多的肽段，不能归属于更小的肌凝蛋白重链序列。PMF在14个图谱中的每一个都至少指定了一个MYH n端肽，这说明了4种不同的MYH亚型。从这个观察，很明显，最丰富的肌凝蛋白重链在七个已分析的鸡肉样品之间是不同的。在肽水平上，PMF分配的许多(但不是所有)肽都通过MS/MS确证，并在表S2的“序列”一栏用绿色标出。另一方面，正如预期的那样，许多经MS/MS鉴定的多肽在PMF光谱中没有被正确分配(表S2中“SequenceMSMS”一栏用紫色标出，“conclusion”一栏标记为“不正确”或“不在数据库中”)。 See the table S2 legend for more details regarding the relationship of PMF assignments and MS/MS identifications. Some of the peptides identified by MS/MS are not evident at all among any of the mass signals in any of the PMF spectra, presumably because they are suppressed at the level of ionization.

表3。GydF4y2Ba由PMF鉴定的合并蛋白质。GydF4y2Ba
^{一种GydF4y2Ba}符号，蛋白质的缩写。经PMF鉴定，该蛋白的样品数量居前10位(最多14个)。曲柄，在14个样本中，该蛋白被识别的最低等级。dProtein Name，蛋白质的常用描述性名称。染色方案:红色为肌动蛋白和肌球蛋白，绿色为糖酵解酶，蓝色为其他丰富的肌肉蛋白，不正确的鉴别未着色。肽，PMF在任何一个样品中归属于该蛋白的前100个肽的最大数量。fMSMS，“*”表示通过MS/MS鉴定到与该蛋白特异性肽段。gMascot, MS/MS获得的任何一种肽中最高的吉祥物得分。GydF4y2Ba

PCA分析GydF4y2Ba

使用主成分分析(PCA)，人们可以确定样品之间的可分离程度，而无需确定质量。为了实现这一点,一个表是包含所有准备的质量特性,排名在前100名群众至少3的光谱与内部质量的一致性15 ppm,结果在一个表中包含157个质量特性表(S3),包括7对群众在1阿姆河S5(见表)。在14个不同强度(N列)的光谱中发现了40个质量特征，而在相反的极端情况下，3个光谱中各有23个质量特征。如方法(列“1a-7b”)所述，对强度数据进行双重归一化并进行PCA分析。图2A显示，PCA清晰地将14个样本分为3类:一类是白肉，两类截然不同的深色肉。GydF4y2Ba

PCA分析还揭示了哪些质量特征是负责聚类的，这是独立于识别数据的。如上所述，表S2中的许多质量都已被定位到特定的蛋白质，这使得根据所提出的鉴定结果选择性地标记质量特征成为可能。在图2 b中,群众及和MS / MS映射的不变的蛋白与肌动蛋白(S3 11肽,见表列“象征”),肌球蛋白轻链(4肽),和肽之间共享大多数MYH亚型的表达(14肽)被合并成一类“行动”(肌动蛋白),并贴上大黑点。这些肽集中在PCA图的中心，正如预期的不变肽。映射到7种不同的糖酵解酶(15种肽)中的任何一种的肽被涂成黄色。MYHa(8个肽段)、MYHb(12个肽段)和MYHc(5个肽段)的肌凝蛋白重链特异性肽段分别显示为蓝色、红色和绿色。其余88个肽被标记为小黑点。其中一些已经确定，并且都列在表S3中。表S6显示了最容易检测到的肌凝蛋白重链tryptic多肽(经MS/MS分析证实)是如何在TrEMBL数据库中的10个肌凝蛋白亚型中共享的(表S7中列出)。没有一组同源的胰蛋白酶肽具有所有这10种亚型的独特的肽序列; however, there are many peptides that are distinct between the first 3 isoforms. The table shows by color-coding how prominent the mass signal was observed in the peak lists (obtained after automated de-isotoping) derived from the seven samples and 14 PMF spectra. Cells are colored according to the intensity rank of the matched peptide; if the peptide was in the top 25, it is colored red, between 25 and 50, colored orange, between 50 and 80, colored yellow. It is clear that the 3 white meat samples nearly always have higher expression of the tryptic peptide that maps to the MYHa isoform, whereas the dark1 meat sample maps best to MYHb peptides, and dark2 meat samples map best to MYHc and d peptides. This pattern is consistent with the PCA analysis in figure 2B. There is no evidence for detection of peptides unique to the MYHe - MYHj isoforms either by PMF or by MS/MS.

图2：GydF4y2BaPCA分析:157个质量，m/z在800 - 2200之间，按质量分类到~ 30ppm，并计算了14个样品的%强度分布。空白质量/样品元素赋值为0.01。每个元素先按百分比归一化，然后按质量归一化。用R对157 × 14矩阵进行主成分分析，既按样本聚类，又将矩阵(质量与样本→样本与质量)转换为按质量聚类。样本聚类如图2A所示。样本分为3组;白肉沿着PCA成分1从黑肉中分离出来，而黑肉沿着PCA成分2分为2组。基于质量的PCA分析，根据图2B中映射的蛋白质类别对质量进行过滤和着色。几乎所有肌凝蛋白异构体(肌动蛋白和肌凝蛋白轻链MYLPF)共有的29个肽被合并到标记为“ACT”的类别中，并用黑色标记。这些肽聚集在PCA图的中心。 Myosin heavy chain isoformspecific peptides were split into four categories; MYHa (blue, 11 peptides), MYHb (red, 7 peptides), MYHc (green, 4 peptides), MYHbc (orange, 6 peptides) and correspond roughly to the symbol column in Table S7. 15 peptides from 7 different glycolytic enzymes are marked “gly” and colored yellow. The 85 remaining masses were assigned to the category “others” whether or not they were identified by MS/MS or assigned by PMF. The category assignment of each peptide is listed in column PCA of Table S6.

讨论GydF4y2Ba

PMF在鸡特殊的白色和黑色肌肉的胰蛋白酶消化系统中进行。本研究的重点是建立一个基于PMF鉴定蛋白质的比较蛋白质组学范式，并确定PMF工作流程推断蛋白质鉴定和蛋白质丰度的能力。为此，编制了补充表，详细描述了哪些肽鉴定与相似样品的质谱/质谱数据相比较是正确的。GydF4y2Ba

当由鸡肌肉胰蛋白酶消化的20-40个最强峰组成的峰值列表提交到PMF程序时，肌动蛋白亚型很可能是最受欢迎的，因为肌动蛋白相对较小(377 aa长)而且非常丰富。当多种蛋白分配被启用时，有时也可以识别肌凝蛋白，但因为肌凝蛋白是一种更大的蛋白(约1940 aa长)，需要更大的峰列表来建立足够的覆盖范围来识别。传统上，蛋白质组学研究人员认为PMF能够从整个组织消化中成功识别肌动蛋白和肌凝蛋白，峰列表越大，错误的阳性识别就会增加，而错误的识别就会减少。然而，在这些样本中，至少有一个峰在每个质量的背景之上是可检测的，这意味着有可能得到一个更大的峰列表。将可能重叠的同位素减少到最佳的单同位素质量和强度列表是一个挑战。PMF程序VChemplex旨在利用大峰值列表中的信息，但这需要仔细调整搜索参数。最佳搜索参数可以在样品中已知的蛋白(如肌动蛋白和肌凝蛋白)和样品中已知的蛋白(如未经MS/MS鉴定的任何蛋白)之间进行最佳区分。优化后，搜索参数选择的细微变化会影响结果;然而，顶级蛋白的鉴定对各种参数值都是稳定的(数据未显示)。因此，大多数参数的变化只影响较少丰富的蛋白质的鉴定。 Because peak intensity and peptide chemistry play a crucial role in protein scoring, the absolute number of peaks in the peak list has a minor impact on protein scoring. The settings listed in table S1were chosen because they produced the most credible and consistent results for all 14 samples described in this manuscript, and for other chicken muscle digest samples (data not shown).

当执行PMF搜索时，可以根据最顶端的蛋白质命中生成校准文件，然后可以用于质谱的内部校准。在我们的实验中，以肌动蛋白和肌球蛋白的多肽为基础的标定模型得到了最好的结果。然后使用m/z 1790.8926处的肌动蛋白肽作为一个点内校准剂，将该校准模型应用于给定分析中的所有光谱。未分离蛋白酶的典型峰表在m/z 600到6000之间有几百到上千个峰，但本文研究的质量范围在800到2200之间，导致大约400的峰值(见表1)。当一个质量可以被映射到在4 ppm的顺序必须是arginine-containing肽也是一个终端胰蛋白酶的消化产物,经常有少于10胰蛋白酶的肽能占峰鸡数据库中的15148个蛋白质序列组成。GydF4y2Ba

为了使PMF的识别对肌纤维类型的表征有用，区分哪些肌球蛋白亚型在[11]中最为丰富是很重要的。大量文献表明，基于使用多种蛋白质组学方法对来自不同动物的肌肉样本进行鉴定，许多同源异构体都得到了高表达[12,14,15,20]。此外，根据基因芯片实验，大量的肌球蛋白亚型通常在同一肌肉中同时表达[12,21]。这对PMF来说是一个挑战，因为许多胰肽在几个同源肌凝蛋白异构体之间共享(见表S6)。VChemplex程序旨在从未分离的蛋白质消化系统中同时识别许多蛋白质，这不仅需要高质量的准确性，而且还需要对匹配的多肽的化学反应进行仔细的关注。因为VChemplex PMF程序执行了一轮又一轮的迭代减法，一个肌凝蛋白亚型总是会胜过其他亚型。在我们的实验中，VChemplex程序在第1位或第2位发现了一种来自白肉的肌凝蛋白重链亚型。这一结果主要是基于三个末端含有精氨酸的胰蛋白酶消化肽，即nend肽、aa 1424起始肽和aa 1681起始肽。后两个肽在PMF光谱中足够突出，可以解释图2中黑肉和白肉的主成分分析分离。这三个多肽中的两个(n端和aa 1681)在本手稿分析的肌肉样品中占主导地位的黑肉肌球蛋白亚型之间也具有多态性。GydF4y2Ba

有几种方法来评估PMF识别的可信性。在一种方法中，当计算胰蛋白酶的肽质量时，每一个蛋白质都是重复输入的。在第二种“移位”形式中，每个胰蛋白酶的质量按偏移参数移位。任何与“转移”蛋白质的匹配都是假的。还可以搜索不合适的数据库(如细菌)和相关物种，以测试结果的稳健性。另一种选择是，可以将每个谱一分为二，只使用较低的质量(例如，m/z 800和1200之间)进行搜索，并将结果与使用m/z 1200和4000之间的质量进行搜索进行比较。在健壮性鉴定中，从峰列表的每一半获得相同的蛋白质。显然，所提出的鉴定可以通过MS/MS实验进行确证，或者直接或者间接地进行LC肽分离(如本文所述)。最后，因为PMF只能检测制剂中含量最丰富的蛋白质，所以所提出的鉴定方法应该具有生物学意义GydF4y2Ba

尽管肌凝蛋白衍生的肽足以解释PCA将肌肉样本分成三组的原因，但显然还有许多其他肽也起了作用，其中一些尚不清楚。从图2B中可以明显看出，大多数糖酵解酶衍生的肽在白肉样品中都很突出，这是快肌纤维[22]的特征。令人惊讶的是，肌红蛋白(MB)通常被认为是造成深色肉和白色肉[16]颜色差异的原因，PMF却没有检测到它。MB有三个含精氨酸的胰蛋白酶肽(都被MS/MS检测到)，即使在PMF光谱中仔细检查，也没有一个是明显的。因此，肌红蛋白似乎不够丰富，不足以检测指纹从未分离的整个肌肉消化。虽然在这里检查的样本数量很少，但有证据表明几种其他蛋白质的差异表达;例如，通过PMF和MS/MS数据映射，丝素C仅在白肉中检测到，而肌酸激酶s型、肌酸激酶(CKMT2)和热休克蛋白B1似乎在黑肉的“黑2”样品中富集，这可能与特定的肌凝蛋白重链使用(异构体c和d)有很好的相关性。使用本文描述的技术进行PMF分析将是很有趣的，该技术从接受电生理分析的单个肌肉纤维开始，以证实这种观察。GydF4y2Ba

PMF在进行这种分析时的另一个限制是质谱仪的分辨率。这里使用的原型质谱计能够产生典型的质量分辨率约35000的质谱。使用分辨率较低的SimulTOF 2000质谱仪进行的实验表明，PMF仍然可以识别相同的肌球蛋白重链，就像在这些实验中确定的那样，但识别含量较低的蛋白质变得非常困难，因为无法解决的母体肿块。显然，使用广泛的多肽分离和同位素富集策略、多重反应监测策略或2d凝胶电泳，经典蛋白质组学方法可以更准确地定量更多的蛋白质。然而，这些策略需要仔细注意样品制备的重复性，而且既耗时又昂贵。这里使用的策略对于制定更仔细的蛋白质组分析方案，以及寻找需要额外关注的样本的筛选目的是理想的。GydF4y2Ba

在检查表S4中PMF提出的鉴定时，很明显PMF通常能够正确地识别肌肉中的10种蛋白质。在肽水平上，表S2中PMF正确地占了1400个质量中的787个。在381例病例中，MS/MS尚未鉴定出能解释该峰的肽段，因此这些肿块在表S2的MSMS列中被标记为“未鉴定”。从表S4可以看出，有些强质量信号PMF从来没有正确地分配过，有些也从来没有被MS/MS识别过。这至少有两个主要原因。一个问题是意想不到的化学修饰。在这些实验中，我们改变了肌动蛋白和肌球蛋白(以及其他一些蛋白质)的序列，以便VChemplex程序能够识别已知的N端修饰，以及已知的组氨酸甲基化位点。在MS/MS裂解后，这些肽在m/ z124处产生一个强的甲基-组氨酸铵离子峰(数据未显示)。似乎这些修饰几乎是构成的，因为没有未修饰的肽被发现。之前在更大的人体肌肉蛋白质组分析中遇到了相应的修饰肽段，在该分析中数据是通过电喷雾[20]的MS/MS获得的。 Therefore, these modifications appear to be conserved between chickens and humans. Another interesting modification is trimethylation of a lysine residue in myosin, resulting in ATDTSFK(42.046)NK at m/z 1053.557, which is conserved at the tryptic peptide level in 12 different human myosin heavy chains in Swiss-Prot. As it happens, there is a second plausible conserved myosin peptide that can account for nearly this same mass (RHLEEEIK with m/z 1053.5694), which was not identified by MS/MS among the limited amount of MS/ MS spectra that we acquired. Thus, in this case, PMF mapped this peak to the right protein for the wrong reason. As it turns out, there are only 9 cases of ambiguous mass bin assignments that could match to two distinct terminal arginine containing peptides that were confirmed by MS/MS (Table S5). As a final informatic complication, in some muscle samples (perhaps adjacent to tendon), collagen may well be sufficiently abundant so that some hydroxyproline-containing peptides could explain unidentified masses.

从MS/MS数据中可以明显看出，TrEMBL鸡数据库中缺少一些关键蛋白，包括果糖二磷酸醛缩酶、糖原磷酸化酶和碳酸酐酶的某些亚型的完整版本，这些亚型在肌肉中非常丰富。这些蛋白质中有许多在脊椎动物物种中高度保守，因此MS/MS识别的肽段与人类和其他哺乳动物共享，因此在搜索脊椎动物数据库时被Mascot识别。除了这些已被充分研究的酶外，肌肉组织还表达一些非常大的蛋白质，如肌联蛋白(33423aa long)和星云蛋白(6669aa long)，它们可以解释许多信号。肌动蛋白、星云蛋白和其他丰富的蛋白，如原肌凝蛋白，也有广泛的差异剪接。TrEMBL鸡蛋白组不包括这些剪接变体的完整序列。根据早期的遗传资料，最初认为鸡肌球蛋白重链基因[23]多达31个，但骨骼肌肌球蛋白基因[13]可能不超过10个。从成年鸡快肌[12]中至少分离出5个不同的肌球蛋白重链基因。在这一点上，尚不清楚是否所有相关的肌凝蛋白亚型都忠实地在鸡的蛋白质组中。在编写这篇手稿时，可能已经对鸡的蛋白质组做了一些改进。GydF4y2Ba

在某些情况下，在PMF谱中突出的肿块在肽分离后似乎不突出。还需要进行更多的工作，以确定这种通信的缺乏是否会掩盖额外的信息限制。在至少4个质谱中发现了39个质谱，与MS/MS鉴定的任何肽在10ppm以内都不匹配。GydF4y2Ba

通过MS / MS在LC分离后检测来自丰富肌肉蛋白的少量来自肌肉蛋白（如肌动蛋白和肌菌素），但它们也不对应于未识别的峰值。这些质量中的大多数也未受任何按MS / MS鉴定所证实的任何蛋白质的PMF映射的。在一起，这些观察结果仍然存在许多峰可以在不可脱钙的胰蛋白酶消化中观察到尚未解释的峰。GydF4y2Ba

以上讨论解释了为什么PMF还不能从鸡肌肉的胰蛋白酶消化液中得到所有正确答案。尽管如此，可以重复测量的质量仍可用于分类，使用无偏性方法，如PCA分析。如上所述，许多可以识别的肿块很容易与区分肌纤维的通路相关联。GydF4y2Ba

这里收集的有限数据清楚地描述了鸡肌肉组织的三种不同类型。通过研究更多的样本，应该有可能确定有多少其他类别的肌肉可以区分。这些数据可以确定哪些肌凝蛋白重链在特定肌肉中表达，在特定肌肉的特定区域表达，或与动物的年龄相关，或在个体动物之间差异很大。在人类中，大多数骨骼肌包含慢收缩肌和快收缩肌的混合物。在许多疾病中，都有向慢缩肌的转变，肌球蛋白重链的表达也增加，多在出生前或出生后不久表达。也有专门的骨骼肌控制眼睛和吞咽的运动。在心肌组织和平滑肌中也有更多的肌球蛋白基因表达。为了在少量样本中详细描述RNA水平上的表达模式，已经做了大量的工作。由于它的简单性，这里描述的方法应该适合于表征大量的样品，并可以应用于许多不同的组织和有机体。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

PMF能够快速识别和提供多达十个丰富的蛋白质的半定量信息，从未分离的胰蛋白酶消化组织。有可能区分丰富蛋白质的同型，如肌凝蛋白是特定于不同的组织。因此，我们建议使用PMF对组织样本进行分类。GydF4y2Ba

参考文献GydF4y2Ba

1. Washburn MP, Ulaszek RR, Yates JR 3(2003)利用多维蛋白质鉴定技术对复杂生物混合物进行定量蛋白质组学分析的重现性。肛门化学75:5054-5061。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
2. 基于反应监测的蛋白质组学:工作流程、潜力、缺陷和未来发展方向。Nat方法9:555-566。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
3. cluser KR, Baker P, Burlingame AL(1999)精确质量测量(±10ppm)在使用MS或MS/MS和数据库搜索的蛋白质鉴定策略中的作用。肛门化学71:2871-2882。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
4. Perkins DN，Pappin DJ，Creasy DM，Cottrell JS（1999）使用质谱数据搜索序列数据库来识别概率的蛋白质识别。电泳20：3551-3567。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
5. 张伟，Chait BT(2000)基于质谱多肽图谱信息的蛋白质鉴定专家系统。肛门化学72:2482-2489。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
6. Henzel WJ, Watanabe C, Stults JT(2003)蛋白质鉴定:肽质量指纹图谱的起源。质谱14:931-942。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
7. Shadforth I, Crowther D, Bessant C(2005)在高通量、自动化管道中使用MS的蛋白质和肽识别算法。蛋白质组学5:4082 - 4095。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
8. (in chinese)基于特征匹配模式的多肽质量指纹识别支持向量机。分子细胞蛋白质组学10:M110.005785。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
9. Haas W，Faherty Bk，Gerber Sa，elias je，beausoleil sa等。（2006）霰弹枪蛋白质组学肽质量测量精度的优化与应用。Mol细胞蛋白质组学5：1326-1337。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
10. (1) MALDI-derived tryptic mass指纹图谱中含精氨酸的多肽的优势。肛门化学71:4160-4165。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
11. 肌球蛋白亚型、肌肉纤维类型和转变。Microsc Res Tech 50: 500-509。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
12. Rushbrook Ji，Huang J，Weiss C，Siconolfi-Baez L，Yao T T，等。（1997）蛋白质和mRNA水平的禽类快速肌肉肌苷厚链的表征。J Muscle Cell Motil 18：449-463。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
13. (2)鸟类肌球蛋白重链异质性的进化意义。Microsc Res Tech 50: 473-491。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
14. Reddish JM, Wick M, St-Pierre NR, Lilburn MS(2005)不同基因型鸡生长发育过程中肌球蛋白亚型转变的分析。畜牧与饲料科学84(4):429 - 434。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
15. Doherty MK，MCLean L，Hayter JR，Pratt Jm，Robertson DH，等。（2004）鸡骨骼肌的蛋白质组：层菌株生长过程中可溶性蛋白表达的变化。蛋白质组学4：2082-2093。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
16. Connolly BJ, Brannan RG, Decker EA(2002)过氧亚硝酸盐改变肌肉食物中肌红蛋白颜色的潜力。美国农业食品化学杂志50:522 -5223。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
17. Rathgeber BM，Pato Md，Bols Ja，Shans PJ（1999）Rapid Postmortem糖酵解和土耳其屠体的延迟冷却导致蛋白质萃取性和乳房肌肉蛋白的降解改变。JAgric Food Chem 47：2529-2536。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
18. Buza TJ, McCarthy FM, Burgess SC(2007)鸡基因组中预测蛋白的实验确认和功能注释。BMC Genomics 8: 425。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
19. Parker KC (2002) MALDI肽质量指纹图谱的评分方法:ChemScore和ChemApplex程序。J Am Soc质谱13:22 -39。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
20. Parker KC, Walsh RJ, Salajegheh M, Amato AA, krasins B，等(2009)使用散弹蛋白质组学对人类骨骼肌活检样本进行鉴定。蛋白质组学研究进展。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
21. Walsh RJ, Kong SW, Yao Y, Jallal B, Kiene PA, et al. (2007) I型干扰素诱导基因在血液中表达，反映了皮肌炎和多发性肌炎的疾病活动性。56: 3784-3792。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
22. 奥伦迪克(2010)骨骼肌糖酵解的蛋白质组学。生物物理学报1804:2089-2101。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba
23. Robbins J, Horan T, Gulick J, Kropp K(2010)鸡肌球蛋白重链家族。J Biol Chem 261: 6606-6612。[GydF4y2BaRef。GydF4y2Ba]GydF4y2Ba

在此下载临时PDFGydF4y2Ba

条信息GydF4y2Ba

文章类型:GydF4y2Ba研究文章GydF4y2Ba

引用:GydF4y2BaParker KC, Du J, Hattan SJ(2016)利用肽质量指纹技术鉴定鸡白肉和黑肉蛋白酶中肌球蛋白重链亚型的使用。J Biochem analysis Stud 2(1): doi http://dx.doi.org/10.16966/2576-5833.107GydF4y2Ba

版权:GydF4y2Ba©2016 Parker KC.这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可的条款下发布，该条款允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。GydF4y2Ba

出版历史：GydF4y2Ba

收到日期:GydF4y2Ba01 2016年6月GydF4y2Ba

接受日期:GydF4y2Ba2016年9月29日GydF4y2Ba

发表日期:GydF4y2Ba2016年10月04GydF4y2Ba