基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱成像(MSI)是研究动植物等生物体内蛋白质、脂质和化学物质分布的一项强大技术。MSI的主要优势在于它能够同时定位和识别亲本分子及其代谢物，而不需要标记，也不需要任何事先的知识。MSI已被广泛应用于检测不同疾病中不同器官的脂质分化模式，如阿尔茨海默病中的大脑和慢性肾病中的肾脏。然而，MSI用于脂类检测的主要障碍是由于离子抑制作用[1]，使其对某些类脂类的检测灵敏度较差。特别是当样品中出现真核生物细胞膜的主要成分磷脂酰胆碱(PCs)时，其季铵盐会强烈降低其他所有脂类在正离子模式MSI测量[2]下的离子产率。虽然这些离子抑制效应在负离子模式下通常不那么显著，但大量脂类在负离子模式MALDI测量中根本无法分析或仅显示出较低的电离效率[例如，PCs，二和三酰甘油(dag /TAGs)]。

为了解决这个问题，已经提出了几种解决方案。对于仪器方法，介绍了一种“MALDI-2”技术。定位激光束与膨胀的分析物-基质羽流[3]相交叉，引发二次maldi类电离过程。这是通过用脉冲紫外激光拦截氮气冷却气体环境中的粒子羽流来实现的。本技术可将几种膜脂的检测强度提高两个数量级，特别是对胆固醇、磷脂酰乙醇胺(PE)、浆原(PE- o)、磷脂酰丝氨酸(PS)、中性鞘糖脂(GSLs)，如半乳糖神经酰胺(GalCer)，因为它们通常难以用传统的MALDI-MSI[3]成像。这种修改的主要缺点是需要商用的复杂仪器。

从基质的方法来看，除了传统的基质，2,5-二羟基苯甲酸(DHB)，新的基质被开发来“揭示”某些脂类，如GSLs，在复杂混合物中[4-7]，大多数检测物种是钠和钾加合物。此外，还开发了几种新的基质溶液，以最大限度地检测[M-H] -神经节苷类物质，如2,6-二羟基苯乙酮[DHA]/硫酸铵3 mM用于提取神经节苷类物质，DHA/硫酸铵125 mM/七氟丁酸[HFBA] 0.05%用于溶解在50%乙醇[8]中的成像应用。

由于纳米材料的快速发展，纳米粒子与质谱分析的应用变得越来越流行。这种方法比传统的质谱法有几个优点

有机基质在许多方面，包括高吸收系数，优异的稳定性和生物相容性，易于制备和化学改性[9]。此外，由于化学噪声矩阵被最小化了[10]，质谱得以简化。由于纳米颗粒基质层稳定、重现性好、[11]均匀，可以获得高质量的几种脂类区域分布图像。

最初，带有氧化铁的纳米粒子被用来检测PC和GalCerin的正离子模式和硫化物的负离子模式的分布[12,13]。然而，纳米粒子对硫化物的检测效果却比DHB差。由于这个原因，几个小组试图开发一种新的基质系统与纳米颗粒的MSI分析，以获得更高的空间分辨率和灵敏度。核心金属主要是金、银及其混合物[14-16]。纳米银粒子(AgNPs)和纳米金粒子(AuNPs)已被证明可用于检测中性脂类(如:标签，胆固醇)，如[M+Au]。⁺或[M + Ag)⁺加合物[11,17,18]和神经节苷脂分布[19]。

以烷基胺修饰的金纳米颗粒(AuNPs)已被用于观察GSLs在生物组织切片中的分布。AuNPs已知能以高灵敏度电离GSLs[15,20]。AuNPs的应用使得磷脂酰肌醇(PI)、硫化物和神经节苷类物质(GM1、GM2、GM3、GD1和GD3)在负离子模式[18]中以高灵敏度检测。将AuNPs应用于鼠脑分析，实现了GSLs[18]小组分的理想可视化。另一方面，AgNPs在正离子模式[11]分析胆固醇、神经酰胺、dag和TAGs等中性脂质时也被证明是有效的。不幸的是，这些纳米颗粒基质在激光诱导解吸过程中也会比经典MALDI基质产生更高的热负荷，而且这种高负荷会导致更复杂的脂质(例如，标签)[21]的破碎。此外，这些额外的步骤也会导致生物分子的损失，特别是低丰富的脂类。

生化方法也已测试，以减少离子抑制的酶降解PCs。磷脂酶C (PLC)已被用于切割靠近磷酸基团的PLs，并消除带电头基，而不损害疏水膜锚(二酰基- pl前体的DAG分子)。Sparvero等人的[22]应用了组织上的PLC酶切和额外的化学物质来交联含羧基/氨基的分子，证明了MALDI-MSI在负离子模式下横向分辨率为50-200µm时检测线粒体心磷脂和脑神经节苷脂的改进[22,23]。然而，在这两项研究中，纯PLC处理后的脂质正离子模式MALDI-MSI分析均未见报道。

Vens-Cappell等人最近证明了一种纯PLC处理的正离子模式MALDI-MSI脂质分析。他们对16 μ m厚的新鲜冷冻小鼠大脑和肾脏切片进行了组织上PLC消化，以获得GSLs的高对比度MALDI-(质谱)MS图像。PLC简单用水稀释，调整至酶活性为50 U/mL。取40µL PLC溶液于37℃下染色30min。通过去除大块液体和风干来停止反应。经升华/再结晶程序包覆DHB基体后，平均晶粒尺寸约为2 ~ 3µm[3]。MALDI-MS成像采用改良的Synapt G2-S质谱(Waters, Manchester, UK)，使用有效焦斑直径约为5µm[3]。每个像素用30个激光脉冲照射。

通过比较两个相邻的冠状脑切片，其中一个是经lc处理的，MS图像和相应的质谱显示GalCer的离子丰度升高(d18:1/ C24:1)，其他9个检测到GalCerlipoforms的因子约为10[24]。在MS测量后，对经plc处理的切片进行免疫组化染色，进一步证实了GalCer的总体分布。此外，PLC治疗还显示了胆固醇信号的增加，强度约为5倍。这是因为磷脂(PL)的降解将揭开与丰富的pc相比，显示近等压质量的离子种类。例如，[GalCer (d18:1/C24:1)+Na]⁺在m/z 832.66处的离子信号常常被[PC (38:4)+Na]更强烈的信号所掩盖⁺，显示出约80 mDa的低质量。

其中的一个挑战是GalCer，胆固醇，或残分子PLs的扩散是否发生明显后与水酶溶液孵育切片。幸运的是，没有观察到这种扩散，这表明细胞质膜的整体结构完整性仍被广泛保存[24]。

由于在PLC处理期间产生DAG片段和切割亲水性头部，作者还检查了是否检测到这些碎片并干扰最终图像。结果表明，在具有相对低信号强度的组织中可检测到这些片段[24]。相反，在整个组织切片上发现裂解的亲水头基团和整个组织切片的涂层分布。

通常，PLC解决方案通常使用HEPES缓冲液进行缓冲，以获得pH约为7的最佳pH。我们也知道，这些缓冲液强烈干扰分析物/基质结晶，以降低离子产量。因此，这种缓冲的PLC解决方案将大大降低MALDI-MS分析的灵敏度。为了绕过这种情况，本研究将PLC简单地稀释在水中，而不是缓冲[24]。一项使用小鼠脑切片的时间进程研究表明，在37℃下30分钟PLC孵卵足以使pc完全降解，并同时使GSL离子信号最大化。这表明组织切片似乎保留了足够的内源性盐含量，以确保在水溶液和缓冲溶液[24]中具有相同的PLC活性。然而，长时间的孵育，如过夜孵育16小时，会导致其他浓度较低的PLs离子的信号降低。这可能是由于长时间孵育期间PLC的降解。

另一个有用的发现是即使通过标准MALDI-MSI（例如，以首先记录PC型材预先分析）组织部分已经“预先分析”的组织部分，也是GSL的信号增强的演示。作者简单地通过用水和0.1米乙酸钠冲洗，然后涂布PLC和第二DHB基质涂层[24]，恰好将基质涂层从滑块中取出。然后他们在同一幻灯片上执行第二个扫描。结果表明，仍然观察到GSL的信号增强。这些结果表明这种顺序方法的可能性，尽管观察到横向分辨率的略微降低至约20-30μm。这种现象可能是由于通过基质升华和重结晶和基质洗涤步骤从组织中提取的反复分析物。

总之，通过降低离子抑制效应，已经证明了该组织PLC消化以成功增强中性GSL的MALDI-MSI。该方法优于本方法，因为在没有对MALDI-MS或矩阵上的任何复杂修改的情况下都很容易实现。这种方法将有利于未来对人类疾病GSL的分析。

利益冲突陈述书

作者宣称没有相互竞争的利益。

确认

国家自然科学基金面上项目(no . 81170681; no . 21477101);香港研究资助局(研资局拨款基金463612及14104314);香港浸会大学学院研究资助(FRG1/13-14/070, FRG2/15-16/067);香港卫生及医学研究基金(HMRF/ 03144376);2015-16年度HKASO研究资助。

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文章类型:意见文章

引用:Chung AC（2016）迷你评论：对鞘脂的MALDI-MS成像的增强。J Biochem Analyt Stud 2（1）：DOI http://dx.doi.org/10.16966/2576-5833.105

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出版历史：

收到日期:07年6月2016年

接受日期:2016年8月27日

发表日期:2016年9月01日