荧光显微镜已经广泛应用于生物样品的传感和成像，包括细胞成像、生物分子实时监测和生物标志物检测。常用的光学显微镜技术有共聚焦、外延荧光、多光子、全内反射荧光显微镜(TIRFM)。在所有的荧光成像技术中，TIRFM，也被称为倏逝场显微镜，由于其独特的特性而受到了广泛的关注。TIRFM被认为是一种强大的技术，它支持已和体外在单分子和单细胞水平上监测生物分子的动态和动力学相互作用。

TIRFM的配置和属性

当激发光束通过密度高的介质(高折射率)时，遇到入射角大于临界角(θ)的另一密度低的介质(低折射率)时，发生全内反射_c)．临界角由斯涅尔定律导出:θ_c= sin-1 (n₂/ n₁),其中n₂和n₁分别为密度大的介质和密度小的介质的折射率。一定数量的入射光在界面处被反射，而不是通过密度较小的介质传播，这种现象称为全内反射。与此同时，一些入射能量将通过界面传输，并产生一个固定的电磁场，称为倏逝场。与其他形式的光不同，倏逝光的强度在亚波长距离上呈指数衰减。倏逝场的强度(I_z)的任意位置(z)均可由Iz =I计算得到₀经验值^{- z / d},在那里我₀为z=0处的强度，d为可由d=λ / (4π (n₁²sin-1θ- n₂²）^1／2， λ是真空中激发光束的波长。光束穿透深度一般为~100-300 nm。在棱镜型TIRFM中，穿透深度可以由三个因素控制:(i)激发源的波长，光源的波长越长，倏逝场越深。(ii)光源的入射角、穿透深度随入射角的增大而减小。最后，密度较小的介质的折射率，随着密度较小的介质折射率的增大，穿透深度也增大。

在TIRFM中，由于消光场的强度呈指数衰减，离界面较近的荧光团比离界面较远的荧光团被激发得更强烈，从而得到了界面附近荧光团的高对比度图像。此外，由于倏逝场的穿透深度很浅，只有场内的荧光团被激发，而本体溶液中的其余荧光团则保持“沉默”。它具有较高的信噪比，减少了被分析物的光损伤。

图1:TIRFM设置原理图。

单个生物分子和细胞的实时监测

报告已经演示了TIRFM的能力体外例如，疾病相关生物标志物的量化，用于定量细胞裂解液和人血清样本中的microrna (mirna)和循环mirna的单分子检测方法。发达的检测具有高度敏感性，特异性，并能先后区分不同癌症阶段[1,2]。研究者还应用TIRFM成像系统监测β -淀粉样肽的聚集动力学[3-10]。Simon小组报告了利用TIRFM作为一种成像方法来揭示以前未观察到的单个病毒粒子的起源。他们还能够探索其他传统技术无法获得的病毒组装的不同参数[11]。Nosrati等人的[12]监测了精子运动，众所周知，精子运动在受精过程中起着至关重要的作用，并能够解决这种运动的性质。利用TIRFM，他们选择性地成像活动的人类和公牛精子，揭示了二维(2D)“滑行”游泳模式。这种行为被发现与散装和近壁游泳模式不同。研究了介质粘度的影响，提出了一种适合于高粘度、狭窄的输卵管[12]管腔的精子培养策略。在宽场模式下对单分子或单细胞进行实时监测和跟踪是高通量研究的热点。 Coupling several lasers of different excitation wavelengths which can be switched in microseconds precisely with an acousto-optical tunable filter (AOTF) allows sophisticated multicolor biomolecular imaging and tracking [13]..1

TIRFM不再局限于2D成像;Fang小组通过收集不同入射角度下的荧光强度，证明了荧光纳米粒子靠近细胞基底侧膜的z位置可以被提取出来。当入射角减小到亚临界范围时，TIRFM作为伪TIRFM工作，可以从底部到顶部监测整个细胞。由此建立了三维跟踪策略[13]。

简而言之，高灵敏度的单分子和单细胞荧光显微镜技术，如TIRFM，是应对临床和科学挑战的强大工具。然而，新的高空间分辨率显微镜技术是有价值的工具，以评估那些感兴趣的生物分子在复杂的细胞环境中的功能。

参考文献

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引用:何林生，李文辉，王ms .(2016)全内反射荧光显微镜观察分子相互作用。J Biochem Analyt Stud 1(1): doi http://dx.doi.org/10.16966/2576-5833.102

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出版的历史:

收到日期:2015年12月21日

接受日期:2016年2月16日

发表日期:2016年2月20日