摘要

尽管短期结果有所改善，但肾移植受者的长期结果仍不理想。免疫排斥是导致移植物衰竭的主要原因，最近的研究指出，未被发现的“沉默的”亚临床急性排斥是这一问题的关键组成部分。虽然活组织检查仍然是检测隐性排斥反应的金标准方法，但非侵入性方法提供了显著的优势，特别是在患者安全性和稳定患者的连续监测方面。该手稿详细描述了TruGraf的最终成功开发和商业化过程中涉及的现实生活挑战。TruGraf是一种经临床验证的基于血液的基因表达分析方法，有可能减少在肾功能稳定的肾移植受者中使用监测(方案)活检。

关键字

非侵入性移植生物标志物;TruGraf;肾移植;活组织检查;肾功能

介绍

肾移植是大多数慢性肾功能衰竭患者的最佳治疗方法。然而，肾脏移植的长期成功远非最佳[2]。2017年，死亡供肾受者的10年全因移植物衰竭发生率为49.7%，活供肾受者的10年全因移植物衰竭发生率为34.1%。免疫排斥是移植物衰竭的主要原因，由T细胞(T细胞介导排斥，或TCMR)或抗体(抗体介导排斥，或ABMR)攻击移植物驱动，或在某些情况下这两种机制的结合(混合排斥)。亚临床免疫损伤是移植物长期丢失的一个重要早期因素，它可导致移植物肾的慢性损伤[4-8]。直到最近，还没有商业上可用的完全有效的无创检测方法来监测肾功能稳定的患者是否存在沉默性排斥反应[9]。因此，相当多的中心依赖于监测(方案)活检来检测早期的无声排斥反应，而其他选择不进行这些检查的中心则等待移植物损伤和损害的临床证据[10,11]。

情景分析

检测排斥反应或其他原因引起的肾损伤的标准无创监测包括测量血清肌酐水平和免疫抑制药物水平，两者都是不敏感和非特异性的。可能存在严重排斥反应的临床表现，如发热、移植物疼痛或尿量减少，但目前的免疫抑制方案很少发现排斥反应。因此，目前的非侵入性监测仅在排斥反应进展时检测排斥反应，并且仅在移植物发生重大且可能不可逆的损伤后检测排斥反应。通常进行适应症或因故活组织检查以确定急性肾功能不全的原因。

活检是昂贵的，有创的，并且在解释[12]方面存在显著的变异性。此外，活组织检查除了疼痛和不方便[13]外，还会使患者面临严重并发症的风险，如感染、出血，甚至移植物丢失。然而，适应症活检在肾功能不全患者的治疗中仍然是必不可少的，并且在移植程序中广泛使用。与此形成鲜明对比的是，尽管许多移植项目已经采用了常规的监测活组织检查来检测肾功能稳定的患者的亚临床急性排斥反应(subAR)，但一些因素阻碍了其他项目的效仿。这些包括但不限于上述所有问题，但是，除此之外，稳定的患者在绝大多数情况下会不加选择地接受活组织检查，导致阴性(不必要的)侵入性手术。因此，一种替代侵入性活检方案的非侵入性监测策略是非常必要的，并且在过去的几年里一直是一些研究者关注的焦点。

以前的研究人员专注于开发尿液和血液中的非侵入性生物标记物，以诊断移植功能障碍患者的排斥反应（临床急性排斥反应cAR）试图取代适应症活检。这种方法有两个主要谬误：第一，当一些亚型患者出现cAR时，其他患者表现出持续亚型，导致更多的慢性移植物损伤；第二，在没有对每个样本进行配对活检的情况下，很难确定生物信息学方法是否能产生阳性的cARve这些样本的结果是真实的。因此，我们着手开发一种针对亚急性肾衰竭的生物标记物，只使用血液样本与肾功能稳定患者的方案活检相结合。

经验证的亚急性呼吸窘迫综合征外周血生物标志物的研制

鉴定稳定患者中活组织检查的无侵入性替代的需要，我们开始发现并验证外周血生物标志物，以检测这些患者的子节，作为“规则”测试，类似于活组织检查。虽然我们的临床试验和样品收集方案被精心设计，但是，证据数据和生物标志物性能使我们导致我们重新思考生物标志物的使用范围（Cou）。

亚临床急性排斥反应（subAR），也称为“无症状”排斥反应，是一种组织学上定义的急性排斥反应，其特征是肾功能正常或稳定的患者活检标本中发现的肾小管间质单核细胞浸润[4-8].在NIH赞助的CTOT-08对307名肾移植受者的研究[7]中，根据监测活检，在3-6个月时的自然发病率为20%，在12个月和24个月时的发病率为25%，总体发病率为35%[7].值得注意的是，当使用Banff标准对中枢病理学进行分类时，80%的亚组处于临界状态[14]，重要的是，75%的病例的活检是正常的。在两年的时间点，亚组患者在监测活检中的预后比未进行监测活检的患者差。这是基于一个综合临床终点（CCE）包括通过central read对任何“原因性活检”进行的活检证实的急性排斥反应（BPAR），或24个月的活检（central read），显示Banff级间质纤维化和肾小管萎缩（IFTA）测量的慢性损伤证据≥ 二、国际旅游业联合会（ci）≥ 2或ct≥ 2） 或估计肾小球滤过率（GFR）降低>10mL/min/1.73m²移植后4至24个月[7]。SubAR也与I类和II类新发供体特异性抗体（dnDSA）发生率较高相关[7,15]。

除了上面显示的CTOT-08数据外，许多临床研究还具有较差的外延，结果差[4-8,15-19]。具有快速类固醇戒断方案的受访者的研究与3个月监视活检的患者没有炎症和亚临床炎症的患者的结果。在亚临床炎症的患者中，血清肌酐水平在24个月内显着高，同种异体移植慢性指数在活检中，随后的BPAR和DNDSA发育的速率在12个月内显着增加[16]。一个大型澳大利亚研究与正常活组织检查患者的比较结果，那些具有临界抑制的人和T细胞介导的急性排斥反应。与患有正常活组织检查患者相比，临界抑制患者肾功能较差，更多的IFTA，随后的急性排斥，同种异体移植失败和患者死亡率[7]。最近在103例儿科肾移植受者中研究，检测亚临床炎症表型和长期成果在儿科肾移植后，突出了子石的重要性和治疗方法[18]。在本研究中，在前6个月内进行监测活组织检查，并在5年内测量急性排斥反应和移植物衰竭的复合终点（CEP）。对于未处理（P <0.001）[18]，对治疗的边缘排斥达67％的治疗边缘排斥达41％达到41％。此外，最近的另一个出版物表明，边界早期急性排斥与晚期急性排斥和移植物损失的发展有关[19]。

a）开发和b）商业化一种用于亚急性呼吸窘迫综合征的非侵入性生物标志物的试验和困难

发展:TruGraf®血液基因表达测试(Transplant Genomics, Inc, Mansfield, MA)是一种基于微阵列的分析外周血基因表达谱(GEP)的方法。我们最初的策略是开发一种“规则”测试，即阳性测试将高度预测阳性活检(subAR)。我们使用了一个基于自举的锁定支持向量机(SVM)分类器，以防止内部验证的发现集过拟合，如生物信息学方法[20]。我们发现了两个有趣的观察结果:首先，在不同的阈值下，我们将PPV与NPV交换到“规则引入”测试不可能使用这种方法的程度。我们随后改用随机森林(RF)作为生物信息学方法[21]，并使用了不同的阈值，但很明显，生物标志物的预期用途将需要改变。因为使用RF的性能指标更好，所以我们继续使用RF，但为“排除”测试[21]选择了更有利的阈值。该产品是一种GEP分类器，在肾功能稳定的患者中与正常的肾活检(Transplant eXcellence-TX)或不正常的肾活检(non - tx)相关。TruGraf试验的所有发现和外部验证都是在与流行队列活检配对的血液样本上进行的。为验证目的，由预先选定的生物信息学派生的模型和用于测试发现队列性能的阈值被锁定。这些数据促使我们在[22]患者的早期进入计划(EAP)中使用这种方法进行外部验证。 The external clinical validation from seven EAP transplant centers defined the key clinical performance parameters for this assay, as summarized in table 1 and figure 1. In this study, the high negative predictive value (NPV) of TruGraf was demonstrated in clinical use, making it a strong rule-out test. Over 90% of stable patients who received a TX results were confirmed to have an immune quiescent phenotype, meaning that a physician can have a high degree of confidence that a patient who tests as TX does not harbour silent subclinical rejection. Importantly this study also found that up to 65% of surveillance biopsies could be avoided in the cohort tested. Unpublished data involving analysis of an additional 129 biopsy-confirmed blood samples provided by Northwestern University (originally used for the CTOT-08 study) revealed identical performance metrics for TruGraf (NPV of 90%). A fourth publication described the impact of TruGraf results on physician decision making for clinical decisions [23]. This study highlighted the high degree of confidence physicians place in the ability of TruGraf to provide valuable, added information that could lead to avoidance of unnecessary surveillance biopsies as summarized in table 2. In the prospective study (n=45) 87.0% of physician responses indicated that the result of the TruGraf test supported their management decision in a patient with stable renal function, with a corresponding rate in the retrospective study (n=192) of 87.5% [23].

图1:TruGraf结果的单个位点准确性(n=192)显示了TruGraf TX结果与7个研究位点[22]的患者临床表型之间的一致性。

						调整为24.5％的子石普遍存在		% TX(活检幸免)
	N	体贴	特异性	PPV	净现值	PPV	净现值
所有样品	192	76.5%	73.4%	38％	93.5%	４８％	91％	65%
配对血液和活检亚群	99	70.8%	74.7%	47％	89%	４８％	89%	64%

表1：多中心观察性研究[22]中TruGraf v1的表现特征总结。
净现值=负面预测值;
PPV =阳性预测值。

问卷调查的时机	临床实用程序的反馈	是的	不
前瞻性（n = 45）	TruGraf结果是否支持您关于如何管理血清肌酐稳定患者的决定？	39 (87%)	6(13%)
	TruGraf结果是否鼓励您在未来的患者管理中使用TruGraf系列测试？	42(93%)	3 (7%)
回顾性（n=192）	如果在维持或改变免疫抑制，改变临床访问频率，或决定是否进行活检，此结果是否会对您的患者的管理产生任何影响。	168例(87.5%)	24（12.5％）

表2：主要研究者对前瞻性和回顾性问卷的回答[22]。

由于这些经验，我们改变了建议的COU，从取代检测亚ar的监测活检，改为减少稳定患者必要活检的数量，这将导致许多侵袭性更小的程序(表1)，以及显著减少阴性或不必要的活检。COU在CMS最近的批准中提出，“TruGraf试验用于肾功能稳定的肾移植受者，作为使用活检监测设施的活检监测的替代方案”。虽然主要用于排除亚ar，但预计实施或不实施监测活组织检查的两家中心都可以使用该测试来评估对稳定患者[24]进行监测活组织检查的必要性。

图2说明了将TruGraf应用于肾移植受者临床护理的拟议方法。对于肾功能稳定的患者，TruGraf结果为“TX”确定在临界水平或更高水平上免疫静止可能性高、组织学定义排斥反应可能性低的患者。结果为“非TX”确定那些不能自信地排除沉默排斥的患者，因此具有较高的免疫激活风险和临界或更高的排斥风险。非TX患者这一结果可能得益于进一步的评估和可能的治疗改变。对这些患者的早期识别可能有助于更好地分配医生资源，并可能在捐赠肾脏发生永久性损伤之前逆转这一过程。

图2:建议在移植后的前5年中使用Trugraf用于肾移植受者。测试频率和结果的临床使用是基于专家意见。TX =卓越的卓越，表明移植肾脏中的免疫静脉;nottx =异常结果。

TruGraf的商业化途径:分子诊断服务（MolDX）计划于2011年开发，由医疗保险和医疗补助服务中心（CMS）医疗保险管理承包商Palmetto GBA运营。该计划执行以下功能：

• 通过分子诊断测试的注册促进详细和独特的识别，以促进索赔处理和跟踪利用率。
• 建立临床效用预期。完成已发布测试数据的技术评估，以确定临床效用和覆盖率。

CMS于2019年11月25日批准了商业Trugraf测试的报销。

最近发表的一项研究评估了系列TruGraf试验在一个不使用监测活检[25]的中心的稳定肾移植受者中的临床有效性。28例患者多个时间点的血清肌酐水平和TruGraf检测与临床随访相关。与独立临床评估试验相比，TruGraf结果的一致性为77% (54/70);试验1为79%(22/28)，试验2为75%(21/28)，试验3为79%(11/14)。本研究的NPV为98.0%，临床效用分析表明，77%的TruGraf结果有助于患者管理。这些结果表明，在那些没有将监测活组织检查作为其护理标准的一部分的移植中心，系列TruGraf检测的价值。高NPV证实了TX的TruGraf测试结果的患者免疫静默的高概率，而无需进行活检。

结论

对于肾移植受者来说，无声的亚临床排斥反应是经常发生的，并且是更糟糕的长期预后的重要因素。到目前为止，subAR只能通过侵入性的和有风险的每一方案监测活检来排除，这导致大量不必要的活检，因此对患者的安全造成不必要的风险。因此，显然需要进行非侵入性检查来识别移植肾中存在亚ar的肾功能稳定的患者。为了回应这一需求，我们首先着手开发一种“规则”测试，以取代常规的活检方案作为使用背景。然而，基于我们的生物标志物的证据性能数据，我们确定它最好用作“排除”测试，然后修改了提议的COU，以减少目前使用这些指标的方案活检的很大比例;在那些没有这样做的患者中，让更少的患者接受活组织检查的风险，同时减少不必要的(阴性)活组织检查的数量，可能会提供一个有吸引力的监测策略[24]。为了达到这些目的，TruGraf是第一个也是唯一一个设计和验证的无创试验，用于排除在肾功能稳定的肾移植受者中的隐性亚临床排斥反应。

非侵入性血液检测可以比监测肾脏活组织检查更频繁地进行，对患者而言，侵入性明显更小，疼痛和风险更小，并可能为医疗服务系统节省相当大的成本。

的利益冲突

MRF, SBK和SR是Eurofins-Transplant Genomics的全职员工，他们开发了本手稿中描述的TruGraf测试。JJF和MMA是Eurofins-Transplant Genomics的顾问。

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文章信息

物品类型：评论文章

引用：第一位先生，Kleiboeker SB，Rose S，Friedewald JJ，Abecassis MM（2020）开发和商业化TruGraf这一经验证的非侵入性移植生物标记物的真实生活经验。J Biochem Analyt Stud 4（2）：dx.doi.org/10.16966/2576-5833.123

版权：©2020 First MR等。这是一篇根据知识共享署名许可证条款发行的开放获取文章，允许在任何媒体中不受限制地使用、发行和复制，前提是原始作者和来源均已获得授权。

出版的历史:

收到日期：20日4月24日

接受日期：2020年5月11日

出版日期：2020年5月18日