摘要

目的:胶质母细胞瘤(GBM)是最常见的脑肿瘤，预后普遍较差。通过个性化的治疗计划，在易于获取的血清样本中开发预后生物标志物有可能改善GBM患者的预后。

材料/方法:在本研究中，使用40蛋白复合酶联免疫分析平台评估了30例新诊断的GBM患者治疗前的血清样本。利用恶性胶质瘤生物发现门户(GBM-BioDP)，利用癌症基因组图谱数据库对潜在相关基因靶标进行分析。通过对40个复合基因进行功能分组分析，在方差程度、与其他生物标志物缺乏共线性和临床兴趣的基础上从每组中选择两个基因，选择一个10个临床相关分子的生物标志物亚组。采用多变量Cox比例风险法分析总生存期(OS)、基因表达和切除状态作为协变量的关系。

结果:40个MSD分子中有30个映射到TCGA内的已知基因，并将患者群体划分为两个主要簇，主要围绕Verhaak分类的经典和神经和间充质亚型。使用预后指数(PI)中的30个蛋白的值表明，整个队列中PI低于中位数的患者比PI高于中位数的患者活得更长(HR 1.8, p=0.001)，即使按年龄和MGMT状态进行分层。这一发现在每个Verhaak亚类中也是一致的，并且具有高度显著性(范围p=0.0001-0.011)。

另外，发现包括CRP，SAA，VCAM1，VEGF，MDC，TNFA，IL7，IL8，IL10，IL16的十个蛋白质的子集在TCGA数据库中具有预后值，以及与GBM患者的总生存率存在正相关性收到粗肿瘤切除术，随后通过添加丙戊酸的加入常规放射治疗和替替唑粒处理。

结论:这些发现表明，利用蛋白质组学方法进行GBM治疗的预后分析可能具有潜在的临床价值。

介绍

胶质母细胞瘤(GBM)是在美国成人中发现的最常见的原发性脑肿瘤。目前的治疗标准包括手术切除、放射治疗(RT)和替莫唑胺(TMZ)的同时疗程，随后辅助TMZ治疗，中位生存期为14.6个月[1]。然而，即使预后极差，仍有一小部分患者活5年(10-15%)[2]。因此，已经开始尝试开发具有预后价值的筛查工具，以鉴别那些预后较好的患者。GBM肿瘤的分子亚型如癌症基因组图谱(TCGA)已经确定了GBM的四种主要亚型;前神经，神经，古典和间充质，四亚组之间的生存差异相似[3]。基因组/表观遗传分析已确定o6 -烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶(MGMT)启动子甲基化状态是一个预后和预测因素，对定制GBM治疗方案[4]有用。尽管MGMT状态可能是胶质母细胞瘤患者医疗管理中最被接受的生物标志物，但其他几个分子标志物，包括表皮生长因子受体(EGFR)和异柠檬酸脱氢酶(IDH)的突变可能有预后价值[5]。此外，在GBM肿瘤[6]患者中，血小板衍生生长因子受体A (PDGFRA)、肿瘤蛋白p53 (TP53)和循环肿瘤细胞(CTC)也被鉴定为与基因表达和患者预后相关的生物标志物。然而，这些潜在生物标志物的检测缺乏标准化，限制了它们的应用。

尽管这些生物标记物可能很有前途，但它们需要从手术切除的原发肿瘤组织中获取来进行分析。由于手术切除是大多数GBM患者的标准治疗方法，因此应该能够获得组织标本，但标本数量的限制以及组织采集和处理的标准化仍然是主要障碍。此外，手术切除本身仍然是影响总生存率的一个重要的临床变量，因为在切除范围和总生存率和无进展生存率之间已经显示出正相关，支持了总全切除比次全切除或活检[7]的临床益处。由于肿瘤组织有时难以获得或数量有限，因此有必要从非肿瘤组织中开发生物标志物。

尽管尚未将经验证的GBM循环生物标志物整合到临床实践中，但由于可获得性、采集连续样本的能力和较低的成本，使用循环生物标志物管理GBM仍然是一种有吸引力的方法。在血液、尿液和脑脊液中发现了新出现的GBM循环生物标志物。这些包括鉴定循环肿瘤细胞，游离循环肿瘤DNA和miRNA，以及含有肿瘤衍生核酸[8]的细胞外囊泡。GBM的蛋白质组学生物标志物研究也证明了蛋白标记对患者的初步预后有价值。利用质谱技术比较GBM患者血浆中的蛋白质组学特征表明，血浆中富含亮氨酸的α -2-糖蛋白1 (LRG1)、c反应蛋白(CRP)和补体成分9 (C9)的蛋白浓度与肿瘤大小[9]和CD44的细胞表面膜蛋白特征相关。血浆中分泌的血管细胞黏附分子1 (VCAM1)、血红素加氧酶1 (HMOX1)和转化生长因子、β诱导的(BIGH3)能够区分GBM患者与健康对照[10]。此外，使用非肿瘤特异性蛋白作为GBM的生物标志物，包括基质相关蛋白，如YKL-40，基质金属蛋白酶，如基质金属蛋白酶2 (MMP2)和基质金属蛋白酶(MMP9)，急性期蛋白，如触珠蛋白，细胞谱系等中枢神经系统相关的特定蛋白胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和S100钙结合蛋白B (S100B)和其他许多细胞因子和生长因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、碱性纤维母细胞生长因子(FGF2)和转化生长因子β1 (TGFB1)(8、11)。在这项研究中，我们对GBM患者明确放化疗前收集的样本进行了多重细胞因子检测，并与总生存期和无进展生存期进行了比较。

方法和材料

协议信息

如前所述，在全国癌症研究所和弗吉尼亚英联邦大学进行了一项开放标签，阶段II研究（NCI06-C-0112），在组织学证实的GBM患者中，年龄18岁或以上，预期寿命超过8周，手术入学前不超过6周[12]。该议定书被NCI机构审查委员会审查并批准，所有患者签署了书面知情同意书。在疗法开始之前从每位患者收集本研究中使用的样品。然后用每日丙戊酸/辐射/替替唑胺治疗患者6周。通过RANO标准进行固体肿瘤（再次回复）的响应评估标准对治疗响应进行分析[13,14]。从对症状或放射线摄入的议定书的治疗开始确定进展的时间。总生存（OS）是根据对死亡日期的协议的启动确定。

多路生物标志物检测

患者血清使用市售的中尺度诊断V-plex酶联免疫吸附试验(messcale Diagnostics V-plex ELISA)筛选蛋白生物标志物。该40组检测包括促炎1组(K15049D)、血管损伤2组(K15198D)、血管生成1组(K15190D)、细胞因子1组(K15050D)、趋化因子1组(K15047D)。本研究包括30例患者治疗前的血清样本。这些测定是按照制造商的说明书进行的。

统计方法

使用癌症基因组图谱数据库和胶质母细胞瘤生物发现门户(GBM-BioDP)对潜在的生物标记物进行分析，这是一个免费的网络资源，托管胶质母细胞瘤TCGA数据的子集，并支持详细查询和结果数据[15]的交互显示。多重分析的结果被输出到R统计编程语言用于进一步分析[16]。首先将数据归一化为z-scores，将数据的均值调整为0，标准偏差调整为1。特征强度的相对关联通过使用皮尔逊相关法的成对相关进行评估。使用BioDP软件生成热图分析，用于可视化相关矩阵，以及Kaplan-Meier图，用于比较预后指数和总生存期。

为了寻找属性间可能存在的多重共线性，采用皮尔逊相关法建立了一对相关矩阵。数据以相关图的形式显示，正相关和负相关分别用蓝色和红色表示。数据点(圈)的强度和大小与相关系数成正比。当p≤0.05时，相关系数称为显著性，图中仅显示显著值。

根据炎症、血管生成、免疫细胞、趋化性或急性期反应特征，对40个基因进行功能分组分析，筛选出10个临床相关分子的生物标志物亚组。根据内部变异程度、与其他生物标志物缺乏共线性以及临床兴趣，从每个功能组中选择两个基因。使用Excel中的VARPA语法计算方差。

采用多变量Cox比例风险法分析总生存期(OS)、基因表达和切除状态作为协变量的关系。通过Cox模型[17]的回归系数加权平均每个基因的表达来计算多基因的预后指数。简单地说，预后指数(PI)，也称为风险评分，通常用于生成危险组。PI被称为Cox模型的线性分量，PI= β 1 × 1+ β 2 × 2+…+ β pxp其中xi是表达式值，β I可以通过Cox拟合得到。每个β I可以解释为一个风险系数。装配是在使用“生存”包时进行的。风险组通过中值(风险越大，值越高)的有序PI进行二分，每组中保留相同数量的样本。对得到的两组进行Kaplan-Meier曲线处理，表达值按R的中位数进行二分。

结果

此前，Nijaguno等人表明，18种细胞因子的血清特征可以区分GBM患者和正常健康志愿者[18]。为了进一步证实这一点，我们使用了Mesoscale Diagnostics 40 plex ELISA试剂盒，包括一组趋化因子、细胞因子、血管生成、血管损伤和促炎标志物，以确定细胞因子标记是否可以区分GBM[19]患者的短期和长期幸存者。BioDP程序用于探索癌症基因组图谱(TCGA)数据库，以确定这些生物标志物是否通常存在于GBM[15]患者的样本中。

如在MSD生物标志物的40个（图1A）中的分层簇（HC）中所示，映射到TCGA内的已知基因并将30名患者分成两个主要簇。左簇（红条）具有较高数量的样品，分类为古典和散装，右侧簇（蓝杆）具有更多分类为间充质的样品，并且神经亚类分布在整个[3]中分布。这些30生物标志物的值用于产生与使用Kaplan-Meier分析的总体存活率进行比较的预后指数（PI）。在左侧（图1b）中的左侧（图1b）患者在整个群组中，中位数低于中位数的患者比中位数高于中位数（HR 1.8，P = 0.001），即使在年龄和MGMT状态分层。同样，在中位数低于中位数的PI患者对于每个Verhaak亚类的较长，这在高度统计学上（范围P = 0.0001-0.011）。该发现的含义是细胞因子生物标志物可以用作诊断为GBM的患者的患者存活的预后标志物。纳入第2期研究（NCI-06-C-0112）的ThirtySeveven患者接受VPA / RT / TMZ处理的患者具有足够量的储存样品，并用于验证预后指数。这些患者的临床人口统计学显示在表1中。大多数患者是男性，总切除总是总切除和Karnofsky性能评分> 90。从每位患者收集的样品的细胞因子水平在处理处理之前，使用MSD测定法处理来自四个生物标志物的代表值如图2所示。来自整个40-Plex生物标志物面板的数据包括在补充表1中。在这种VEGF相关的组中，任何一个分子都没有显着的发现。重要的是，样品按应计的顺序绘制，我们表明-20°C储存的时间不会引入我们的生物标志物的降解，因为早期和后期收集具有相似的价值范围。 These data suggest that the biomarkers are stable over time at -20°C and that no individual protein can be used as a predicative biomarker.

	特征	n	％
年龄(y)	54.3(范围:31.8 - -71.5)
性	男性	22	73
	女	8.	27
战	3.	11.	37
	4.	12.	40
	5.	2	7.
	未知的/失踪	5.	17.
切除	GTR	16.	53
	str.	13.	43
	活组织检查	1	3.
KPS	中位数	90
	范围	80 - 100
瘤位置	额叶	10.
	颞叶	8.
	顶叶	7.
	枕叶	1
	额颞叶	1
	Frontoparietal	0.
	颞顶	0.
	Parieto-occipital	3.
	Temporo-occipital	0.

表1:临床研究前处理特点。
纳入研究队列患者的临床特征，RPA=递归分割分析，GTR=总全切除，STR=次全切除，KPS=Karnofsky性能评分。

尽管我们在图1中显示30 plex的数据可以预测总生存期，但使用40 plex作为单个患者的护理点分析将成本高昂。为了减少生物标志物的数量，我们评估了靶标之间的共线性，并从进一步的分析中排除了具有高共线性的生物标志物。相关变量如图3所示。正相关用蓝色表示，负相关用红色表示。颜色强度和圆的大小与相关系数成正比。p值(p>0.05)为无显著性，空细胞代表无显著性对。为了进一步减少靶点的数量，我们将剩余的分子按功能分类进行组织，包括炎症、血管生成、免疫细胞、趋化性和急性期反应。从每个类别中选择两个内部方差高的生物标志物进行进一步的多变量分析，包括:白细胞介素7 (IL7)、肿瘤坏死因子α (TNFA)、血管细胞粘附蛋白1 (VCAM1)、血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素10 (IL10)、白细胞介素前-16 (IL16)、白细胞介素8 (IL8)、c- c motif趋化因子22 (MDC)、c-反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A (SAA)。然后使用TCGA数据库评估这10个生物标志物，以确定该亚组是否也可以预测GBM患者的临床结局。 We found that the 10-protein prognostic index was significant across all cohorts (p=0.0001-0.012) even when stratified by age and MGMT status, (Figure 4). These data indicate that using only the 10-protein panel maintained the predictive power of the larger panel when using the TCGA dataset.

图1：TCGA中40个生物标志物的分析。
A) TCGA GBM基因表达数据的分级聚类显示中尺度诊断V-plex ELISA平台包含的40个生物标志物中的30个。亚型:C=经典型，M=间充质型，P=原神经型，N=神经型。
B)基于选定的30个生物标志物队列生成的预后指数的Kaplan-Meier图，显示了使用全队列和Verhaak等人[3]的差异。分类子类。多因素分析包括预后指标、年龄和MGMT状态。

图2：选择生物标志物表达值。
从中尺度诊断V-plex ELISA平台包含的40个生物标志物中随机选择4个生物标志物VEGFA、VEGFC、VEGFD和TIE2的血清表达。数值以pg/ml为单位，样品按累积顺序排列。

图3:40个生物标志物的共线性分析。
由ELISA平台测试的40个生物标志物的共线性矩阵。正相关和负相关分别显示为蓝色或红色。较暗的蓝色和红色色调表示高可变的相连性，而较轻的阴影表示低的相连性。数据点（圆圈）的这些强度和大小与相关系数成比例。相关系数在（p≤0.05）中称为显着，曲线仅用具有显着的值。

图4:TCGA中10个生物标志物队列分析
A)显示方法中选择的10个生物标志物层次聚类的热图，以功能相关性为代表。亚型:C=经典型，M=间充质型，P=原神经型，N=神经型。
B)基于10个生物标志物生成的预后指数的Kaplan-Meier图显示了整个队列，并由Verhaak等人的[3]亚类进行了分离。多因素分析包括预后指标、年龄和MGMT状态。

接下来，我们用我们的30个临床样本测试了10个蛋白小组预测总体生存率的能力。如图5A所示，VCAM1、IL8、IL16与总生存率呈正相关，但均无统计学意义。然而，如图5B所示，当使用由所有10个蛋白质衍生的预后指标时，中位数将该组分为两个队列，其生存期虽然没有统计学差异。寿命较长的队列值低于中位数，提示炎症/血管生成性肿瘤较轻。除年龄和MGMT状态外，如前所述，预测临床结果的第三个临床特征是肿瘤切除量。在我们的30例患者队列中，15例患者进行了全切除术(GTR)， 14例患者进行了次全切除术(STR)， 1例进行了活检，没有进一步研究。如图5C所示，在有GTR的患者中，预后指数将患者分为两组，生存率差异有统计学意义。PI低于中位数的患者存活时间最长。这在有STR的患者中没有复制(图5D)。这些数据表明一组血清蛋白可能有助于预测未来的临床结果。 This would need to be confirmed in a larger clinical cohort.

图5:10个蛋白生物标志物队列预后指标的验证。
A)使用当前研究GBM队列估计10个生物标志物的Cox比例风险。该图显示了包括置信区间和p值在内的风险比。使用10个GBM患者预后指标的Kaplan- Meier图按B)总生存期，另外按切除状态C)全肿瘤切除(GTR)和D)次全切除(STR)分组。

讨论与结论

由于胶质母细胞瘤诊断的临床结果普遍较差，通过个性化药物最大化治疗效果的努力集中在开发具有临床潜力的生物标志物标志物检测。利用TCGA数据库识别与生存相关的转录组标记和能够区分快速进展和缓慢进展GBM的基因组标记，已经确定了开发新的预后分析的有前景的方法[20,21]。最近的一项研究也使用TCGA数据库将共识基因标记与药物一致性联系起来，以识别新的临床前药物，这些药物可能对GBM治疗更有效[22]。在目前的研究中，10个血清可溶性蛋白生物标志物被发现可以预测TCGA队列中的临床结果，并与接受大肿瘤切除术、接受常规放疗和同时接受TMZ治疗并加入VPA的患者的总生存期相关。未来的研究应该扩展这些发现，以检验我们的10个蛋白生物标志物组是否能预测GBM患者在没有同时给VPA的情况下接受大肿瘤切除和常规RT和TMZ治疗的总生存期。

需要循环生物标记物来改善GBM的诊断和临床评估。目前还没有这样的诊断方法，尽管最近有临床试验旨在解决这一混淆[23]。虽然新出现的GBM预后分子标志物已经被确定，但它们主要依赖于对原发肿瘤[6]的组织活检。血液中分泌的蛋白质组生物标志物的开发由于易于取样而比组织来源的基因组和转录组生物标志物具有优势。目前的研究证明了这种方法的实用性，使用的是一种商业可用的多重ELISA检测。最近的其他研究也集中于开发具有潜在诊断、预后或预测价值的GBM循环生物标志物[8]。

生物标志物也可能在治疗后的环境中发挥重要作用。放疗和全身治疗可能导致假性进展或放射性坏死，很难与肿瘤生长区分。目前没有影像学检查能准确鉴别这些实体，组织学诊断仍是金标准。然而，由于肿瘤的位置或功能状态，不可能对所有患者进行再次切除。在符合条件的患者中，再次切除可能导致显著的发病率，由于取样误差可能提供不确定的结果，在许多情况下证明是不必要的。无需侵入性手术就能证明肿瘤复发的生物标记物将提高患者选择手术的能力，从而对难以接近的肿瘤进行更准确的诊断，并限制接受不必要手术的患者数量。我们的研究表明，未来基于蛋白质组学生物标志物的检测对GBM肿瘤的临床评估具有积极影响。

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条信息

文章类型:研究文章

引用:Sproull M, Mathen P, Miller CA, Mackey M, Cooley T，等(2019)预测胶质母细胞瘤患者生存的血清蛋白质组学特征。J Biochem analysis Stud 4(1): dx.doi.org/10.16966/2576-5833.117

版权:©2019 Sproull M，等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

收到日期:2019年10月01

接受日期:2019年10月22日,

发表日期:2019年10月26日,