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研究文章
线性和化学交联透明质酸的表征，使用各种分析技术，包括FTIR, ESI-MS, H1 NMR，和SEM

穆罕默德Al-Sibani1*艾哈迈德·哈拉西2.Reinhard HH Neubert3.

1.尼兹瓦大学科学和艺术学院，生物科学和化学系，Birkat Al-Mouz，阿曼苏丹国尼兹瓦
 2.尼兹瓦大学自然与医学科学研究中心，Birkat Al Mouz，尼兹瓦，阿曼苏丹国
 3.Martin-Luther大学Halle-Wittenberg，Weinbergweg，德国哈雷的应用DermaTopharcacy研究所

*通讯作者：Mohammed Al Sibani，科学与艺术学院，尼兹瓦大学生物科学与化学系，Birkat Al Mouz，尼兹瓦616，苏丹阿曼电邮：sibanimm@unizwa.edu.om.om.

抽象的

导言：透明质酸（HA）是一种高分子量聚合物，在化妆品和人体医学中有许多应用。近年来，对HA的需求不断增加，它有两种形式：线性和化学交联。交联HA在注入人体后比线性HA更耐用。对这两种形式的HA的特征进行了描述成为一件非常重要的事情。

目标：这项工作的目的是通过使用各种分析技术生成有关其结构组成、相似性和差异的数据来表征线性和交联HA。

方法：采用文献报道的方法，以1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)修饰透明质酸线性溶液和交联透明质酸支架。采用FTIR、ESI-MS、NMR和SEM对两种配方进行了表征。

结果：从所有技术获得的数据显示出不同的特性和化学结构。例如，交联的BDDE-HA出现在约3343厘米的峰值强度下降得多-1在FTIR中，与线性HA相比，ESI-MS中的质量荷电比（m/z）更高，NMR中1.5 ppm处有一个额外的独特峰，SEM中有更多的孔隙率结构。

结论:线性和交联型HA的基体结构有不同的特点。这些发现是通过应用四种不同的分析技术确定和证实的。

关键词

透明质酸；交联；化学交联剂；酶降解

缩写

HA-Hyaluronic酸;较大影响BDDE-1,缩水甘油醚;BTH-Bovine睾丸透明质酸酶


介绍

透明质酸（HA）也称为透明质酸（图1），是一种高分子量的天然生物可降解聚合物。HA是一种线性（未分支）非硫酸化糖胺聚糖（GAG）。它由N-乙酰-DG-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸的重复双糖单元组成，通过交替糖苷键β-（1,4）和β-（1,3）进行化学连接[1-3]。

图1：HA中双糖重复单元的结构。

HA广泛分布于人体各处，是细胞外基质ECM中的一种主要元素[4-6]。它存在于几乎所有的生物液体中，包括滑液和眼玻璃体液[7]。大量的HA存在于皮肤中，约占体内总含量的50%以上[8]。1942年，Endre Balazes是第一个将HA用于商业目的，作为面包制品中蛋清的替代品的人[9]。在过去二十年中，HA已成为现代医学中一种非常重要的材料，并被广泛应用于组织工程和美容外科[10,11]。然而，大多数应用并未使用天然或线性HA解决，因为线性HA由于其自身的特性而不会在人体内长期存在体内快速降解和较差的机械性能[10,12,13]。

线性透明质酸在皮肤中的半衰期约为12小时，并被干草醛酸酶[14]迅速分解。因此，线性HA应通过交联的方法稳定，以确保进入体内后在软组织内停留的时间更长。HA交联是指HA链通过HA官能团之一(-OH， -COOH， -NHCOCH3)与化学交联剂进行化学结合的过程。化学交联靶向(-OH)是HA填料工业中常用的方法，因为它保留了HA的聚阴离子性质[15-18]。许多化学交联剂已被用于HA的交联，然而，1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)是最常见的交联剂，因为环氧基团优先与HA的羟基反应，形成醚键[19]。HA化学交联的结果是一个三维网络，可以将水保留在它的交联网络更长的时间，但它不溶于水。与线性透明质酸相比，交联透明质酸在化妆品和医疗方面的应用范围更广，而线性透明质酸在药物和日常护肤品方面的应用较少。例如，交联HA在组织工程中得到了广泛应用，因为它提供了三维支架，允许营养物质和细胞废物通过它扩散[20]。事实上，化学交联的HAvs天然或线性HA更稳定，并表现出更高的抗酶降解能力。骨关节炎的治疗也是交联HA的一个主要生物医学应用，关节内滑液的粘弹性随着时间的推移而降低[21]。最近，交联HA参与了药物传递[22]。HA药物载体克服了其他聚合物载体的限制，这些聚合物载体不能生物降解或没有潜在的载药能力。在化妆品工业中，交联HA也被用作抗衰老产品。交联HA填料在矫正面部皱褶和产生更年轻的面部外观方面非常流行。它们在受影响的皮肤中大量增加组织，并在组织中保持肿胀更长时间[23]。

目前，市场上有各种商用交联HA填料，这些填料已获得美国食品和药物管理局（FDA）[24-26]的批准。常见的例子包括Q-Med公司的Restylane、Perlane（瑞典乌普萨拉）；Corbonal公司的Juvederm和Surgiderm（法国普林吉）。特别注意证明HA基产品中存在化学交联，尤其是用于皮肤治疗和增强的产品。事实上，由于样品复杂性、结构相似性和缺乏方法，区分线性和交联HA是化学分析中的一个主要挑战。G一般来说，分析交联糖胺聚糖最常用的方法包括傅立叶变换红外光谱（FT-IR）和核磁共振光谱（NMR）。另一方面，一些分析分析方法，如溶胀率和溶胀率体外酶降解试验也可用来确定聚合物的改性。由于聚合物链与化学交联剂之间形成桥梁和分子间键，交联聚合物通常表现出较慢的降解速率和较低的溶胀率。

在之前的研究中，我们研究了混合方法对BDDE-HA水凝胶降解和溶胀行为[27]的影响。然而，在本研究中，我们旨在利用傅里叶变换红外(FT-IR)、电喷雾质谱(ESI-MS)、质子核磁共振(H1NMR)和扫描电子显微镜(SEM)对线性和交联HA进行表征。在反应中使用的交联剂是1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，因为它是HA医疗和化妆品中最常见的化学交联剂。交联过程是在强碱性条件下进行的，方法由Malson T et al.， Piron E et al.[28,29]描述。

材料和方法
材料

平均分子量1000000 Da的透明质酸粉末从Vivatis Pharma（德国汉堡）获得。化学交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）和酶牛睾丸透明质酸酶BTH粉末（3000 U/mg）从Sigma-Aldrich Co（美国密苏里州圣路易斯）购买.所有其他化学品均由内部准备。

交联BDDE-HA的制备

将200µl的BDDE加入到9.80 ml的0.25M NaOH中，制得交联试剂溶液。将1.20 g透明质酸HA粉加入混合物中，室温下搅拌60 min, pH调至13，使BDDE分子中的环氧环打开，并与HA链中的-OH形成醚键。当反应完成时，加入等量的0.1M HCl溶液中和混合物，直至pH约为7.0。然后将混合物在蒸馏水上透析3天，以去除游离的BDDE分子。然后用蒸馏水稀释得到的混合物，直到最终HA浓度变为20 mg/ml。最后用(Daihan Labtech冻干机LFD 5518型号，Daihan Labtech Co)冻干机对交联水凝胶进行冻干，8℃保存。还制备了天然或线性HA溶液(20 mg/ml)，冻干并储存，直到进行仪器表征。

傅里叶变换红外(FT-IR)分析

使用Bruker Tensor 37分析来自线性和交联的HA的等效部分;傅里叶变换红外光谱（FTIR）（Ettlingen，德国）。所有光谱均记录在4000到400厘米之间-1分辨率为4厘米-1使用OPUS软件对数据进行处理。

电喷雾电离质谱

从线性和交联HA中获得等效部分，并用500µl的10.0%（w/v）牛睾丸透明质酸酶BTH酶溶液（比活性3000 U/mg）消化在37°C下持续2小时。使用Centurion科学离心机以3000 rpm的速度将所得溶液离心3分钟，收集每个容器中的上清液，并在纯化水中以1:50的比例稀释。电喷雾电离质谱（ESI-MS）使用Quattro Premier XE质谱仪Q-MS（英国曼彻斯特沃特斯公司）进行测量。通过直接注入进行分析，实验条件设置如下：毛细管电压4.0 kV，con电压（采样锥的电离电压和将离子导入质量分析仪的电压）30 V，溶解温度150°C，源温度100°C。以负电离模式从m/z 200-1000获得光谱，扫描速度为每次扫描1s。

质子核磁共振波谱（H1NMR）

从线性和交联HA中获得等效部分，并用500µl的10.0%（w/v）牛睾丸透明质酸酶BTH酶溶液（比活性3000 U/mg）消化在37°C下持续2小时。使用Centurion科学离心机以3000 rpm的速度将所得溶液离心3分钟，收集每个容器中的上清液并重新冷冻。然后将两个样品溶解在氧化氘（D2.o）1H NMR分析。使用来自Bruker（瑞士苏黎世）的600 MHz 1H核磁共振光谱（NMR）进行分析。

扫描电子显微镜（SEM）

从冻干的线性和交联HA中提取等量部分，并在真空下使用离子溅射法涂覆铂。使用二次电子成像（SEI）模式，通过来自JEOL（日本东京）的扫描电子显微镜（SEM）对两个样品的表面结构进行成像。两幅图像都是在相似的条件和放大倍数下拍摄的。

可靠性

在许多情况下，单次分析通常足以用于定性测量。然而，为了更可靠，对每个分析仪器重复两次结构表征。

结果和讨论
红外光谱

FTIR是线性和交联HA常用的表征技术，因为它可以确定HA改性过程中形成的键的类型[30,31,1]。例如，用FTIR观察到[32]在交联HA中在2850 cm之间有一个额外的峰-1和2930厘米-1这证实了化学交联剂中烷基链的存在。另一方面，羧基的能带强度随着化学交联剂用量的增加而降低[1]。然而，[33]指出，除了1650 cm处的谱带外，线性和交联HA的光谱之间没有差异-1这可归因于钠离子交换成酸性形式。

在这项工作中，如图2a所示的线性HA的FTIR光谱和图2b所示的交联HA的FTIR光谱表明，两个样品显示出几乎相似的数据，并且没有明显的差异。然而，通过仔细观察2800厘米之间的区域-1和3000厘米-1，在左右2900厘米左右可以观察一点峰值-1在交联BDDE-HA中。在线性HA中未清楚观察到该峰，其代表化学交联剂中的C-H拉伸。第二个特征峰位于约3343 cm处-1在线性HA和交联BDDE-HA中观察到通常代表羟基的基团。但是，线性HA中的峰面积大于交联BDDE-HA中的峰面积，表明交联后的羟基数量变少。

图2：（a） 冻干线性HA样品的FTIR光谱（b）在25°C下获得的交联BDDE-HA在4000和400 cm之间的FTIR光谱-1.

这意味着HA链和BDDE分子之间可能发生化学修饰通过羟基形成新的相互连接的网络。理论上，在一个BDDE分子中，每单位HA有四个醇反应位点和两个环氧基团。环氧基团与羟基反应的相对优先性取决于反应条件。如我们所述，在碱性条件下，BDDE分子靶向线性HA中的活性羟基形成醚键。如果在两个相邻的HA链中的两个基团与BDDE环氧化物共价阻断，总羟基将减少。这解释了它们的出现比非修饰或线性HA的向下峰更小。

在1300厘米处有一个小峰-1在交联的BDDE-HA中出现，但在线性HA中没有出现，证实交联过程成功。这个峰可以归因于HA链和BDDE分子之间的另一个键的形成。事实上，当HA在高pH值(高于羟基的pKa值)下进行交联时，HA的羟基几乎发生去质子化。因此，BDDE的环氧基团优先与HA的羟基反应，形成稳定的醚键[1]。

最后，这三个特征峰可以区分线性和交联的BDDE-HA结构。

电喷雾质谱

由于透明质酸降解产生的较大低聚糖具有粘弹性和复杂混合物，因此ESI-MS在HA低聚糖中的应用仍然具有挑战性[11]。由[34]进行的一项研究使用ESI离子阱质谱仪指出，在ESI条件下，HA分子是多电荷的，光谱更难解释。此外，ESI串联质谱使用负电离模式，显示一个分子N-乙酰氨基葡萄糖损失为[M-H-H]2.O] 对于偶数寡聚物，m/z=202，而奇数寡聚物以[m-H-H]形式拆分葡萄糖醛酸2.O), m / z = 175。

在这项工作中，线性HA和交联的BDDE-HA显示各种寡糖碎片图案，其不同的相对强度和链长范围从透明质酸（M / Z 378）的基本单元到大于16-16位。交联BDDE-HA的寡糖表现出与线性HA不同的映射光谱和不同的电荷状态分布曲线。基于图3A中显示的数据，在较低的M / Z范围或低于M / Z 400的下方观察到大多数线性HA离子（除了在较高的m / z范围内观察到的峰值）并且具有比较大的峰值强度在交联BDDE-HA的对应光谱中观察到的那些。

图3：（a） 线性HA样品的ESI-MS曲线（b）通过4.0 kV毛细管电压和30 v con电压直接注入获得的交联HA-BDDE的ESI-MS光谱。

交联BDDE-HA的离子(图3b)在m/z 400后变得更加丰富，这是由于交联BDDE-HA的降解速度较慢，比线性HA具有更高的抗酶解性。例如，相对于线性HA，交联样品中m/z 396、m/z 192.8和m/z 201.89处的峰强度很低。

为了进行更详细的比较，图4a、4b分别显示了线性HA和交联BDDE-HA从m/z 200到m/z 300的扩展m/z分布，而图5a、5b显示了相同样品从m/z 300到m/z 400的扩展m/z分布。m/z 396处的峰值代表了透明质酸的基本双糖单位和水分子ecule（[GlcUA-GlcNAc]+H2.O） 。此外，m/z 192.8和m/z 201.89处的峰也归因于葡萄糖酸（GlcA+H2.O)和n -乙酰- d -葡萄糖胺(GlcNAc-H2.O） 分别。

图4:（a）从M / z 200到M / z 300（b）的线性HA的扩展M / Z分布从M / Z 200到M / Z 300的交联HA-BDDE的扩展M / Z分布。

图5：(a)线状HA从m/z 300延伸到m/z 400; (b)交联HA- bdde从m/z 300延伸到m/z 400。

尽管酶切割N-乙酰基 - 乙酰甘氨酸胺（GLCNAC）和葡糖醛酸（GLCA）之间的1,4-键（GLCA），但在不含中的末端和不饱和尿酸（ΔUA）处的N-乙酰基-D-葡糖胺在不饱和尿酸（Δua）处产生差异化的低聚物。终端（偶数寡糖）和在两侧（奇数寡糖）的核酸Ua的有时片段（奇数寡糖），由于碎裂和碰撞激活，难以识别我们的方法中的高分子量离子 - 难以识别通常在ESI-MS分析期间经历。

此外，我们观察到高分子量离子受到方法条件和质谱参数的大大影响。例如，锥形电压或溶解温度的任何变化产生不同的碎片模式。相反，易于定义低分子量离子，并且它们与HA降解产物的理论离子物种吻合良好。

核磁共振

尽管在H1.核磁共振分析具有挑战性，特别是当考虑粘性聚合物[1]时，核磁共振被证明是表征线性和化学交联HA的一种强有力的技术。La Gatta A等人[35]之前进行的一项研究报告称，由于存在（CH2.)2.BDDGE分子的部分。Wende FJ等人几乎收购了类似的数据。[36]使用h1.核磁共振。交联BDDE-HA有两个主峰:n -乙酰信号(CH3.）从HA左右约2.1 ppm和（Ch2.)约1.7 ppm的BDDE部分。图6显示了典型的1.H NMR光谱比较线性HA和交联的BDDE-HA水凝胶，由Guarise等。[37]。

图6：H1.线性HA（较低）和BDD-HA（较高）的NMR光谱[37]。

根据目前的工作，如图7a所示的线性HA的NMR光谱和图7b所示的交联HA的NMR光谱，有两个主要特征峰：在两个样品中出现的约1.9 ppm的峰1和仅在交联BDDE-HA中出现的约1.5 ppm的峰2。峰1主要归因于在HA主链结构中发现的乙酰氨基葡萄糖N-CH3基团的存在。峰2代表-CH2.)基团，见于BDDE分子中。这些发现明确地证实了交联的BDDE-HA具有不同于线性HA的NMR谱，并证明了BDDE-HA中的HA链与交联剂发生了化学反应。

图7：（a）1.线性HA样品的H NMR谱（b）交联BDDE-HA样品的1HNMR谱。

在交联的HA多糖的NMR分析中，整合 - （CH2.)对于乙酰氨基葡萄糖N-CH3含量为1.9 ppm的1.5 ppm组，通常用于估计线性HA中发生的化学修饰的总程度[8,29]2.)BDDE中的基团具有不与线性HA的峰重叠的优点，从而易于评估HA链中化学修饰的总程度。

扫描电镜

大多数以前的SEM研究表明线性HA具有纤维状和不规则结构，而交联HA具有高度多孔和片状表面结构[1]交联程度也在很大程度上影响交联BDDE-HA的形态结构和互连程度，其孔径从几微米到大约100μm不等[38]。

SEM数据说明了线性HA和交联BDDE-HA的不同微浇注结构。交联BDDE-HA的微孔隙结构（图7b）比线性HA的微孔隙结构（图7a）更均匀，显示出更好的均匀性。与线性HA基质相比，线性HA基质显示出非常大且开放的孔隙，因此e交联BDDE-HA的孔径非常小，且孔径分布窄，范围从小于1µm到约10µm。事实上，交联BDDE-HA的均质性与窄孔径分布相结合的特性在生物医学研究中具有巨大的前景和兴趣，尤其是在组织工程和药物释放方面里。

虽然SEM图像未证明交联BDDE-HA中存在化学键通过然而，在FTIR，ESI-MS和NMR中结论的独特峰，然而，在整个BDDE-HA表面微结构中观察到的刚性和内聚基质相比，与在线性HA中观察到的非常弱的支架进行了验证了这一结论。这表明HA链和BDDE之间的化学反应对化学反应的影响非常显着，并产生明显且良好的互联的支架，其表现出比线性HA的酶促降解较高的抗性（图8A，8B）。

图8：（a） 线性HA样品的SEM图像（b）在相同放大条件下（x1000、SEI和10kv）获得的交联BDDE-HA样品的SEM图像。

结论

本研究的目的是利用FTIR、ESI-MS、H1.核磁共振和扫描电镜。FTIR光谱显示在2900厘米左右有一个额外的小峰-1在交联BDDE-HA中。同时，羟基的峰强度约为3343厘米-1在天然HA中，交联BDDEHA的含量远远低于其对应物。通过检测线性和交联BDDE-HA的不同质谱图，ESI-MS分析更具特征性。与显示具有更高分子量离子的交联BDDE-HA相比，线性HA的分子离子在400 m/z以下更丰富s、 NMR是表征线性HA和交联BDDE-HA的有力技术。它在1.5 ppm处显示了线性HA中未显示的BDDE-HA的独特峰。从SEM获得的数据表明，交联BDDE-HA表面微观结构具有更小的孔径，并且比线性HA分布更规则。


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文章信息

物品类型：研究文章

引用：Al Sibani M，Al Harrasi A，Neubert RHH（2018）使用各种分析技术（包括FTIR、ESI-MS、H1 NMR和SEM）对线性和化学交联透明质酸进行表征。J Biochem Analyt Stud 3（1）：dx.doi.org/10.16966/2576-5833.115

版权：©2018 al - sibani M，等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

  • 收到日期：2018年8月20日

  • 接受日期：2018年10月30日

  • 出版日期：2018年11月6日