摘要

本研究从紫外光90突变株中纯化碱性蛋白酶，并对其动力学特性进行了研究枯草芽孢杆菌．采用硫酸铵沉淀、透析、离子交换层析和凝胶过滤层析四步纯化酶。在pH 8、温度50℃、接种量2.5 mL、发酵时间72 h、酶活95.89 U/mL的最优条件下，经4步纯化得到的蛋白酶为2.47倍，并通过研究pH、温度和底物浓度对纯化酶的影响进行表征。动力学研究表明K_米和V_马克斯纯化的蛋白酶(UV-90)分别为0.03064µM和69.76 U/mL，而天然蛋白酶分别为0.02669µM和56.73 U/mL。这些特性使其在生物技术和工业部门有潜在的用途。

关键字

碱性蛋白酶;枯草芽孢杆菌；净化;SDSPAGE;二乙基氨基乙基(DEAE)离子交换色谱法;描述

介绍

众所周知，微生物在工业化生产细胞内和细胞外酶的技术发展中发挥着至关重要的作用。为了获得最大的产品产量，选定的微生物在最佳条件下发酵，并可进一步用于生产产品，如酶，奶酪，面包，生物燃料和其他产品[1]。

生物系统中的大多数反应都需要酶，酶作为催化剂，对生命是必不可少的。芽孢杆菌是胞外蛋白酶的主要生产者，在工业规模发酵过程中经常使用枯草芽孢杆菌产生碱性蛋白酶。蛋白酶是微生物源产生的主要酶，其中只有少数推荐作为商业生产者[2]。

枯草芽孢杆菌主要存在于土壤中，也被称为枯草芽孢杆菌和草杆菌．它是一种杆状的生物，可以形成一个坚韧的、保护性的内孢子，可以承受极端的环境条件。芽孢杆菌属是专性好氧菌或兼性厌氧菌，包括游离菌和病原菌[3]。

在之前的研究中，我们进行了紫外辐照诱变，获得了一个高产蛋白酶的突变体枯草芽孢杆菌IBL-04。在筛选高产突变菌株后，采用响应面法(RSM)在CCD (Central Composite Design)下优化物理参数(接种量、培养时间、pH和温度)，以提高蛋白酶的产量。在最适pH为8、温度为50℃、接种量为2.5mL、发酵时间为72小时[4]条件下，可获得高产蛋白酶。

研究了影响碱性蛋白酶培养条件、产率和性能的因素，认为对碱性蛋白酶的纯化和表征具有重要意义。采用硫酸铵沉淀、透析、离子交换层析和凝胶过滤层析四步纯化酶。通过动力学研究，研究pH、温度和底物浓度对酶活性的影响，探讨影响酶活性的因素。本论文旨在从枯草芽孢杆菌中纯化碱性蛋白酶，并对其活性影响因素进行研究，以期揭示其潜在的工业应用价值。

材料和方法

工作的地方

实验和分析工作在Faisalabad农业大学生物化学系的工业生物技术实验室进行。本研究中使用的所有化学品均为分析级。这些化学品是通过当地代理商从美国sigma和英国Oxide购买的。

微生物

的菌株枯草芽孢杆菌获得自农业大学生物化学系工业生物技术实验室(IBL)和费萨拉巴德。枯草芽孢杆菌在37℃培养24 h, 4℃保存15 d，[5]。

蛋白酶的产生

用[6]进行蛋白酶生产。在CCD (Central Composite Design)条件下，采用响应面法(RSM)优化培养条件。在最适pH为8、温度为50℃、接种量为2.5mL、发酵时间为72小时[4]条件下，可获得高产蛋白酶。

蛋白酶活性测定

蛋白酶活性通过在37°C磷酸盐缓冲液(pH 7)中添加酪蛋白测定。在660 nm处用分光光度计测定酪蛋白的氧化情况。酶活性在U/mL中表达[7,4]。

公式:

\[单位/毫升，酶= frac{{mol\，酪氨酸\，等量\，释放\乘以总\，体积\，含量\，化验}}{{A \乘以B \乘以C}}]

用酶的量

B =检测所需时间(20min)

C =比色法用量(1ml)

纯化的酶

用硫酸铵沉淀法对粗酶进行沉淀。从BS-90突变体培养中获得的酶粗提物，8000 rpm离心10分钟。将无细胞上清液/滤液置于80%饱和状态。为了达到80%的饱和度，逐渐加入硫酸铵晶体。再次于4℃保存过夜，8000 rpm离心10 min。离心后弃上清。沉淀物溶解在pH为7[8]的50 mM磷酸盐缓冲液中。硫酸铵处理后，溶液与测定缓冲液进行多次透析，使硫酸铵完全盐析。用分光光度计测定透析前后蛋白酶活性及蛋白含量[8]。

离子交换色谱法:透析后，通过离子交换色谱进一步纯化蛋白酶，最终根据分子电荷分离蛋白质。在蒸馏水中加入deae -纤维素树脂，在95℃水浴中连续搅拌加热5小时，制备deae -纤维素(Diethyl amethyl cellulose)柱。然后将塔垂直排列，将准备好的浆液转移到塔内，静置塔过夜。然后用30 mL 0.5N NaOH溶液洗涤柱，再用30 mL 0.5N HCl溶液洗涤柱。1米L solution was then poured into the column with 50 mM phosphate buffer (pH 7). After washing the column was equilibrated with phosphate buffer with a pH of 7 and the adsorbed protein was eluted with a stepwise NaCl gradient prepared in 50 mM phosphate buffer (pH 7). 1 ml fractions were collected wherein eluted fractions were monitored at 280 nm. The peak with the highest protease activity was dialyzed against 50 mM phosphate buffer (pH 7).Protein concentration and protease activity was determined by routine assay methods [9].

凝胶过滤色谱法:凝胶过滤技术用于检测由于进入凝胶孔隙而导致的分子保留差异(与大小成反比)。采用[8]方法制备葡聚糖G-100色谱柱。将离子交换色谱后的两mL蛋白酶样品加载在Sephadex G-100柱上，进一步纯化至均匀性水平。收集pH为7的50 mM磷酸盐缓冲液和蛋白酶的洗脱部分，并在660 nm处用分光光度计监测吸光度。

蛋白酶的特性

通过研究pH、温度、底物浓度和k的测定对酶的动力学特性进行了表征_米和V_马克斯值使用Line Weaver-Burk图[8]。

pH值的影响:为了确定蛋白酶的最适pH，将反应混合物在pH 4.0-11.0的缓冲液中孵育15分钟。孵育后，用标准的分析方法进行酶分析。所用的缓冲液为:醋酸缓冲液，pH为4.0,5.0;甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH 9.0, 10.0和11.0。

温度的影响:蛋白酶在30°C -85°C的最适pH下孵育1小时，然后进行常规蛋白酶测定，确定蛋白酶活性的最适温度。

底物浓度变化的影响:在最适pH和温度条件下，利用不同浓度的酪蛋白研究了底物浓度对蛋白酶活性的影响，建立了1/S和1/Vo之间的线性曲线(倒数)_米和V_马克斯)测定[10]。

结果与讨论

酶的纯化

硫酸铵沉淀时，在粗提物中加入盐，在4°C下饱和80%，达到1.32倍的纯化。透析法纯化的蛋白酶为1.64倍。在用二甲基氨基乙基纤维素树脂(阴离子交换柱)制备的色谱柱上负载样品溶液。用20-30 mL磷酸缓冲液(pH 7)对色谱柱进行标定，负载2mL粗蛋白酶。随后用Sephadex-100进行凝胶色谱柱填充。DEAE分离的蛋白酶活性组分的纯化倍数为1.84倍，Sephadex柱层析的纯化倍数为2.47倍(表1)。

美国没有	净化步骤	样品体积(mL)	总酶活性(IU)	总蛋白质含量(mg)	比活性(U/ mg)	净化褶皱
1	粗酶	300	95.89	18.21	5.26	1
2	(NH4）2所以4降水	30.	93.76	13.43	6.98	1．32
3.	透析酶	29	87.23	10．1	8.63	1.64
4	deae纤维素	28	82.89	8.56	9.68	1.84
5	交联葡聚糖g - 100	15	76.73	5.89	13.02	2．47

表1:UV-90突变株产生的蛋白酶的纯化方案枯草芽孢杆菌IBL-04。

整体产量的巨大损失可能与蛋白酶在高酸性介质中的稳定性较低有关。因此，为了提高产量，未来可能在适当的pH值下研究色谱技术。因此，有必要强调的是，潜水员的报告中使用不同策略的纯化过程所获得的产量极不一致，它与每种粗酶和纯化酶[9]的特定性质有关。

蛋白酶的特性

pH值对蛋白酶的影响:使用前，蛋白酶在4-11的pH值范围内孵育。突变体蛋白酶的最适pH为8.0，而酶在低pH下活性较低，在碱性pH下活性较高。

从uv - 90碱性蛋白酶突变完全稳定在一个大碱性pH值范围(4)和提供了一个最佳活动78.73 U /毫升的pH值7而pH值的进一步增加到11显示活动的减少趋势(图1)。pH碱性蛋白酶的最适条件杆菌物种已报告不同4。我们的结果与[12]报道的蛋白酶在pH 7-13范围内具有活性，最适pH为10，最适活性为126 U/mL。

图1:pH值对天然蛋白酶活性的影响枯草芽孢杆菌IBL-04和UV-90突变体。

Johnvesly et al，(2002)[13]报道，最优蛋白酶活性由Thermoalkaliphilic杆菌sp．在pH为11的条件下观察到JB-99。因此，该酶在碱性条件下表现出稳定的活性。同样的，蛋白酶的性质芽孢杆菌sphaericus菌株C3-41在pH为11.0时表现出最适活性。该酶在ph5.0 ~ 12.0[14]范围内保持稳定。

温度对蛋白酶的影响:实验测定不同培养温度(30-85℃)对纯化的蛋白酶酶的影响。观察到突变的蛋白酶在70°C下是稳定的。而天然菌株蛋白酶活性最高的条件是在45°C。从实验得出的结论是，在高于70°C的温度下，酶开始迅速失去其活性(图2)。对于各种工业应用来说，相对较高的热稳定性是酶具有吸引力和理想的特性。

图2:不同温度对天然菌株和突变菌株蛋白酶活性的影响枯草芽孢杆菌IBL-04。

Haddar等人[15]报道，以酪蛋白为底物时，在25-60℃温度下观察到蛋白酶活性恒定且最高。天然碱性蛋白酶纯化的最适温度为45℃。大多数报道的蛋白酶在30-85°C[12]范围内表现出最大速率。在不同温度下测定了残余蛋白酶活性，在40-50°C时最大，尽管在80°C孵育30分钟[7]后仍观察到相当大的残余酶活性(50%)。同样，Johnvesly et al.[13]报道蛋白酶活性的最适温度为70ºCthermoalkaliphilic杆菌sp．jb - 99。

底物浓度对蛋白酶的影响:K_米和V_马克斯对于天然的和突变的纯化蛋白酶是通过改变(酪蛋白)底物的浓度来确定的。在标准测定条件下测定酶的活性，并将结果用于建立反相图。

蛋白酶活性的倒数图(1/V)与每个底物浓度的倒数(图3)_米和V_马克斯以酪蛋白为底物时，突变体纯化的蛋白酶分别为0.03064µM和69.76 U/mL。而K_米和V_马克斯为0.02969µM, 56.73 U/mL。反应速率和底物浓度之间的关系取决于酶对底物的亲和力，以K表示_米蛋白酶[16,17]。

图3:蛋白酶的线性weaver Burk倒数图测定天然和UV-90突变体的Km和Vmax值枯草芽孢杆菌．

Ahmed et al.[12]报道了催化性能，K_米和V_马克斯纯化的碱性蛋白酶的值枯草芽孢杆菌分别为58 μM和148 U/mL。低钾酶_米对底物有较大的亲和力。碱性蛋白酶具有很高的底物特异性，对酪蛋白作为底物表现出最大的活性。研究表明，该蛋白酶对酪蛋白为底物具有较高的水解活性，对牛血清白蛋白(BSA)和鸡蛋白蛋白([18])的水解活性较差或中等。根据Patel et al.[19]结果，K_米和V_马克斯蛋白酶的含量分别为0.153 g/100mL和454 U/mL。

结论

从目前的研究，得出结论，已鉴定的物种，枯草芽孢杆菌具有良好的蛋白酶活性。该研究还标准化了最大产酶细菌的生长参数，可有效用于蛋白酶的大规模商业化生产。紫外诱变蛋白酶的最适温度和pH分别为50℃和8.0℃。采用硫酸铵沉淀、透析、离子交换层析和凝胶过滤层析对蛋白酶进行纯化。由于在高温、pH值和高V下的稳定性，该耐热碱性蛋白酶将用于洗涤工业、食品工业和制药工业的各种用途_马克斯和底物特异性。

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条信息

文章类型:研究文章

引用:Iqbal M, Asgher M, Bashir F(2018)枯草芽孢杆菌UV-90突变体碱性蛋白酶的纯化和动力学研究。J Biochem Analyt Stud 3(1): dx.doi.org/10.16966/2576-5833.112

版权:©2018 Iqbal M，等。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可协议的条款下发布，该协议允许在任何媒体上无限制地使用、发布和复制，前提是注明原作者和来源。

出版的历史:

收到日期:2017年11月21日,

接受日期:2017年12月19日

发表日期:2018年1月04